張金平，汪麗云，王永梅，韓巨

(1山東省千佛山醫(yī)院，濟(jì)南250014；2海北藏族自治州第二人民醫(yī)院)

大量研究證實(shí)，神經(jīng)元凋亡在缺血性腦卒中的發(fā)病中至關(guān)重要。因此，尋找方法來(lái)抑制缺血缺氧造成的神經(jīng)元凋亡，是目前缺血性腦卒中研究的焦點(diǎn)和熱點(diǎn)[1，2]。紅景天苷是“適應(yīng)原性”藥物紅景天的有效提取物之一。研究證實(shí)，紅景天苷不僅具備抗缺氧、抗細(xì)胞凋亡、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗疲勞、抗輻射等作用，還具有良好的神經(jīng)保護(hù)作用[3～5]。2016年9月～2017年12月，本研究擬通過(guò)缺氧建立神經(jīng)元凋亡體外模型，觀察紅景天苷對(duì)缺氧誘導(dǎo)的原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的抑制作用，并通過(guò)探究缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)信號(hào)通路變化進(jìn)一步揭示可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑 新生1 d SD乳鼠，體質(zhì)量7～12 g，雄雌各半，購(gòu)自山東省千佛山醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。紅景天苷購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，純度>99%，用三蒸水溶解配成800 μg/mL母液，過(guò)濾，4 ℃保存。DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、谷氨酰胺(Hyclone公司)；胰蛋白酶、Neurobasal培養(yǎng)基、B27(Gibco公司)；阿糖胞苷、多聚賴氨酸、MTT、DMSO、DAPI(Sigma公司)；神經(jīng)元特異性標(biāo)記物微管相關(guān)蛋白(MAP-2)(Abcom公司)；FITC標(biāo)記二抗、封閉用羊血清(武漢博士德公司)；HIF-1α抗體(Novus公司)；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 原代海馬神經(jīng)元分離、培養(yǎng)及鑒定 取乳鼠，用75%乙醇消毒、斷頭，用小剪和鑷子逐層分離乳鼠皮膚及顱骨，取出腦組織并在冰上分離海馬，清洗并加入0.125%的胰蛋白酶2 mL，直剪剪碎，放入37 ℃、5% CO2孵箱中消化15 min，用含10%新生牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液終止消化并離心，吸棄上清并重新懸浮，鋼篩過(guò)濾后將細(xì)胞接種于培養(yǎng)板，24 h后全量換液繼續(xù)培養(yǎng)2 d，加10 μmol/L的阿糖胞苷處理24 h后Neurobasal+B27培養(yǎng)基全量換培養(yǎng)液，每周2次半量換液，第6～8天取細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。用0.01 mol PBS清洗海馬神經(jīng)元，用4%多聚甲醛4 ℃孵育15 min，0.2% TritonX-100透化5 min，PBS清洗后用10%羊血清封閉1 h，MAP-2一抗4 ℃孵育過(guò)夜，室溫下FITC標(biāo)記二抗，孵育30 min，0.5 g/L DAPI染色5 min。用MAP-2標(biāo)記海馬神經(jīng)元，用DAPI標(biāo)記細(xì)胞核。選取5個(gè)不同區(qū)域拍照，用Image-Pro Plus 6.0軟件分析神經(jīng)元純度。

1.3 海馬神經(jīng)元缺氧凋亡模型構(gòu)建 將培養(yǎng)好的細(xì)胞隨機(jī)分為正常對(duì)照組、缺氧組及10、50、100 μg/mL紅景天苷預(yù)處理組。正常對(duì)照組用常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)；缺氧組構(gòu)建缺氧凋亡模型；紅景天苷預(yù)處理組加入不同劑量(10、50、100 μg/mL)紅景天苷預(yù)培養(yǎng)24 h，參照構(gòu)建缺氧凋亡模型的方法[6]進(jìn)行處理。配制缺氧液：NaH2PO40.9 mmol/L、NaHCO36.0 mmol/L、CaCl21.0 mmol/L、MgSO41.2 mmol/L、乳酸鈉 40 mmol/L、N-2-羥乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸溶液20 mmol/L、NaCl 98.5 mmol/L、KCl 10.0 mmol/L，pH 6.8，37 ℃，以高濃度氮?dú)怙柡?>99.9%，1 L/min×30 min)，測(cè)其血?dú)釶O2≤4.0 kPa。用缺氧液置換正常培養(yǎng)液為缺氧，缺氧6 h，用正常培養(yǎng)液置換缺氧液為復(fù)氧，復(fù)氧12 h。建立缺氧凋亡細(xì)胞模型。

1.4 海馬神經(jīng)元凋亡檢測(cè) 采用MTT法。取各組細(xì)胞，加入MTT母液使其終濃度為0.5 mg/mL，孵化2 h后用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度值，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組吸光度值-空白對(duì)照組吸光度值)/(對(duì)照組吸光度值-空白對(duì)照組吸光度值)×100%。

