郭玉煒，季志強(qiáng)，張亞莉

（1.承德市農(nóng)林科學(xué)院，河北承德 067000；2.廊坊職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河北廊坊 065000）

砷（arsenic），元素符號 As，是變價元素，是全球公認(rèn)的最重要的環(huán)境毒物之一，具有顯著的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)[1]，能在植物、動物體內(nèi)富集，并最終通過食物鏈危害人體健康[2-4]。自然界中砷可以以0價（As），-3 價（如 AsH3），+3 價（如砒霜 As2O3）和 +5價（Na3AsO4）存在。一般在土壤環(huán)境中多以+3和+5價存在。As（III）是毒性很強(qiáng)的原生質(zhì)毒物，毒性強(qiáng)于As（V），被美國疾病控制中心（CDC）和國際防癌研究機(jī)構(gòu)（IARC）確定為第一類致癌物[5-7]。因其特殊的類金屬性和韌性[8]，砷主要用于與銅、鉛及其他金屬形成合金。此外，砷的化合物還廣泛用于制造防腐劑、染料、農(nóng)藥和醫(yī)藥等[9]。地殼中砷的含量為1.5～2.0 mg/kg，是其他元素的21倍。土壤中砷的本底值在0.2～40 mg/kg，而受砷污染土壤的含砷量在550 mg/kg。目前在環(huán)境介質(zhì)中，全世界已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大約40多種不同形態(tài)的砷。其中，無機(jī)砷包括亞砷酸（鹽）（As（III））和砷酸（鹽）（As（V））；有機(jī)砷有單甲基砷酸（鹽）（MMA（V））和二甲基砷酸（鹽）（DMA（III））[10]。無機(jī)砷的毒性明顯高于有機(jī)砷，即其毒性順序?yàn)椋篈s（III）＞As（V）＞MMA（V）＞DMA（III）。

隨著社會經(jīng)濟(jì)和工業(yè)的發(fā)展，全球許多國家面臨嚴(yán)重的砷污染威脅。砷污染已成為人們普遍關(guān)注的環(huán)境污染問題之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在美國國家環(huán)保局超級基金計(jì)劃的污染場地中，有41%的污染場地存在砷污染問題[11]。在澳大利亞，共有超過10 000多個土壤砷污染場地[12]。在印巴次大陸的孟加拉國，以含砷地下水澆灌的水稻田中土壤平均砷含量高達(dá)101 mg/kg，是國際標(biāo)準(zhǔn)的4倍[13]。我國也是受砷污染最為嚴(yán)重的國家之一，新疆、內(nèi)蒙古、陜西、湖南、云南、貴州、廣西、廣東、臺灣等省區(qū)的砷污染均比較嚴(yán)重。環(huán)境中的砷污染導(dǎo)致作物產(chǎn)量降低及質(zhì)量和品質(zhì)下降，直接威脅到人畜健康[9]。在一些污染土壤中，砷濃度可能超過2 000 mg/kg[14]。植物和動物體內(nèi)積累的砷最終會通過食物鏈傳遞到人體內(nèi)，對人類的身體健康構(gòu)成威脅，因此，在一些國家，還規(guī)定牲畜飼料中砷的含量不能高于0.2 mg/kg[15]。因而，如何有效地控制及治理土壤重金屬的污染，改良土壤質(zhì)量，將成為生態(tài)環(huán)境保護(hù)工作中十分重要的一項(xiàng)內(nèi)容[16]。

砷污染土壤和水體的修復(fù)一直受到眾多研究者的關(guān)注。目前，傳統(tǒng)的物理修復(fù)和化學(xué)修復(fù)技術(shù)已取得一定成效，并形成了部分成熟的工藝流程。對于砷污染土壤的修復(fù)傳統(tǒng)方法主要采用固定技術(shù)。對水體則主要采用膜分離、離子交換、凝聚沉淀等化學(xué)方法去除砷[17]。這些方法工程量大、投資費(fèi)用高、同時還可能導(dǎo)致二次污染。目前，已經(jīng)有研究者開發(fā)了多種除砷材料和除砷技術(shù)，如改性蒙脫石、鐵鈰復(fù)合氧化物材料、蜈蚣草的離體葉片等等。然而，對于微生物的代謝作用對砷的總量和各個砷形態(tài)濃度的影響卻鮮見報道。

