錢琴芬，熊建新，朱琳，顧猛

(常州市兒童醫(yī)院，江蘇常州213003)

哮喘是呼吸系統(tǒng)一類復(fù)雜的異質(zhì)性炎癥性疾病，近年來(lái)其發(fā)病率逐年上升[1]。目前，全球范圍內(nèi)約有3億哮喘患者，而據(jù)WHO估計(jì)，至2025年哮喘患者將新增1個(gè)億，其中小兒哮喘所占比例將由3%提高至38%[2]。導(dǎo)致哮喘的細(xì)胞包括肥大細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞與淋巴細(xì)胞，且淋巴細(xì)胞中的輔助性T細(xì)胞(Th細(xì)胞)起主要作用[3]。微小RNA(microRNA)是一類長(zhǎng)度為20～24核苷酸的RNA，由microRNA調(diào)控的基因近來(lái)被證實(shí)與Th細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育及功能關(guān)系密切[4]。有研究證明，miR-206的基因位點(diǎn)與白細(xì)胞介素17a(IL-17a)、IL-17b的相毗鄰[5]。而IL-17是一種由Th17細(xì)胞分泌的細(xì)胞活性物質(zhì)，其已被證實(shí)參與機(jī)體內(nèi)的多種炎癥反應(yīng)，包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[6]、系統(tǒng)性紅斑狼瘡[7]與多發(fā)性硬化[8]等。本研究檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)中miR-206、IL-17 mRNA表達(dá)，以探討miR-206在小兒哮喘發(fā)病中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年9月～2017年10月本院兒科門診及病房治療的哮喘患兒43例，男25例、女18例，年齡3～14(7.13±1.59)歲?；純杭{入標(biāo)準(zhǔn)：符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)制定的《支氣管哮喘防治指南(2016年版)》[9]標(biāo)準(zhǔn)，且于急性發(fā)作期就診；就診前1個(gè)月內(nèi)未全身應(yīng)用糖皮質(zhì)激素類藥物，且72 h內(nèi)未應(yīng)用其他平喘藥物；未合并嚴(yán)重感染或其他嚴(yán)重疾病；未發(fā)生蕁麻疹、過(guò)敏性鼻炎等。將患兒按照《支氣管哮喘防治指南(2016年版)》[9]標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級(jí)，一級(jí)、二級(jí)設(shè)為輕度組，三級(jí)、四級(jí)設(shè)為重度組。其中輕度組18例、重度組25例。同期選取30例健康兒童作對(duì)照，男15例、女12例，年齡4～14(7.50±1.08)歲。各組年齡、性別具有可比性。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患兒家屬知情同意。

1.2 PBMCs分離及提取 患兒入院3 d內(nèi)喘息、咳嗽、氣促、胸悶等癥狀未明顯緩解則視為急性發(fā)作期，經(jīng)治療3～9 d癥狀明顯緩解或消失，則視為緩解期。分別于急性發(fā)作期、緩解期清晨抽取患兒空腹靜脈血5 mL，對(duì)照組于查體時(shí)抽取等量空腹靜脈血，加入肝素(50 U/mL)抗凝。用Ficoll-Hypaque分離液(行知生物科技有限公司)分離提取PBMCs，調(diào)整細(xì)胞為2×106/L，接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，加入植物血凝素，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，2 000 r/min離心10 min，收取上清液，冷藏備用。

1.3 PBMCs中miR-206、IL-17 mRNA表達(dá)檢測(cè) 用qRT-PCR法。用TakaraTMreagent Kit(Perfect Real Time,行知生物科技有限公司)將上述制得的PBMCs樣本中的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以U6為miR-206內(nèi)參，β-actin為IL-17 mRNA內(nèi)參，用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。miR-206正向引物：5′-GGCCGCTGGAATGTAAGGAAG-3′，反向引物：5′-CTGCAGGGTCCGAGGT-3′；U6正向引物：5′-GTGGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，反向引物：5′-GTAACGCTT CACGAATTTGCGTGTC-3′；IL-17 mRNA正向引物：5′-TGAGAGTTGACATTCGCATCTT-3′，反向引物：5′-GATACAGCCTGAGTGTCTGCAC-3′；β-actin正向引物：5′-CACGAAACTACCTTCAACTCC-3′，反向引物：5′-CATACTCCTGCTTGCTGATCT-3′。引物均由行知生物科技有限公司合成。

2 結(jié)果

2.1 哮喘患兒與健康兒童PBMCs中miR-206、IL-17 mRNA表達(dá)比較 健康兒童PBMCs中miR-206、IL-17 mRNA分別為0.211±0.037、0.074±0.019，哮喘患兒緩解期分別為0.208±0.067、0.082±0.018，哮喘患兒發(fā)作期分別為0.051±0.011、0.621±0.185。與健康兒童比較，哮喘患兒發(fā)作期PBMCs中miR-206相對(duì)表達(dá)量低、IL-17 mRNA相對(duì)表達(dá)量高(t分別為26.781、16.102，P均<0.05)，而哮喘患兒緩解期PBMCs中miR-206、IL-17 mRNA相對(duì)表達(dá)量與健康兒童比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t分別為0.222、1.826，P均>0.05)。

