衣昕，劉慧慧，肖國棟

(1南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇南通 226001；2蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院)

中風(fēng)是世界范圍內(nèi)第三大死因，是成人慢性致殘的主要原因[1,2]。缺血性腦卒中約占所有中風(fēng)的70%。缺血性腦卒中引起腦損傷涉及的分子機(jī)制主要包括興奮性毒性、氧化應(yīng)激、炎癥、細(xì)胞凋亡和周邊極化去極化[3～7]。盡管許多神經(jīng)保護(hù)劑在動(dòng)物模型驗(yàn)證有效果，但是仍未應(yīng)用于臨床。以往研究[8,9]表明，缺血缺氧可以刺激腦內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)的增殖，但是活化的NSCs不能分化成為損傷皮層成熟的神經(jīng)元。褪黑素是一種有效的自由基清除劑及間接抗氧化劑，可以去除單態(tài)氧、超氧陰離子自由基、氫過氧化物、羥自由基和脂質(zhì)過氧化物自由基[10,11]。那么，缺血性腦卒中時(shí)，應(yīng)用褪黑素治療，能否減輕氧化應(yīng)激，從而保護(hù)細(xì)胞以免凋亡，并促進(jìn)新生神經(jīng)元的成熟呢？目前國內(nèi)外鮮見報(bào)道。本研究觀察了褪黑素對(duì)缺血性腦卒中大鼠腦損傷的修復(fù)作用，并探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠36只，雌雄不拘，體質(zhì)量200～220 g，購自蘇州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2 褪黑素、試劑、儀器及圖像軟件 褪黑素(6 mg/mL，15 mg/kg)；TUNEL試劑盒，多克隆抗體(1∶200)，小鼠抗NeuN單克隆抗體(1∶500)，1∶200稀釋鼠抗BrdU單克隆抗體，山羊抗兔IgG(1∶800)，山羊抗小鼠IgG (1∶800)，Alexa Fluor?568標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶1 000)；激光多普勒血流儀(Moor VSM-LDF)，Leica CM1950恒冷箱冰凍切片機(jī)；Image J圖像軟件。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組、模型制備及褪黑素應(yīng)用 36只大鼠隨機(jī)分為藥物組、模型組、對(duì)照組各12只。藥物組、模型組大鼠均制備缺血性腦卒中模型，即應(yīng)用短暫性大腦中動(dòng)脈閉塞(tMCAO)法[12]制備。大鼠麻醉后，在右側(cè)大腦中動(dòng)脈的腔內(nèi)置入經(jīng)硅樹脂包被的尼龍單絲(6-0尼龍)閉塞血管，閉塞60 min后撤回單絲，誘導(dǎo)短暫局灶性腦缺血灌注。通過激光多普勒血流儀測(cè)量局灶性腦血流減少至<20%，表明模型制備成功。對(duì)照組大鼠只暴露動(dòng)脈不閉塞血管。制模過程中和制模后用加熱墊控制大鼠體溫，并保持在37 ℃，直到麻醉大鼠完全恢復(fù)清醒。然后將大鼠放回飼養(yǎng)籠，自由飲水進(jìn)食。tMCAO后72 h內(nèi)沒有動(dòng)物發(fā)生死亡。制模后5 min、24 h、48 h藥物組大鼠尾靜脈注射溶于含有4%酒精生理鹽水的褪黑素(6 mg/mL，15 mg/kg)，模型組制模后各時(shí)點(diǎn)分別給予等量含有4%酒精的生理鹽水。3組大鼠制模后1～3 d連續(xù)尾靜脈注射50 mg/kg的5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU，2次/d)以標(biāo)記新生神經(jīng)元。

1.4 大鼠腦梗死體積估算 采用TTC染色法。制模后28 d，各組取6只大鼠施以麻醉，迅速取新鮮腦，行冠狀位冰凍切片(1 mm)，切片避光置于1%的TTC磷酸鹽緩沖液中，37 ℃下孵育30 min。使用Image J圖像軟件估算腦梗死體積百分比。

1.5 灌注取材 制模后28 d，各組取剩余6只大鼠，麻醉后以4%甲醛灌注取腦，依次以20%、30%蔗糖脫水后，行冠狀位冰凍切片(30 μm)，切片貼于涂有明膠的載玻片上待用，部分用于TUNEL染色，部分用于免疫熒光。

