□ 郭瑞軍 濮陽(yáng)市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心

□ 秦政 河南大學(xué)國(guó)際教育學(xué)院

1 引言

李斯特氏菌屬是革蘭氏陽(yáng)性桿菌，屬內(nèi)有兩個(gè)種具有致病性，即單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）和伊氏李斯特菌（L.ivanovii），前者致病性強(qiáng)，是重要的食源性致病菌之一，人體感染后的主要臨床表現(xiàn)有敗血癥、腦膜炎等。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌往往存在于肉制品和乳制品中，并能夠在低溫條件下繁殖，因其嚴(yán)重威脅人類健康，故我國(guó)食品中致病菌限量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定該菌不得檢出。

英諾克李斯特氏菌（L.innocua）雖無(wú)致病性，卻在食物中廣泛存在。通過(guò)查閱國(guó)內(nèi)相關(guān)論文研究來(lái)分析李斯特氏菌對(duì)我國(guó)食品的污染狀況，結(jié)果顯示在所有食物類型中，英諾克李斯特氏菌的檢出率最高，其次為單核細(xì)胞增生李斯特氏菌[1]。駱玲飛等[2]通過(guò)對(duì)320份食品進(jìn)行檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，英諾克李斯特氏菌的檢出率為7.19%，共計(jì)23株，占檢出李斯特氏菌總數(shù)的63.89%，這表明該菌會(huì)給食品安全帶來(lái)極大隱患。此外，由于英諾克李斯特氏菌與單核細(xì)胞增生李斯特氏菌較為相似，且不易區(qū)分，因此容易造成誤判[3-4]。本研究通過(guò)對(duì)河南省濮陽(yáng)市市售涼皮進(jìn)行檢驗(yàn)，分離出一株李斯特氏菌，利用單增李斯特氏菌生化鑒定條和VITEK 2 Compact進(jìn)行鑒定，以判定該菌是否為單核細(xì)胞增生李斯特氏菌，希望能夠?yàn)槔钏固厥暇臏?zhǔn)確鑒定提供參考依據(jù)。

表1 單增李斯特氏菌生化鑒定條結(jié)果

2 材料與方法

2.1 材料

河南省濮陽(yáng)市市售涼皮。

2.2 方法

按照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)》（GB 4789.30-2016）進(jìn)行檢驗(yàn)。樣品經(jīng)過(guò)兩次增菌（LB1、LB2）培養(yǎng)后，劃線接種于李斯特氏菌顯色平板和PALCAM瓊脂平板上，在36℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48h后，挑選典型菌落進(jìn)行木糖和鼠李糖生化試驗(yàn)，同時(shí)劃線接種到TSA-YE平板上。

在對(duì)木糖陰性、鼠李糖陽(yáng)性的菌落進(jìn)行革蘭氏染色、動(dòng)力試驗(yàn)和溶血試驗(yàn)的同時(shí)，利用單增李斯特氏菌生化鑒定條和VITEK 2 Compact進(jìn)行檢驗(yàn)。

3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 分離初篩

取LB2培養(yǎng)液接種到選擇性瓊脂平板上進(jìn)行培養(yǎng)觀察發(fā)現(xiàn)，李斯特氏菌顯色平板上出現(xiàn)藍(lán)綠色菌落，PALCAM瓊脂平板上出現(xiàn)灰綠色菌落。挑取選擇性瓊脂平板上的典型菌落劃線接種到TSA-YE平板上，同時(shí)接種到木糖和鼠李糖發(fā)酵管中進(jìn)行培養(yǎng)。結(jié)果顯示，木糖為陰性，鼠李糖為陽(yáng)性。

表2 VITEK 2 Compact生化鑒定結(jié)果

3.2 鏡檢和動(dòng)力試驗(yàn)

利用革蘭氏染色液試劑盒對(duì)TSA-YE平板上的菌落進(jìn)行染色，顯微鏡下觀察菌株為革蘭氏陽(yáng)性短桿菌。用接種針挑取菌落穿刺接種到SIM生化管中，30℃培養(yǎng)48h后觀察發(fā)現(xiàn)，菌落沿穿刺線呈傘狀生長(zhǎng)。