1.5 海馬神經(jīng)元培養(yǎng)上清液乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)活性測(cè)定 取處理后細(xì)胞培養(yǎng)上清液，參照南京建成LDH、CK測(cè)試盒步驟，用分光光度計(jì)測(cè)定各管吸光度值，計(jì)算上清液中LDH、CK活性。

1.6 神經(jīng)元內(nèi)HIF-1α蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。用裂解液裂解各組神經(jīng)元收集蛋白。蛋白定量后行SDS-PAGE凝膠電泳并轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜。HIF-1α一抗4 ℃過(guò)夜孵育后加入HRP標(biāo)記的二抗，37 ℃孵育1 h，凝膠成像系統(tǒng)ECL發(fā)光成像，并用Lab Image version 2.7.1軟件分析各組條帶灰度值。目標(biāo)蛋白相對(duì)表達(dá)量=目標(biāo)蛋白灰度值/β-actin灰度值。

2 結(jié)果

2.1 元代海馬神經(jīng)元細(xì)胞的鑒別結(jié)果 培養(yǎng)第5～7天，神經(jīng)元生長(zhǎng)良好，可見(jiàn)清晰的胞核及核仁，延伸的樹(shù)棘突形成神經(jīng)細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)。免疫熒光染色法檢測(cè)神經(jīng)元純度>95%，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 紅景天苷對(duì)缺氧誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元凋亡的影響 與正常對(duì)照組比較，缺氧組及10、50、100 μg/mL紅景天苷預(yù)處理組海馬神經(jīng)元存活率分別為1、47.4%±9.7%、63.5%±9.5%、77.5%±9.0%、90.6%±17.2%。與正常對(duì)照組比較，缺氧組海馬神經(jīng)元存活率低(P<0.05)；與缺氧組比較，50、100 μg/mL紅景天苷預(yù)處理組海馬神經(jīng)元存活率高(P均<0.05)，且呈劑量依賴性；正常對(duì)照組與100 μg/mL紅景天苷預(yù)處理組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 紅景天苷對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中LDH、CK活性的影響 正常對(duì)照組、缺氧組及10、50、100 μg/mL紅景天苷預(yù)處理組細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中LDH活性分別為(333.4±142.1)、(985.0±177.8)、(655.0±185.1)、(576.6±154.7)、(492.5±147.5)U/L，CK活性分別為(199.3±75.83)、(3 532±689.5)、(1 935±362.9)、(1 488±154.7)、(909.0±90.74)U/L。與正常對(duì)照組比較，缺氧組LDH、CK活性高(P均<0.05)；與缺氧組比較，50、100 μg/mL紅景天苷預(yù)處理組LDH、CK活性低(P均<0.05)，且呈劑量依賴性;正常對(duì)照組與100 μg/mL紅景天苷預(yù)處理組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4 紅景天苷對(duì)海馬神經(jīng)元內(nèi)HIF-1α蛋白表達(dá)的影響 正常對(duì)照組、缺氧組及10、50、100 μg/mL紅景天苷預(yù)處理組HIF-1α蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1、4.5±0.8、8.2±0.9、15.5±1.6、19.9±2.8。與正常對(duì)照組比較，缺氧組HIF-1α蛋白相對(duì)表達(dá)量高(P<0.05)；與缺氧組比較，10、50、100 μg/mL紅景天苷預(yù)處理組HIF-1α蛋白相對(duì)表達(dá)量高(P均<0.05)，且呈劑量依賴性。

3 討論

腦卒中是最常見(jiàn)的嚴(yán)重神經(jīng)系統(tǒng)疾病，2018年美國(guó)心臟聯(lián)合會(huì)最新公布數(shù)據(jù)顯示，2015年全球大約有0.424億人罹患腦血管疾病，有630萬(wàn)腦血管患者死亡。腦血管疾病為全球第二大致死性疾病，給家庭和社會(huì)帶來(lái)了巨大的負(fù)擔(dān)[7，8]。與西方國(guó)家相比，我國(guó)腦卒中危害更甚。2010年調(diào)查發(fā)現(xiàn)，腦卒中已成為我國(guó)首位致死疾病(170萬(wàn)人死亡)[9]。而缺血性腦卒中占所有腦卒中的80%。

