于成和，張麗蓉，柴蓓蓓，張若鵬,李娟

(大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院，云南大理 671000)

卵子存活率，改善不孕癥治療結(jié)局[2]。然而國(guó)內(nèi)外并未報(bào)道透明帶削薄程度對(duì)ICSI結(jié)局的影響。本研究比較了透明帶不打孔、淺層打孔、深層打孔ICSI操作的注射深度、胞質(zhì)漏出率、卵子存活率、受精率、2PN率、優(yōu)質(zhì)胚胎率，探討透明帶激光打孔輔助ICSI操作時(shí)最適宜的打孔深度。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2016年5月～2017年3月于大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科接受長(zhǎng)效長(zhǎng)方案+ICSI治療的男性不育癥夫婦為研究對(duì)象。夫妻雙方均同意選擇“激光輔助ICSI術(shù)”治療并簽署知情同意書。妻子年齡為(28.7±3.7)歲，丈夫年齡(29.1±3.8)，不育年限(4.3±3.1)年，Gn天數(shù)(10.6±1.7)d，Gn用量(1 973.52±635.32)IU，獲得成熟卵子數(shù)(11.6±4.8)枚，卵子直徑(159.16±11.22)μm，透明帶厚度為(16.32±3.02)μm。若獲得成熟卵子數(shù)≤2枚，則均行常規(guī)ICSI；若獲得3枚成熟卵子，第1、2枚卵子行常規(guī)ICSI，第3枚行透明帶淺層激光打孔+ICSI；若獲得4枚成熟卵子，第1、2枚卵子行常規(guī)ICSI，第3枚行透明帶淺層激光打孔+ICSI，第4枚行透明帶深層激光打孔+ICSI；若獲得5枚成熟卵子，第1、2、5枚卵子行常規(guī)ICSI，第3枚行透明帶淺層激光打孔+ICSI，第4枚行透明帶深層激光打孔+ICSI；若獲得6枚成熟卵子，第1、2、5、6枚卵子行常規(guī)ICSI，第3枚行透明帶淺層激光打孔+ICSI，第4枚行透明帶深層激光打孔+ICSI；若獲得7枚成熟卵子，第1、2、5、6枚卵子行常規(guī)ICSI，第3、7枚行透明帶淺層激光打孔+ICSI，第4枚行透明帶深層激光打孔+ICSI；若獲得8枚成熟卵子，第1、2、5、6枚卵子行常規(guī)ICSI，第3、7枚行透明帶淺層激光打孔+ICSI，第4、8枚行透明帶深層激光打孔+ICSI；以此類推。共有483枚成熟卵子接受常規(guī)ICSI，為C-ICSI組；237枚成熟卵子接受透明帶淺層激光打孔+ICSI，為L(zhǎng)A1-ICSI組；182枚成熟卵子接受透明帶深層激光打孔+ICSI，為L(zhǎng)A2-ICSI組。

1.2 控制性超促排卵、透明帶激光打孔及ICSI操作方法 根據(jù)文獻(xiàn)[3]方法對(duì)患者實(shí)施長(zhǎng)方案促排卵，當(dāng)超聲檢查可利用卵泡(≥16 mm)數(shù)達(dá)卵泡總數(shù)60%以上時(shí)，給予250 mg重組人絨毛膜促性腺素(hCG)誘導(dǎo)卵泡成熟。注射hCG后36～38 h，經(jīng)陰道超聲指引下取卵。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室ICSI操作常規(guī)[4]完成安裝并調(diào)整注射針(ICSI針)及持卵針(Holding針)、配注射盤、卵子隨機(jī)裝入注射滴內(nèi)等準(zhǔn)備工作，并將精子制動(dòng)后吸入注射針內(nèi)待注射。Holding針在3點(diǎn)鐘位置固定卵子，撥動(dòng)卵子，使極體處于6或12點(diǎn)鐘。C-ICSI組按照常規(guī)方法[4]行ICSI，LA1-ICSI組、LA2-ICSI組在9點(diǎn)鐘位置使用激光破膜儀(RI公司，英國(guó))分別在透明帶淺層(削薄厚度<1/2透明帶)、深層(削薄厚度≥1/2透明帶)低能量單次打孔(激光脈沖寬度<0.4 ms，孔徑尺度約3 μm)，每次激光打孔的孔徑和強(qiáng)度一致。打孔結(jié)束后，注射針穿過(guò)孔徑完成注射過(guò)程。