微生物修復(fù)是利用微生物，如細(xì)菌、真菌、放線菌和原生動物的生命代謝活動富集、分解或清除生長介質(zhì)中的污染物。近年來，微生物修復(fù)技術(shù)因其環(huán)境友好型和低投入等優(yōu)點(diǎn)得到迅速發(fā)展。大量高效降解菌株被篩選和研究，這給利用生物修復(fù)技術(shù)進(jìn)行污染修復(fù)帶來了活力與希望[18]。微生物是自然界中形體微小、單細(xì)胞或個體結(jié)構(gòu)簡單的多細(xì)胞，甚至無細(xì)胞結(jié)構(gòu)的低等生物的通稱。作為土壤中重要的活性膠體組分，微生物數(shù)量眾多，比表面積大，帶電荷多，且代謝旺盛。同時，土壤中的微生物與重金屬（砷）間存在吸收和富集、溶解和沉淀、氧化和還原等作用的動態(tài)平衡。這對重金屬包括砷的化學(xué)行為和生物有效性都會產(chǎn)生深刻的影響。目前對真菌的可利用性及其對溶液中砷行為影響的研究非常薄弱，對于真菌對轉(zhuǎn)化砷形態(tài)以及降低土壤中的砷毒性的研究更是少之又少。微生物修復(fù)是生物修復(fù)技術(shù)的核心技術(shù)，在污染物治理，尤其是有機(jī)污染物的降解轉(zhuǎn)化及水體污染修復(fù)方面展現(xiàn)了廣闊的前景。雖然生物修復(fù)作為環(huán)境友好型的治理技術(shù)深得人心，但它本身也存在還未克服的問題。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和人類環(huán)保意識的提高，對環(huán)境污染認(rèn)識的深入讓人們對污染修復(fù)也提出了更高的要求。

本試驗(yàn)以外源真菌草酸青霉加入砷污染土壤中對砷形態(tài)轉(zhuǎn)化為對象，探討并比較了在滅菌和不滅菌2種條件下草酸青霉對砷形態(tài)轉(zhuǎn)化的效果，為研究特定外源真菌在解決實(shí)際土壤砷污染問題的可行性方面提供理論依據(jù)，并為修復(fù)土壤砷污染提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料和方法

1.1 材料

供試真菌為草酸青霉，它是一種能夠分解纖維素的真菌；供試土壤采自河北省某一污灌水稻種植區(qū)，土壤的基本理化性質(zhì)：pH值（H2O浸提，水土比為2.5∶1）7.72，有機(jī)質(zhì)含量 9.82 g/kg，總鐵 26.94 g/kg，堿解氮49.85 mg/kg，速效磷12.85 mg/kg，總砷含量83.4 mg/kg。

1.2 儀器與用具

生化培養(yǎng)箱（培養(yǎng)溫度27℃，遮光培養(yǎng)）、燒杯（50，100，200，400，1 000 mL）、容量瓶（50，100，200，400，1 000 mL）、塑料杯、土壤溶液提取器、注射器、離心管、分光光度計(jì)、原子熒光儀。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)共設(shè)4個處理，分別為：（1）滅菌加菌種（滅菌＋菌種），將培養(yǎng)缽中的含砷污染土用高溫高壓（0.15 MPa，121℃）滅菌，并將滅菌后的土壤冷卻至室溫，在實(shí)驗(yàn)室無菌的超凈工作臺中接種草酸青霉。（2）滅菌不加菌種（滅菌－菌種），將培養(yǎng)缽中的含砷污染土用高溫高壓（0.15 MPa，121℃）滅菌，直接冷卻至室溫不加菌種。（3）不滅菌加菌種（不滅菌＋菌種），將培養(yǎng)缽中的含砷污染土在無菌條件下接種草酸青霉。（4）不滅菌不加菌種（不滅菌－菌種），將培養(yǎng)缽中的含砷污染土不做任何處理，放置待用。每個處理設(shè)置3個重復(fù)，共12個培養(yǎng)缽。

