王歡，江莉，唐媛媛，周潔

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧530021)

男性不育癥病因復(fù)雜，目前認為主要的病因有染色體結(jié)構(gòu)或基因調(diào)控異常、全身性或神經(jīng)性疾病、感染、外傷、醫(yī)源性損傷、內(nèi)分泌失調(diào)、環(huán)境因素、免疫因素等。精子發(fā)生是一個復(fù)雜的多因素調(diào)控過程，miRNA通過調(diào)控其靶基因轉(zhuǎn)錄和翻譯而影響精子發(fā)生過程。研究表明，miRNA let7家族在精子運動、獲能、受精和胚胎發(fā)育中有重要作用，但具體機制不清楚[1]。細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子1A(CDKN1A)是細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子(CDKI)家族成員之一，是細胞周期重要的調(diào)控因子。本研究通過轉(zhuǎn)染miR-let7c沉默及過表達慢病毒質(zhì)粒載體，初步研究miR-let7c對精原細胞系GC-1spg中CDKN1A表達的影響，探討miR-let7c對精子發(fā)生影響的機制。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠精原細胞株GC-1spg購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會昆明細胞庫；miR-let7c過表達、沉默表達慢病毒和空載對照慢病毒包裝等由上海吉凱基因科技有限公司完成；AxyPrep總RNA小量制備試劑盒購自Axygen公司；引物內(nèi)參GAPDH、Reverse Transcriptase、SYBR Premix Ex TaqTM熒光定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司，引物設(shè)計、合成也由日本TaKaRa公司完成；10%胎牛血清、Trypsin-EDTA Solution和DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；內(nèi)參β-actin(HRP標記)購自PTG公司；羊抗兔二抗購自ABCAM公司。

1.2 miR-let7c慢病毒載體的構(gòu)建 設(shè)計合成帶有末端保護堿基、AgeI、EcoRI的酶切位點的mmu-miR-let7c引物。mmu-miR-let7c上游引物序列為5′-GGAAAGGACGAAACACCGGTATTCTATCTACAACC-TTGCCAAGC-3′，下游引物序列為5′-TGTCTCGAGGTCGAGAATTAAAAAAGGTAATGCATTAAGGCCTC-3′；mmu-let-7c-5p-inhibition上游引物序列為5′-AATTCAAAAATGAGGTAGTAGGTTGTATGGTT-3′，下游引物序列為5′-CCGGAACCATACAACCTACTACCTCATTTTTG-3′。擴增pre-miR-let7c序列。經(jīng)酶切后連接入慢病毒表達載體GV309(miRNA慢病毒載體)或GV280(miRNA-inhibition慢病毒載體)，慢病毒載體元件順序：hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin。經(jīng)轉(zhuǎn)化、PCR法篩選挑取陽性克隆，經(jīng)測序鑒定為pre-miR-let7c序列后抽提質(zhì)粒。GV309-miR-let7c(對照組為GV309空質(zhì)粒)、Helper1.0、Helper 2.0三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞，以10%FBS的DMEM培養(yǎng)48～72 h后收集上清即為病毒。

1.3 細胞分組及miR-let7c過表達、沉默表達慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 GC-1spg細胞在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，放置在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱。將處于對數(shù)生長期的GC-1spg細胞消化成細胞懸液分入6孔板中培養(yǎng)，當融合度為10%～20%時進行轉(zhuǎn)染。設(shè)miR-let7c上調(diào)組、miR-let7c下調(diào)組和對照組，分別轉(zhuǎn)染miR-let7c過表達慢病毒、miR-let7c沉默表達慢病毒、空載病毒，感染復(fù)數(shù)(MOI)=75，感染72 h后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達并計算轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染效率>90%者繼續(xù)培養(yǎng)用于后續(xù)實驗。