1.3 體外受精效果相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)方法 ①ICSI過(guò)程中觀察穿刺深度和胞質(zhì)漏出情況。穿刺深度是指進(jìn)針結(jié)束抽吸卵胞質(zhì)時(shí)，針尖至透明帶外側(cè)緣穿刺點(diǎn)的距離。胞質(zhì)漏出是指回吹胞質(zhì)時(shí)觀察到胞質(zhì)從針嘴漏出，或注射結(jié)束卵間隙內(nèi)可見漏出胞質(zhì)，計(jì)算胞質(zhì)漏出率。胞質(zhì)漏出率=胞質(zhì)漏出卵子個(gè)數(shù)/成熟卵子總數(shù)×100%。②ICSI后16～18 h觀察卵子存活及受精情況，胞質(zhì)內(nèi)觀察到2個(gè)原核(PN)視為正常受精。計(jì)算卵子存活率、受精率、2PN率。卵子存活率=存活卵子數(shù)/成熟卵子總數(shù)×100%，受精率=(2PN+1PN+多PN)卵子數(shù)/成熟卵子總數(shù)×100%，2PN率=2PN數(shù)/成熟卵子總數(shù)×100%。③ICSI后43～45 h采用四級(jí)評(píng)分法評(píng)估胚胎質(zhì)量[5]，Ⅰ、Ⅱ級(jí)胚胎評(píng)定為優(yōu)質(zhì)胚胎。優(yōu)質(zhì)胚胎率=(Ⅰ級(jí)胚胎數(shù)+Ⅱ級(jí)胚胎數(shù))/2PN胚胎數(shù)×100%。

2 結(jié)果

2.1 三組注射深度和胞質(zhì)漏出情況比較 C-ICSI 組、LA1-ICSI組、LA2-ICSI組注射深度分別為(64.72±8.97)、(50.63±5.77)、(45.44±6.75)μm。LA1-ICSI組、LA2-ICSI組注射深度少于C-ICSI組(P均<0.05)；LA1-ICSI組注射深度與LA2-ICSI組相比，P>0.05。C-ICSI組、LA1-ICSI組、LA2-ICSI組胞質(zhì)漏出率分別為25.05%(121/483)、28.69%(68/237)、35.71%(65/182)。LA2-ICSI組胞質(zhì)漏出率高于C-ICSI組，P<0.05；LA1-ICSI組胞質(zhì)漏出率與LA2-ICSI組和C-ICSI組相比，P均>0.05。

2.2 三組卵子存活及受精情況比較 C-ICSI 組、LA1-ICSI組、LA2-ICSI組卵子存活率分別為85.71%(414/483)、95.78%(227/237)、98.90%(180/182)。LA1-ICSI組、LA2-ICSI組卵子存活率高于C-ICSI組(P均<0.05);LA1-ICSI組卵子存活率與LA2-ICSI組相比，P>0.05。C-ICSI 組、LA1-ICSI組、LA2-ICSI組受精率分別為78.26%(378/483)、81.86%(194/237)、75.27%(137/182)，三組受精率相比，P均>0.05。C-ICSI組、LA1-ICSI組、LA2-ICSI組2PN率分別為70.60%(341/483)、72.15%(171/237)、68.68%(125/182)，三組2PN率相比，P均>0.05。

2.3 三組優(yōu)質(zhì)胚胎率比較 C-ICSI組、LA1-ICSI組、LA2-ICSI組優(yōu)質(zhì)胚胎率分別為47.80%(163/341)、58.48%(100/171)、39.20%(49/125)。LA1-ICSI組優(yōu)質(zhì)胚胎率顯著高于C-ICSI組和LA2-ICSI組(P均<0.05)；LA2-ICSI組優(yōu)質(zhì)胚胎率與C-ICSI組相比，P>0.05。