1.6 大鼠腦組織凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù) 采用TUNEL染色法。取上述各組載玻片上的相應(yīng)切片，依據(jù)TUNEL試劑盒的操作說明，進(jìn)行TUNEL染色檢測(cè)凋亡細(xì)胞，使用Image J圖像軟件計(jì)算凋亡指數(shù)(AI)，AI為TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)占觀測(cè)范圍內(nèi)細(xì)胞總數(shù)的百分比。

1.7 大鼠腦組織損傷區(qū)新生神經(jīng)元前體細(xì)胞、新生成熟神經(jīng)元計(jì)數(shù) 采用DCX/BrdU免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè)損傷區(qū)腦組織新生神經(jīng)元前體細(xì)胞數(shù)量,NeuN/BrdU免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè)損傷區(qū)腦組織新生成熟神經(jīng)元數(shù)量。取上述各組載玻片上的相應(yīng)切片，用0.01 mol/L的PBS(pH7.2)漂洗，每張切片滴加10%山羊血清50 μL封閉過夜，之后每張切片滴加稀釋的兔抗DCX的多克隆抗體(1∶200)、小鼠抗NeuN單克隆抗體(1∶500)和1∶200稀釋鼠抗BrdU單克隆抗體50 μL，4 ℃濕盒孵育24 h。用0.01 mol/L的PBS(pH7.2)漂洗3遍，在避光條件下，每張切片滴加Alexa Fluor?488標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶800)、Alexa Fluor?488標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(1∶800)和Alexa Fluor?568標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶1 000)50 μL，4 ℃濕盒孵育24 h。在避光條件下，PBS洗片3遍后，中性甘油封片。先后在激發(fā)光波長為495 nm、吸收光波長為520 nm及激發(fā)光波長為578 nm、吸收光波長為603 nm的熒光顯微鏡下觀察DCX、NeuN與BrdU陽性的免疫熒光細(xì)胞，并攝片。使用Image J圖像軟件計(jì)算400倍視野下DCX/BrdU或NeuN/BrdU免疫熒光雙標(biāo)陽性細(xì)胞數(shù)量百分比。

2 結(jié)果

2.1 各組腦梗死體積比較 藥物組和模型組大鼠腦組織損傷區(qū)域呈灰白色；對(duì)照組大鼠腦組織呈紅色，未見損傷區(qū)域。藥物組、模型組、對(duì)照組大鼠腦梗死體積百分比分別占20.09%±2.17%、32.11%±4.65%、0，藥物組與模型組比較，P<0.05。

2.2 各組腦組織凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)比較 藥物組、模型組、對(duì)照組AI分別為7.51%±1.21%、14.12%±1.89%、1.00%±0.12%，藥物組分別與模型組、對(duì)照組比較，P均<0.05。

2.3 各組新生神經(jīng)元前體細(xì)胞數(shù)量比較 藥物組大鼠腦組織損傷區(qū)域可見到較多的DCX/BrdU雙標(biāo)陽性的神經(jīng)元前體細(xì)胞，模型組腦組織損傷區(qū)域可見到少量DCX/BrdU雙標(biāo)陽性的神經(jīng)元前體細(xì)胞，對(duì)照組大鼠腦組織幾乎未見到DCX/BrdU雙標(biāo)陽性的神經(jīng)元前體細(xì)胞；藥物組、模型組、對(duì)照組DCX/BrdU雙標(biāo)陽性神經(jīng)元前體細(xì)胞分別占14.01%±2.89%、5.02%±1.61%、0，模型組分別與藥物組、對(duì)照組比較，P均<0.05。

2.4 各組新生成熟神經(jīng)元數(shù)量比較 藥物組大鼠腦組織損傷區(qū)域可見到較多的NeuN/BrdU雙標(biāo)陽性的神經(jīng)元，模型組大鼠腦組織損傷區(qū)域可見到少量NeuN/BrdU雙標(biāo)陽性的神經(jīng)元，對(duì)照組大鼠腦組織幾乎未見NeuN/BrdU雙標(biāo)陽性的神經(jīng)元；藥物組、模型組、對(duì)照組NeuN/BrdU雙標(biāo)陽性新生成熟神經(jīng)元分別占10.58%±1.02%、2.25%±0.18%、藥物組與模型組比較，P<0.05。