1.4 菌懸液的制備

配制200 mL液體培養(yǎng)基，取100只250 mL三角瓶進(jìn)行滅菌，另取20只50 mL三角瓶進(jìn)行滅菌。將菌種接種到上述滅菌后的50 mL三角瓶中，在搖床（30℃，108 r/min）振蕩 1 d，取 5 mL培養(yǎng)基加入到上述250 mL三角瓶中，搖床（30℃，108 r/min）振蕩3 d，完成菌懸液的制備。每200 g土加入0.6 mL該真菌菌懸液。

用錫箔紙將放好土壤的塑料杯蓋好，分別標(biāo)記滅菌加菌種、滅菌不加菌種、不滅菌加菌種、不滅菌不加菌種，重復(fù)處理按1，2，3進(jìn)行標(biāo)記。把標(biāo)記好的杯子按順序放入無菌的超凈工作臺中，把需要滅菌處理的取下錫箔紙，用接種棒進(jìn)行接種。接種過程中要保證操作者和實(shí)驗(yàn)臺都是無菌的。

1.5 試驗(yàn)方法

用蒸餾水洗凈塑料杯，并用現(xiàn)制的超純水再次清洗后自然晾干。每個杯子稱取200 g土樣，將稱好的土樣分別裝于12個杯中。

按1.4的步驟進(jìn)行滅菌和添加草酸青霉處理。澆超純水使杯子中的土保持淹水狀態(tài)，每個杯子的水液面高度保持一致，放入培養(yǎng)箱進(jìn)行避光培養(yǎng)。將培養(yǎng)箱的溫度設(shè)置為27℃。每個杯子埋入土壤溶液提取器，保證插入相同的深度（提取器白色部分要完全埋入土中）。

取樣時，用10 mL注射器抽取土壤溶液，過孔徑0.45 μm濾膜，注入10 mL離心管中，每個離心管加入50μL6mol/L優(yōu)級純鹽酸，搖勻后放入-4℃冰箱冷藏待測。每月抽一次土壤溶液，記錄開始培養(yǎng)的時間和每次取樣時間。

1.6 測定方法

采用高效液相色譜與電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用法（HPLC-ICP-MS）進(jìn)行砷形態(tài)的測定，具體測定條件參數(shù)如下。

1.6.1 高效液相色譜HPLC 流動相為0.01 mol/L（NH4）2HPO4，0.01 mol/LNH4NO3，pH 值 6.2；流速為1 mL/min；進(jìn)樣體積為 20 μL。

1.6.2 電感耦合等離子體質(zhì)譜儀ICP-MS 等離子功率為1 500 W；載氣流量為0.9 L/min；補(bǔ)償氣流量為0.25L/min；進(jìn)樣深度為8mm；蠕動泵速為0.1rps；預(yù)混室（霧化室）溫度為2℃。

1.7 數(shù)據(jù)分析

使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 11.5和Excel對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析以及多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤溶液中存在的砷形態(tài)

從圖1可以看出，As（Ⅲ），DMA，MMA和As（Ⅴ）的出峰時間分別是160.157，211.160，267.262，459.541 s。土壤溶液中砷形態(tài)的一個峰如圖2所示，由此可確定，土壤溶液中存在 As（III），As（V），DMA等3種砷形態(tài)，并未檢測到MMA。

2.2 草酸青霉對滅菌/不滅菌土壤中不同砷形態(tài)質(zhì)量濃度的影響

從圖3可以看出，在滅菌的2種處理下，As（Ⅲ），As（Ⅴ）和DMA均可以被檢測到，并且As（Ⅲ）為主要形態(tài)；不滅菌的2種處理下，均檢測不到DMA，只能檢測到 As（Ⅲ），As（Ⅴ），并且 As（Ⅴ）為主要形態(tài)。本研究從以下幾方面對各個砷形態(tài)的濃度變化分別進(jìn)行分析。