3 討論

在臨床工作中，ICSI治療結(jié)局可受多方面因素影響，例如實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員操作方法、卵子質(zhì)量、精子質(zhì)量等[6]。與IVF相比，ICSI具有更高受精率，但并沒有得到更高囊胚形成率及著床率，其原因可能與注射過(guò)程損傷卵子和精子有關(guān)。因此，探討適宜的方法進(jìn)一步減少注射對(duì)卵子的影響是ICSI相關(guān)臨床研究的熱點(diǎn)[7]。有學(xué)者用激光在透明帶上打孔，再通過(guò)該孔完成ICSI，發(fā)現(xiàn)該方法能有效提高卵子成活率[8]。本研究結(jié)果顯示，LA1-ICSI組和LA2-ICSI組注射深度均顯著低于C-ICSI組，而LA1-ICSI組注射深度比LA2-ICSI組深；LA1-ICSI組和LA2-ICSI組卵子存活率均顯著高于C-ICSI組，而LA2-ICSI組卵子存活率略高于LA1-ICSI組。表明透明帶淺層、深層激光打孔后行ICSI可以通過(guò)降低注射阻力而降低注射深度，從而減少注射對(duì)卵子所產(chǎn)生的機(jī)械損害，因此顯著提高了卵子存活率。對(duì)于獲卵數(shù)較少的患者，這種新方法能額外挽救卵子，具有較高臨床價(jià)值。

文獻(xiàn)報(bào)道，透明帶激光打孔輔助ICSI可提高優(yōu)質(zhì)胚胎率[3]，并提高胚胎著床率[9]。本研究結(jié)果顯示，LA1-ICSI組優(yōu)質(zhì)胚胎率顯著高于C-ICSI組，與文獻(xiàn)[9]報(bào)道類似。本研究結(jié)果還顯示，LA1-ICSI組優(yōu)質(zhì)胚胎率高于LA2-ICSI組，LA2-ICSI組優(yōu)質(zhì)胚胎率僅與C-ICSI組相當(dāng)，表明采用透明帶深層激光打孔不但不能進(jìn)一步提高胚胎質(zhì)量，還會(huì)降低胚胎質(zhì)量。究其原因，一是透明帶除了支持保護(hù)卵子外，還為卵母細(xì)胞提供必要的物質(zhì)通道。有研究表明，在透明帶表面鑲嵌著許多蛋白，任何一種蛋白的缺失都會(huì)影響透明帶功能和卵子、胚胎的發(fā)育[10]。因此，透明帶上激光打孔越深，對(duì)透明帶結(jié)構(gòu)破壞越大，越影響其生理功能，反而影響胚胎發(fā)育。其二，透明帶深層激光打孔能破壞卵間隙相對(duì)密閉的環(huán)境，減少卵間隙抽吸負(fù)壓，降低注射過(guò)程中細(xì)胞膜回收能力，導(dǎo)致胞質(zhì)易漏出。其三，透明帶上激光打孔較深導(dǎo)致注射深度較淺，細(xì)胞膜不能完全封閉ICSI針口，導(dǎo)致胞質(zhì)漏出，從而降低胚胎發(fā)育能力。本研究結(jié)果顯示，LA2-ICSI組胞質(zhì)漏出率高于C-ICSI組、LA1-ICSI組，可以解釋本研究結(jié)果。

文獻(xiàn)報(bào)道，透明帶激光打孔可提高ICSI受精率，對(duì)臨床妊娠率無(wú)明顯影響[9]。而有研究[3]表明透明帶激光打孔并不能顯著提高ICSI后受精率。本研究結(jié)果顯示，LA1-ICSI組受精率最高，C-ICSI組次之，LA2-ICSI組最低，雖然組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但也說(shuō)明透明帶激光打孔對(duì)ICSI卵子受精是有利的[11～14]。

綜上所述，與不打孔相比，透明帶淺層、深層激光打孔后行ICSI注射深度較低，卵子存活率和優(yōu)質(zhì)胚胎率較高。與透明帶淺層激光打孔相比，透明帶深層激光打孔后行ICSI可以進(jìn)一步降低注射深度，但優(yōu)質(zhì)胚胎率降低。ICSI前應(yīng)該行透明帶淺層激光打孔。

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