1.4 各組精原細胞CDKN1A mRNA檢測 提取各組精原細胞總RNA，測定RNA濃度及純度。按照TaKaRa公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA。以GAPDH為內(nèi)參照行實時熒光定量PCR反應(yīng)。CDKN1A上游引物序列為5′-GTCGCTGTCTTGCACTCTGG-3′，下游引物序列為5′-CCAATCTGCGCTTGGAGTGATA-3′；GAPDH上游引物序列為5′-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3′，下游引物序列為5′-TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG-3′。實時定量PCR反應(yīng)體系均為20 μL，其中包括Mix 10 μL，cDNA模板2 μL，上、下游引物終濃度0.8 μmol/L，其余體積用滅菌水補足。在Lightcycler 96 PCR儀中使用兩步法擴增：預(yù)變性95 ℃ 30 s，變性95 ℃ 5 s，退火與延伸60 ℃ 20 s，共40個循環(huán)。每次循環(huán)結(jié)束時收集熒光。以2-ΔΔCt表示三組CDKN1A mRNA相對表達量，實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.5 三組CDKN1A蛋白檢測 采用Western blotting法。先用RIPA裂解液提取各組細胞的總蛋白，BCA蛋白定量法測定蛋白光密度(OD)值，根據(jù)蛋白含量繪制標準曲線，配置5%濃縮膠和12%分離膠，在電泳槽內(nèi)加入電泳緩沖液，80 V恒壓電泳至溴酚藍跑出濃縮膠層，時間約為30 min，分離膠電泳為120 V。當溴酚藍遷移至距離分離膠下緣約1 cm時終止電泳，轉(zhuǎn)膜。400 mA穩(wěn)流電轉(zhuǎn)移1 h，將PVDF膜浸入5% BSA的封閉液中，室溫封閉1 h。使用ECL化學(xué)發(fā)光顯影。以CDKN1A條帶和內(nèi)參照β-actin條帶灰度值之比表示CDKN1A蛋白相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 三組CDKN1A mRNA表達比較 miR-let7c上調(diào)組、miR-let7c下調(diào)組、對照組CDKN1A mRNA相對表達量分別為0.005 6±0.000 9、0.039 1±0.006 7、0.021 9±0.001 8。與對照組比較，miR-let7c上調(diào)組CDKN1A mRNA相對表達量低于miR-let7c下調(diào)組及對照組(P均<0.01)，miR-let7c下調(diào)組CDKN1A mRNA相對表達量高于對照組(P<0.01)。

2.2 三組CDKN1A蛋白表達比較 miR-let7c上調(diào)組、miR-let7c下調(diào)組、對照組CDKN1A蛋白相對表達量分別為0.034 8±0.002 6、0.833 5±0.053 2、0.257 4±0.070 9。與對照組比較，miR-let7c上調(diào)組CDKN1A蛋白相對表達量低于miR-let7c下調(diào)組及對照組(P均<0.01)，miR-let7c下調(diào)組CDKN1A蛋白相對表達量高于對照組(P<0.01)。