2.2.1 草酸青霉對滅菌/不滅菌土壤中As（Ⅲ）質(zhì)量濃度的影響 由圖4可知，不論土壤中是否加菌種，滅菌處理下土壤溶液中As（Ⅲ）質(zhì)量濃度高于不滅菌處理下As（Ⅲ）質(zhì)量濃度，其質(zhì)量濃度從高到低排序?yàn)闇缇?菌種（210.7 ng/mL）＞滅菌-菌種（198.1 ng/mL）＞不滅菌＋菌種（5.3 ng/mL）＞不滅菌-菌種（2.2 ng/mL）。這可能由于土壤溶液中后來存在某種微生物，能夠在淹水環(huán)境下參與砷的還原。在滅菌條件下，微生物的數(shù)量和種類相對于不滅菌條件下要少，因此，競爭作用要小。不滅菌處理下，土壤中由于微生物之間存在營養(yǎng)和其他方面的競爭，不利于該種微生物生存，砷主要以氧化態(tài)存在；而在滅菌土壤溶液中，其他微生物的競爭作用相對較小，該種微生物便可以參與土壤溶液中As（Ⅴ）的還原，導(dǎo)致滅菌處理土壤溶液中As（Ⅲ）質(zhì)量濃度高于不滅菌處理土壤溶液中As（Ⅲ）質(zhì)量濃度。還有可能是不滅菌處理?xiàng)l件下存在某種微生物可以參與砷的氧化，使As（Ⅲ）轉(zhuǎn)化為As（Ⅴ）。滅菌處理使土壤溶液中的該種微生物數(shù)量和種類減少，因此，氧化能力變?nèi)?，使滅菌處理下的As（Ⅲ）質(zhì)量濃度高于不滅菌條件下的As（Ⅲ）質(zhì)量濃度。

在滅菌處理的土壤溶液中，加菌種的As（Ⅲ）質(zhì)量濃度略高于不加菌種條件下的As（Ⅲ）質(zhì)量濃度，并且2個處理下As（Ⅲ）質(zhì)量濃度都很高。2個處理下的As（Ⅲ）質(zhì)量濃度很接近，說明在滅菌的條件下是否加入外源菌種草酸青霉對土壤溶液中的As（Ⅲ）質(zhì)量濃度影響很小。

在不滅菌處理的土壤溶液中，加菌種的As（Ⅲ）質(zhì)量濃度略高于不加菌種的條件下As（Ⅲ）質(zhì)量濃度，并且2個處理下的As（Ⅲ）質(zhì)量濃度都很低。2個處理下的As（Ⅲ）質(zhì)量濃度也很接近，說明在不滅菌的條件下，是否加入菌種對土壤溶液中As（Ⅲ）質(zhì)量濃度的影響很小。

2.2.2 草酸青霉對滅菌/不滅菌土壤中As（Ⅴ）質(zhì)量濃度的影響 從圖5可以看出，不論土壤中是否加菌種，滅菌處理下土壤溶液中As（Ⅴ）質(zhì)量濃度高于不滅菌處理下As（Ⅴ）質(zhì)量濃度，其質(zhì)量濃度從高到低排序?yàn)闇缇N（70.4 ng/mL）＞滅菌－菌種（49.5 ng/mL）＞不滅菌－菌種（42.5 ng/mL）＞不滅菌＋菌種（35.6ng/mL）。并且4種處理下As（Ⅴ）的質(zhì)量濃度差異相對于As（Ⅲ）質(zhì)量濃度的差異顯得很小。

在滅菌處理的土壤溶液中，加菌種的As（Ⅴ）質(zhì)量濃度高于不加菌種的土壤溶液中的As（Ⅴ）質(zhì)量濃度。并且由于在滅菌處理的土壤溶液中，加菌種的As（Ⅲ）質(zhì)量濃度同樣高于不加菌種的土壤溶液中的As（Ⅲ）質(zhì)量濃度。因此，可推測在滅菌的處理下，菌種的加入可能對于無機(jī)砷形態(tài)的土壤固定產(chǎn)生影響。