研究證實(shí)，神經(jīng)元凋亡參與了大部分神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程，在缺血性卒中發(fā)病過(guò)程中起關(guān)鍵性作用[1]。紅景天苷是傳統(tǒng)中藥紅景天的提取物之一。研究證實(shí)，"適應(yīng)原性"藥物紅景天具有抗凋亡、抗缺氧、抗腫瘤、抗輻射等多種作用，其神經(jīng)保護(hù)作用也被研究所證實(shí)。紅景天苷可通過(guò)上調(diào)PI3K/Akt/HIF信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)進(jìn)而抑制白細(xì)胞介素6(IL-6)、IL-1β、腫瘤壞死因子α、CD14、CD44等炎癥因子的表達(dá)，從而減輕大鼠缺氧性全腦損害[10]。Biswal等[11]研究證實(shí)，紅景天苷可促進(jìn)Bcl-xL穩(wěn)定表達(dá)，進(jìn)一步抑制PGAM5磷酸化和pFUNDC1的去磷酸化，從而抑制缺氧誘導(dǎo)的大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元脂褐素沉積導(dǎo)致的神經(jīng)元退行及自噬現(xiàn)象。Wu等[5]認(rèn)為，Wnt/β-catenin信號(hào)通路激動(dòng)劑LiCl可通過(guò)升高谷胱甘肽過(guò)氧化物酶水平，促進(jìn)糖原合酶激酶3磷酸化等減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，改善6-羥基多巴胺單側(cè)損傷大鼠的行為缺陷和多巴胺能神經(jīng)元損失。紅景天苷在體內(nèi)體外均可增強(qiáng)LiCl的神經(jīng)保護(hù)作用，提示紅景天苷將來(lái)可能用于治療帕金森病。但紅景天苷是否可通過(guò)抑制神經(jīng)元凋亡來(lái)抑制缺氧造成的神經(jīng)損害至今仍無(wú)定論，其相關(guān)的作用機(jī)制也有待于進(jìn)一步證實(shí)。本研究采用缺氧誘導(dǎo)體外元代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元建立神經(jīng)缺氧模型，證實(shí)分離的元代海馬神經(jīng)元純度高，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。用MTT法檢測(cè)各組神經(jīng)元凋亡情況，經(jīng)過(guò)缺氧處理后，海馬神經(jīng)元存活率低于正常對(duì)照組；經(jīng)紅景天苷預(yù)處理后，神經(jīng)元存活率較缺氧組高，且具有劑量相關(guān)性。

LDH、CK是存在于細(xì)胞質(zhì)的酶，當(dāng)細(xì)胞膜受到損傷時(shí)，LDH、CK會(huì)釋放到培養(yǎng)基中，因此培養(yǎng)基中LDH、CK的活性可反映死細(xì)胞和受損細(xì)胞的數(shù)量。為驗(yàn)證紅景天苷的保護(hù)作用，進(jìn)一步檢測(cè)了各組細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中LDH、CK活性。與正常對(duì)照組比較，缺氧組LDH、CK活性高；與缺氧組比較，50、100 μg/mL紅景天苷預(yù)處理組LDH、CK活性低，且呈劑量依賴性；正常對(duì)照組與100 μg/mL紅景天苷預(yù)處理組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意。證實(shí)紅景天苷可抑制缺氧誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元凋亡，且該作用具有劑量依賴性，劑量越高作用越強(qiáng)。提示可采用100 μg/mL劑量進(jìn)行后續(xù)相關(guān)機(jī)制的研究。

HIF-1是存在于人類和哺乳動(dòng)物體內(nèi)的關(guān)鍵性缺氧應(yīng)答調(diào)控因子，其可通過(guò)調(diào)控血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、重組人促紅素、糖原合成酶激酶3等一系列下游靶基因的表達(dá)，從而使機(jī)體對(duì)缺氧、缺血產(chǎn)生適應(yīng)。HIF-1由α和β兩個(gè)亞基組成，其中，HIF-1β為基礎(chǔ)表達(dá)蛋白，不因缺氧環(huán)境改變而變化；HIF-1α蛋白的表達(dá)與細(xì)胞氧濃度有關(guān)。常氧狀態(tài)下，HIF-1α羥基化，與泛激素結(jié)合酶復(fù)合物結(jié)合后迅速降解；而在缺氧或螯合劑存在狀態(tài)下，HIF-1α羥基化被抑制，表達(dá)升高，與HIF-1β結(jié)合進(jìn)一步激活下游一系列蛋白表達(dá)，從而使機(jī)體適應(yīng)缺氧改變[12，13]。本研究證實(shí)，缺氧組HIF-1α蛋白表達(dá)高，紅景天苷預(yù)處理組HIF-1α蛋白降解被進(jìn)一步抑制，蛋白表達(dá)進(jìn)一步升高，且蛋白表達(dá)同紅景天苷處理劑量呈正相關(guān)關(guān)系，證實(shí)紅景天苷可能通過(guò)促進(jìn)HIF-1α蛋白的表達(dá)從而抑制缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡。HIF-1為機(jī)體缺氧適應(yīng)的上游靶基因，紅景天苷具體通過(guò)HIF下游的哪條信號(hào)通路起到抑制神經(jīng)元凋亡的作用，這是后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)一步驗(yàn)證的。

總之，研究證實(shí)紅景天苷具有神經(jīng)保護(hù)作用，其可通過(guò)抑制神經(jīng)元凋亡從而減輕缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)損害，其作用機(jī)制可能與上調(diào)HIF-1α蛋白表達(dá)進(jìn)而調(diào)控其下游的靶蛋白表達(dá)密切相關(guān)。