3 討論

miRNA是內(nèi)源性的非編碼小分子RNA，長度為22～24個核苷酸。miRNA通過與靶mRNA 3′-UTR區(qū)形成互補序列，使靶mRNA降解或者抑制其翻譯，從而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄后水平[2]。miRNA主要是對內(nèi)源性mRNA進行修飾，并且在表達上具有發(fā)育時序性和組織特異性，參與細胞的生長、增殖和凋亡等過程。miRNA在哺乳動物的睪丸、附睪、精子和精漿中廣泛表達，并在原始生殖細胞(PGCs)、精原干細胞(SSCs)和精原細胞中有更高的表達水平，參與精子發(fā)生發(fā)育和成熟的各個階段[3]，因而被認為是生殖細胞發(fā)育的強有力調(diào)節(jié)器。目前已發(fā)現(xiàn)miR-17-92簇和miR-let-7家族(a、d、e、c、g)能調(diào)控PGCs增殖和發(fā)育。miR-17-92基因簇是含有共同miRNAs位點的4個不同miRNA家族(miR-17、miR-18、miR-19、miR-25)，可能參與SSCs的早期分化，也在未分化的精原細胞中表達，在分化過程中表達下調(diào)。miR-17-92基因簇能下調(diào)E2F1基因，避免精子發(fā)生過程中減數(shù)分裂的細胞凋亡。敲除miR-17-92基因簇的成年小鼠，其生殖功能障礙，出現(xiàn)異常的睪丸表型，包括睪丸嚴重萎縮、精原細胞和SSCs丟失、生殖細胞凋亡和精子生成減少等[4]。let7被廣泛用于腫瘤和干細胞包括多種細胞抗凋亡和增殖途徑的相關(guān)研究[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，let-7能直接調(diào)節(jié)細胞周期關(guān)鍵的原癌基因，如RAS、CDC25A、CDK6、Cyclin D等，阻斷細胞G1/S期的轉(zhuǎn)換過程，從而抑制腫瘤細胞增殖[6]。精子發(fā)生是精原干細胞不斷自我更新、動態(tài)的、復(fù)雜的過程，SSCs的自我更新和細胞池之間的平衡受到嚴格而周密的調(diào)控，當SSCs出現(xiàn)過度的自我更新或分化時，打破了平衡的調(diào)控網(wǎng)，從而導(dǎo)致男性不育[7]。Toledano等[8]研究發(fā)現(xiàn)let-7過表達可導(dǎo)致果蠅生殖干細胞減少。Shinoda等[9]認為過表達的let-7通過靶向Lin28a減少雄性生殖細胞的數(shù)量。此外，精漿中miR-19b和let-7a的異常表達可導(dǎo)致生精障礙[10]。在睪丸組織中，miR-let-7a-1、miR-let-7a-2、miR-1et-7a-3、miR-let-7b、miR-1et-7c、miR-let-7d、miR-let-7d-v1、miR-let-7d-v2、miR-let-7e、miR-let-7f-1、miR-let-7g等特異表達，在維持干細胞增殖、分化和自我更新能力的過程中也起到重要調(diào)控作用。因此我們選擇miR-let7c為研究目標，探討其在精子發(fā)生中的作用機制。

本研究結(jié)果顯示miR-let7c上調(diào)組GC-1spg細胞中CDKN1A mRNA和蛋白表達量顯著降低，miR-let7c下調(diào)組GC-1spg細胞中CDKN1A mRNA和蛋白表達量顯著升高，說明miR-let7c能夠負向調(diào)控CDKN1A的表達。miRNA的調(diào)控作用貫穿到精子發(fā)生發(fā)育和成熟的整個過程。這些過程需要一個精準的、具有空間性和時間性的基因調(diào)控表達模式。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些與精子活力有關(guān)的基因，如Tektin-2、DNAI1、DNAH5、DNAH11、AKAP3、AKAP4、SEPT4、SMCP、SEMG1、CRISP2等。CDKN1A是細胞周期重要的負性調(diào)控因子，可與G1-S/CDK(G1-S/細胞周期蛋白依賴激酶，CDK2)和S/CDK復(fù)合物結(jié)合，調(diào)節(jié)細胞周期G1期向S期過渡過程[11]，在轉(zhuǎn)錄、翻譯后修飾、DNA復(fù)制和修復(fù)等途徑中發(fā)揮重要作用。此外CDKN1A還扮演調(diào)節(jié)細胞存活和細胞凋亡的雙重角色，這主要取決于CDKN1A在細胞內(nèi)的定位[12]。CDKN1A對調(diào)節(jié)精原干細胞種系傳遞起關(guān)鍵作用，被認為是維持睪丸生殖細胞完整性的守護者[13]。在正常睪丸組織，CDKN1A在粗線期精母細胞和精子細胞中的表達最高[5]。精母細胞、精子細胞和精子等雄性生殖細胞對DNA損傷因素易感，而DNA損傷途徑受到CDKN1A的調(diào)控，后者還參與DNA損傷后的細胞周期進程[14,15]。當CDKN1A的表達受到抑制，在細胞沒有進行DNA修復(fù)的時候就進入細胞周期，復(fù)制了錯誤的遺傳信號，阻滯了細胞周期進程。結(jié)合本研究結(jié)果，筆者推測，在SSCs的自我更新或分化中，為了避免出現(xiàn)過度活躍的細胞增殖，miR-let7c通過負向調(diào)控CDKN1A而抑制細胞增殖，阻滯了細胞周期G1期向S期過渡，維持SSCs細胞池之間的平衡，確保精子發(fā)生調(diào)控過程的精準性。