在不滅菌處理的土壤溶液中，加菌種的處理下As（Ⅴ）質(zhì)量濃度低于不加菌種的As（Ⅴ）質(zhì)量濃度。這可能是由于在不滅菌的土壤溶液中，草酸青霉的加入影響了無機(jī)砷形態(tài)的甲基化，使有機(jī)形態(tài)砷的質(zhì)量濃度升高；又有可能是在不滅菌處理下，菌種的加入促進(jìn)了上述具有砷還原能力的微生物的生長。不滅菌處理下，草酸青霉加入使該種微生物生長相對較好，將As（Ⅴ）還原為As（Ⅲ）。因此，在不滅菌的處理下，加菌種反而使土壤溶液中的As（Ⅴ）質(zhì)量濃度低于不加菌種時土壤溶液中的As（Ⅴ）質(zhì)量濃度。

2.2.3 草酸青霉對滅菌/不滅菌土壤中DMA質(zhì)量濃度的影響 從圖6可以看出，不論土壤中是否加菌種，滅菌處理下土壤溶液中DMA質(zhì)量濃度高于不滅菌處理下DMA質(zhì)量濃度，其質(zhì)量濃度從高到低排序?yàn)闇缇N（2.875 ng/mL）＞滅菌＋菌種（1.894 ng/mL）＞不滅菌－菌種（忽略不計(jì)）＞不滅菌+菌種（忽略不計(jì)）。這可能是由于在淹水條件下滅菌處理后的土壤中砷的生物甲基化作用強(qiáng)于不滅菌土壤中砷的生物甲基化作用。并且這種生物甲基化作用的微生物在滅菌條件下由于微生物之間競爭壓力小，因此，生存能力、代謝能力較強(qiáng)，使土壤溶液中的DMA質(zhì)量濃度較高，這也大大降低了土壤中砷的毒性。

在滅菌處理的土壤溶液中，不加菌種的DMA質(zhì)量濃度高于加菌種的土壤溶液中的DMA質(zhì)量濃度。這可能是由于在淹水條件下，滅菌處理時，不加菌種的土壤中砷的生物甲基化作用強(qiáng)于加菌種的土壤中的砷的生物甲基化作用。其可能是由于這種能將砷甲基化的微生物在加入草酸青霉時由于競爭作用的增加導(dǎo)致該種微生物數(shù)量減少，代謝作用降低，因此，施加菌種時土壤溶液中的DMA質(zhì)量濃度低于不加菌種的土壤溶液中的DMA質(zhì)量濃度。

在不滅菌的土壤溶液中，不加菌種的DMA質(zhì)量濃度和加菌種的土壤溶液中的DMA質(zhì)量濃度都很低，可以忽略不計(jì)。說明在不滅菌的處理下，土壤中砷的生物甲基化作用很弱。這可能是由于在不滅菌時，土壤中的微生物種類和數(shù)量相對滅菌條件下的多，導(dǎo)致微生物之間的競爭壓力過大，因此，具有砷的生物甲基化的微生物活性降低，使不滅菌的土壤溶液中，無論是否加入菌種，DMA質(zhì)量濃度都可以忽略不計(jì)。

2.3 草酸青霉對滅菌/不滅菌土壤中總砷質(zhì)量濃度的影響

由圖7可知，不論土壤中是否加菌種，滅菌處理下土壤溶液中的總砷質(zhì)量濃度高于不滅菌處理下總砷質(zhì)量濃度，其質(zhì)量濃度從高到低排序?yàn)闇缇N（284.4 ng/mL）＞滅菌＋菌種（283.1 ng/mL）＞不滅菌＋菌種（53.1 ng/mL）＞不滅菌－菌種（48.7 ng/mL）。并且無論是否加菌種，滅菌處理下土壤溶液中的總砷質(zhì)量濃度與不滅菌處理下的總砷質(zhì)量濃度都差距在200 ng/mL以上。這大大降低了土壤溶液中的總砷質(zhì)量濃度，降低了土壤溶液中的砷毒性。這可能是由于滅菌處理后土壤中的砷被土壤膠體吸附，故土壤溶液中的砷質(zhì)量濃度降低。

在滅菌處理的土壤溶液中，加菌種處理下的總砷質(zhì)量濃度和不加菌種處理下的總砷質(zhì)量濃度差別很小，且總砷含量都很高。這可能是由于在土壤淹水的條件下，在滅菌時，土壤中的砷主要以移動性強(qiáng)的無機(jī)砷形態(tài)存在，故在不滅菌時土壤溶液可測的總砷質(zhì)量濃度較高。