3 討論

缺血性腦卒中是一種常見但嚴(yán)重的疾病，病死率為15%，多達(dá)25%的患者出現(xiàn)癲癇、腦癱或發(fā)育遲緩，給家庭和社會(huì)造成沉重的負(fù)擔(dān)[13,14]。在細(xì)胞水平上，大腦缺血后啟動(dòng)了一系列生化事件，從氧化代謝到無氧代謝，細(xì)胞內(nèi)鈣的積聚，線粒體功能障礙，自由基的產(chǎn)生和炎癥，從而導(dǎo)致廣泛的細(xì)胞凋亡[15～17]。神經(jīng)元是缺血最敏感的細(xì)胞，表現(xiàn)出選擇性的脆弱性[18,19]。目前，對(duì)于缺血性腦卒中的治療臨床主要以神經(jīng)保護(hù)以及對(duì)癥治療為主，但是缺乏有效的治療手段來修復(fù)受損的腦組織，而且無法達(dá)到根治的目的。這就促使研究人員將NSCs作為潛在的替代丟失細(xì)胞的來源。以前的研究表明，缺血缺氧可以刺激內(nèi)源性NSCs的增殖，但是活化的NSCs不能分化成為損傷皮層成熟的神經(jīng)元[8,9]。因此，如何促進(jìn)增殖的內(nèi)源性NSCs分化為成熟的神經(jīng)元具有重要意義。

褪黑素是一種有效的自由基清除劑及間接抗氧化劑，可以去除單線態(tài)氧、超氧陰離子自由基、氫過氧化物、羥基自由基和脂質(zhì)過氧化物自由基[10,11]。褪黑素通過激活最重要的抗氧化酶包括超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶，并通過提高線粒體電子傳遞的效率而起到間接抗氧化劑的作用[20,21]。褪黑素是一種主要由松果體分泌的親脂性神經(jīng)激素，可以自由穿過胎盤和血腦屏障。因此，褪黑素對(duì)于治療缺血性腦卒中，促進(jìn)神經(jīng)保護(hù)可能具有潛在效力以及低毒性等特點(diǎn)。

以往研究[22～24]表明，缺血缺氧大鼠給予褪黑素治療，梗死體積顯著減少，具有細(xì)胞保護(hù)作用，并且大鼠神經(jīng)行為測(cè)試得到改善。本文結(jié)果顯示，藥物組大鼠腦組織梗死體積較模型組減小，表明褪黑素能夠明顯減少缺血性腦卒中大鼠的腦梗死體積。本文結(jié)果還顯示，藥物組AI高于對(duì)照組，但少于模型組，表明褪黑素可保護(hù)缺血性腦卒中大鼠神經(jīng)細(xì)胞免于凋亡。然而，褪黑素治療的最佳時(shí)機(jī)尚待確定，這需要以后進(jìn)一步的深入探討。文獻(xiàn)[8,9]報(bào)道，缺血可以刺激腦組織內(nèi)源性NSCs的增殖，但是活化的NSCs不能分化成為損傷區(qū)皮層成熟的神經(jīng)元；在分化過程可能因凋亡而失去成熟的機(jī)會(huì)[25]。本文結(jié)果顯示，藥物組DCX/BrdU雙標(biāo)陽性神經(jīng)元前體細(xì)胞多于模型組，表明褪黑素能夠促進(jìn)護(hù)缺血性腦卒中大鼠內(nèi)源性神經(jīng)元前體細(xì)胞發(fā)生。本文結(jié)果還顯示，藥物組NeuN/BrdU雙標(biāo)陽性新生成熟神經(jīng)元多于模型組，表明褪黑素能夠促進(jìn)護(hù)缺血性腦卒中大鼠內(nèi)源性新生神經(jīng)元細(xì)胞的成熟。

總之，褪黑素能減少缺血性腦卒中大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡及減少腦梗死體積，同時(shí)又能夠促進(jìn)內(nèi)源性的神經(jīng)元分化，并促進(jìn)新生神經(jīng)元的成熟，從而促進(jìn)了大鼠缺血性腦卒中的腦損傷修復(fù)。