目前對miRNA參與生殖細胞增殖、分化和凋亡的調(diào)控作用的研究主要集中在精子發(fā)生的中晚期階段，而對精子發(fā)生早期階段的研究較少，尤其是從精母細胞到精原細胞的過程。本研究結(jié)果為后續(xù)探討miR-let7c在男性不育臨床診斷及治療中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。而miR-let7c如何通過CDKN1A調(diào)控精子發(fā)生的作用機制將有待進一步研究。

參考文獻：

[1] Tong MH, Mitchell D, Evanoff R, et al. Expression of Mirlet7 family microRNAs in response to retinoic acid-induced spermatogonial differentiation in mice[J]. Biol Reprod, 2011,85(1):189-197.

[2] Wang B, Ricardo S. Role of microRNA machinery in kidney fibrosis[J]. Clin Exp Pharmacol Physiol, 2014,41(8):543-550.

[3] Luo Z, Liu Y, Chen L, et al. MicroRNA profiling in three main stages during porcine spermatogenesis[J]. Assist Reprod Genet, 2015,32(3):451-460.

[4] Xie R, Lin X, Du T, et al. Targeted disruption of miR-17-92 impairs mouse spermatogenesis by activating mTOR signaling pathway[J]. Medicine (Baltimore), 2016,95(7):e2713.

[5] Kim JM, Lee ST, Chu K.Inhibition of Let7c MicroRNA is neuroprotective in a rat intracerebral hemorrhage model[J]. PLoS One, 2014,24;9(6):e97946.

[6]Johnson CD, Esquela Kerscher A, Stefani G. The let-7 microRNA represses cell proliferation pathways in human cells[J]. Cancer Res, 2007,1567(16):7713-7722.

[7] Kanatsu Shinohara M, Takashima S. Transmission distortion by loss of p21 or p27 cyclin-dependent kinase inhibitors following competitive spermatogonial transplantation[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2010,107(14):6210-6215.

[8] Toledano H, D′Alterio C, Czech B, et al. The let-7-Imp axis regulates ageing of the Drosophila testis stem-cell niche[J]. Nature, 2012,485:605-610.

[9] Shinoda G, De Soysa TY, Seligson MT, et al. Lin28a regulates germ cell pool size and fertility[J]. Stem Cells, 2013,31:1001-1009.

[10] Wu W, Hu Z, Qin Y, et al. Seminal plasma microRNAs: potential biomarkers for spermatogenesis status[J]. Molecul Human Reprod, 2012,18(10):489-497.

[11] Erkekoglu P, Rachidi W, Yuzugullu OG, et al. Induction of ROS, p53, p21 in DEHP- and MEHP-exposed LNCaP cells-protection by selenium compounds[J]. Food Chem Toxicol, 2011,49:1565-1571.

[12] Cmielova J, Rezacova M. p21Cip1/Waf1 protein and its function based on a subcellular localization[J]. Cell Biochem, 2011,112(12):3502-3506.

[13] Russell LD, Chiarini-Garcia H, Korsmeyer SJ, et al. Bax-dependent spermatogonia apoptosis is required for testicular development and spermatogenesis[J]. Biol Reprod, 2002,66(4):950-958.

[14] Abbas T, Dutta A. p21 in cancer: intricate networks and multiple activities[J]. Nat Rev Cancer, 2009,9(6):400-414.

[15] Solek P, Majchrowicz L, Bloniarz D, et al. Pulsed or continuous electromagnetic field induce p53/p21-mediated apoptotic signaling pathway in mouse spermatogenic cells in vitro and thus may affect male fertility[J]. Toxicology, 2017,382:84-92.