3.3 生化鑒定結(jié)果

利用單增李斯特氏菌生化鑒定條對(duì)TSA-YE平板上的可疑菌落進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，僅木糖和甘露醇兩項(xiàng)生化試驗(yàn)結(jié)果為陰性，過(guò)氧化氫酶、葡萄糖和麥芽糖等生化試驗(yàn)結(jié)果均為陽(yáng)性（見(jiàn)表1），由此判定該菌株為單核細(xì)胞增生李斯特氏菌或英諾克李斯特氏菌。

3.4 溶血試驗(yàn)

將純化培養(yǎng)后的可疑菌落劃線接種到血瓊脂平板上，36℃培養(yǎng)48h后于明亮處觀察，發(fā)現(xiàn)菌落周圍無(wú)溶血圈，由此判定該菌株為英諾克李斯特氏菌。

3.5 VITEK 2 Compact鑒定結(jié)果

挑取TSA-YE平板上的可疑菌落劃線接種到含5%羊血的胰酶大豆瓊脂（TSAB）上，36℃培養(yǎng)18～24h后制成0.5～0.63McF的菌懸液并上機(jī)檢驗(yàn)，8h后給出分析報(bào)告。結(jié)果顯示，D-木糖（dXYL）和D-甘露醇（dMAN）等26項(xiàng)生化試驗(yàn)結(jié)果為陰性，D-麥芽糖（dMAL）等17項(xiàng)生化試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性（見(jiàn)表2），無(wú)不吻合的典型生化譜，故結(jié)果判定為英諾克李斯特氏菌（概率為99%），為極好的鑒定。

4 討論

常規(guī)檢驗(yàn)過(guò)程中，溶血試驗(yàn)是區(qū)分單核細(xì)胞增生李斯特氏菌和英諾克李斯特氏菌的關(guān)鍵。國(guó)標(biāo)方法指出，溶血試驗(yàn)中的菌落接種分為刺種和劃線兩種方法。刺種過(guò)程中可以將血平板劃分成20～25個(gè)小格，每個(gè)小格接種一個(gè)可疑菌落，即讓多個(gè)菌落集中在同一個(gè)平板上，便于對(duì)比觀察且節(jié)約成本。然而，該方法對(duì)檢驗(yàn)人員的操作要求較高—穿刺時(shí)要盡量接近血平板底部而又不能刺破，否則會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果。劃線接種方法方便快捷，適合少量樣品的檢驗(yàn)，但劃線過(guò)程需按標(biāo)準(zhǔn)操作，避免菌落連成一片，進(jìn)而影響結(jié)果判定。

VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)具有自動(dòng)化程度高、速度快、準(zhǔn)確性好等特點(diǎn)，在食品安全檢驗(yàn)中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。同時(shí)，該系統(tǒng)對(duì)上機(jī)檢驗(yàn)的樣品要求較高—對(duì)菌液的純度、濃度和培養(yǎng)時(shí)間等有著嚴(yán)格要求。通過(guò)比對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌和英諾克李斯特氏菌的43項(xiàng)生化鑒定結(jié)果，發(fā)現(xiàn)兩種菌存在PIPLC、LeuA和LAC這3項(xiàng)生化試驗(yàn)結(jié)果不同[5]。有研究指出，VITEK 2 Compact不能有效區(qū)分單核細(xì)胞增生李斯特氏菌和英諾克李斯特氏菌[4-6]，而李苗苗[7]的研究結(jié)果與該結(jié)論不同，且本研究已利用VITEK 2 Compact準(zhǔn)確鑒定出可疑菌落為英諾克李斯特氏菌。由于VITEK 2 Compact偶爾不能有效區(qū)分單核細(xì)胞增生李斯特氏菌和英諾克李斯特氏菌，因此在實(shí)驗(yàn)室條件允許的情況下，建議采用多種方法綜合判定，確保準(zhǔn)確鑒定李斯特氏菌。