在不滅菌的土壤溶液中，加菌種處理下的總砷質(zhì)量濃度和不加菌種處理下的總砷質(zhì)量濃度差別也很小，并且總砷質(zhì)量濃度都維持在較低的水平。這可能是由于在不滅菌時，土壤微生物的影響或者是土壤沒有經(jīng)過高溫處理土壤性質(zhì)更適合砷被土壤膠體的吸附。

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，土壤淹水條件下，在不滅菌不加菌種時，土壤溶液中的As（Ⅲ）質(zhì)量濃度最低，為2.183 ng/mL；在不滅菌加菌種時，土壤溶液中的As（Ⅴ）質(zhì)量濃度最低，為35.60 ng/mL；在滅菌不加菌種時，土壤溶液中的DMA質(zhì)量濃度最高，為2.875 ng/mL；在不滅菌不加菌種時，土壤溶液中的總砷質(zhì)量濃度最低，為48.74 ng/mL。

［1］ KALTREIDER R C，DAVIS A M，LARIVIERE J P，et al.Arsenic alters the function of the glucocorticoid receptor as a transcription factor[J].Environmental Health Perspectives，2001，109：245-251.

［2］MANDAL B K，SUZUKI K T.Arsenic round the world:A review[J].Talanta，2002，58：201-235.

［3］ROSSMAN T G.Mechanism of arsenic carcinogenesis an integrated approach[J].Mutation Research，2003，533：37-65.

［4］曾希柏，和秋紅，李蓮芳，等.淹水條件對土壤砷形態(tài)轉(zhuǎn)化的影響[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，2010，21（11）：2997-3000.

［5］PONTIUS J F W.A current load at the federal drinking water regulations[J].Journal American Water Works Association，1992，84：36-42.

［6］段桂蘭，王利紅，陳玉，等.植物超富集砷機(jī)制研究的最新進(jìn)展[J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2007，27（5）：714-720.

［7］梁慧鋒，劉占牛，馬子川.新生態(tài)二氧化錳懸濁液的制備及對As（Ⅲ）氧化吸附機(jī)理的探討[J].河北大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2005，25（9）：515-519.

［8］王箴.化工詞典[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，1993.

［9］吳佳，謝明吉，楊倩，等.砷污染微生物修復(fù)的進(jìn)展研究[J].環(huán)境科學(xué)，2013（3）：817-823.

［10］ MEHARG A A，RAHMAN M M.Arsenic contamination of Bangladesh paddy field soils：Implications for rice contribution to arsenic consumption[J].Environmental Science and Technology，2003，37（2）：229-234.

［11］AGENCYUSEP.Recent developments for in situ treatment ofmetal contaminated soil[M].Washington D C：the University of Washington Press，1997：1-12.

［12］ FITZ W J.Arsenic transformations in the soil rhizosphere-plant system[J].Journal ofBiotechnology，2002，99（3）：259-278.

［13］NORRA S.Impact of irrigation with As rich groundwater on soil and crops[J].Applied Geochemistry，2005，20（10）：1890-1906.

［14］SMITH E，NAIDU R，ALSTON A M.Arsenic in the soil environment：Areview[J].Advances in Agronomy，1998，64：149-195.

［15］NICHOLSON F A，CHAMBERS B J，WILLIAMS J R，et al.Heavy metal contents of livestock feeds and animal manures in England and Wales[J].Bioresource Technology，1999，70：23-31.

［16］鄭喜珅，魯安懷，高翔.土壤中重金屬污染現(xiàn)狀與防治方法[J].土壤與環(huán)境，2002，11（1）：79-84.

［17］陳懷滿，鄭春榮.中國土壤重金屬污染現(xiàn)狀與防治對策[J].人類環(huán)境雜志，1999，2（2）：130-134.

［18］施積炎，陳英旭，林琦，等.根分泌物與微生物對污染土壤重金屬活性的影響[J].中國環(huán)境科學(xué)，2004，24（3）：316-319.