2.2 哮喘患兒發(fā)作期PBMCs中miR-206與IL-17 mRNA表達(dá)的相關(guān)性 Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，哮喘患兒發(fā)作期PBMCs中miR-206與IL-17 mRNA相對(duì)表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)(r=-0.960，P<0.05)。

2.3 哮喘急性發(fā)作病情嚴(yán)重程度與PBMCs中miR-206、IL-17 mRNA表達(dá)的關(guān)系 輕度組PBMCs中miR-206、IL-17 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.061±0.008、0.465±0.132，重度組分別為0.048±0.012、0.672±0.158。Spearman秩相關(guān)分析結(jié)果顯示，哮喘患兒病情嚴(yán)重程度與miR-206表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.592，P<0.05)，與IL-17 mRNA表達(dá)呈正相關(guān)(rs=0.601，P<0.05)。

3 討論

哮喘是一種難以根治的可逆的阻塞性呼吸道疾病，一般包括慢性炎癥性反應(yīng)與氣道高敏反應(yīng)，表現(xiàn)為咳嗽、噴嚏、鼻塞、鼻癢、流涕、肺部哮鳴音、胸悶、氣喘等[10]。引起哮喘急性發(fā)作的原因多種多樣，包括且不限于過(guò)敏反應(yīng)、繼發(fā)性感染、職業(yè)暴露、特定藥物的應(yīng)用、脈管炎乃至體育鍛煉[11,12]。哮喘種類繁多，具有異質(zhì)性。目前的診斷手段尚無(wú)法將不同的哮喘種類明確區(qū)分，為制訂個(gè)體化治療方案、根治哮喘造成了極大的阻礙。因此急需一種非侵入性的新型診斷手段以改善哮喘的臨床診療方案、了解哮喘的病因病理。本研究選取microRNAs為觀察指標(biāo)，通過(guò)檢測(cè)兒童PBMCs中miR-206與IL-17 mRNA表達(dá)，探究哮喘患兒PBMCs中的miR-206是否可作為小兒哮喘的特異性生物標(biāo)記物。

microRNAs是一類非編碼單股RNA，通過(guò)與Argonaute家族蛋白結(jié)合，microRNAs能夠參與形成有活性的RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體，沉默目標(biāo)mRNA[13]，從而調(diào)節(jié)相應(yīng)細(xì)胞因子表達(dá)，進(jìn)而參與機(jī)體多種病理生理進(jìn)程[14]。近來(lái)有研究證實(shí)microRNAs參與淋巴細(xì)胞的終末分化過(guò)程[15]。其中，miR-206被認(rèn)為與骨肉瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展[16]或機(jī)體激素分泌[17]相關(guān)。但miR-206與炎癥性疾病的關(guān)系目前尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)哮喘患兒發(fā)作期PBMCs中miR-206表達(dá)低，同時(shí)伴隨IL-17 mRNA表達(dá)上調(diào)；而哮喘患兒緩解期PBMCs中miR-206、IL-17 mRNA表達(dá)與健康兒童并無(wú)差異。且miR-206的表達(dá)與患兒病情嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)，即miR-206表達(dá)低的患兒病情更為嚴(yán)重。

IL-1是由Th17細(xì)胞(即CD4陽(yáng)性細(xì)胞)分泌的一種細(xì)胞因子[18]。IL-17可誘導(dǎo)IL-6、前列腺素E2的分泌，T細(xì)胞增殖與分化[19,20]。目前認(rèn)為IL-17表達(dá)上調(diào)與多種炎癥性疾病密切相關(guān)[6～8]。IL-17能夠刺激氣道平滑肌分泌嗜酸細(xì)胞活化趨化因子，同時(shí)誘導(dǎo)人嗜酸性細(xì)胞分泌炎癥性介質(zhì)[21，22]。Agache等[23]研究發(fā)現(xiàn)，血液內(nèi)IL-17表達(dá)上調(diào)，預(yù)示著哮喘病情惡化，發(fā)作劇烈。本研究發(fā)現(xiàn)，哮喘患兒發(fā)作期PBMCs中IL-17水平較健康兒童高，而哮喘患兒緩解期PBMCs中IL-17水平則回落至正常水平。而之后的Spearman回歸分析結(jié)果顯示，PBMCs中IL-17水平與哮喘患兒急性發(fā)作期的病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，哮喘患兒發(fā)作期PBMCs中miR-206與IL-17 mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，因此推測(cè)miR-206參與小兒哮喘的機(jī)制可能與IL-17相關(guān)。miR-206可能參與構(gòu)成IL-17 mRNA為沉默目標(biāo)的RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體。因此當(dāng)miR-206表達(dá)受到抑制，IL-17水平即隨之上升，從而引發(fā)嚴(yán)重的哮喘癥狀。但此推論尚需進(jìn)一步研究證明。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)作期哮喘患兒PBMCs中miR-206呈低表達(dá)，miR-206表達(dá)水平與IL-17 mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示miR-206可能通過(guò)IL-17 mRNA相關(guān)通路參與小兒哮喘急性發(fā)作的發(fā)生發(fā)展。