劉迪，龍謙，羅猛，胡劍，梅宏

(貴州省人民醫(yī)院，貴陽(yáng)550002)

最近研究發(fā)現(xiàn)，侵襲性偽足與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系[1～4]。文獻(xiàn)報(bào)道，腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移早期通常會(huì)形成絲狀偽足、片狀偽足或侵襲性偽足等各種偽足，其中侵襲性偽足因在細(xì)胞運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用而備受關(guān)注[5]。皮層肌動(dòng)蛋白(Cortactin)是由位于染色體11q13區(qū)上的癌基因CTTN所編碼的一種蛋白質(zhì)，可作為致癌物質(zhì)酪氨酸蛋白激酶v-src的底物與微絲激動(dòng)蛋白和致癌性酪氨酸激酶v-Src結(jié)合，從而影響細(xì)胞侵襲以及腫瘤轉(zhuǎn)移灶形成[6]。CTTN基因能夠促進(jìn)食管癌細(xì)胞系的運(yùn)動(dòng)和侵襲[7]，但其CTTN對(duì)非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)侵襲和轉(zhuǎn)移的影響鮮見(jiàn)報(bào)道。2016年1月～2017年1月，本研究觀察了CTTN基因沉默對(duì)NSCLC細(xì)胞侵襲能力的影響，以期為腫瘤靶向治療提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 細(xì)胞：NSCLC A549細(xì)胞(下稱A549細(xì)胞)購(gòu)于美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)。主要試劑：Lipofectamine2000購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司，10% FBS購(gòu)于浙江天杭生物科技股份有限公司，DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司，兔抗Cortactin蛋白一抗購(gòu)于美國(guó)Abcam公司，山羊抗兔二抗、RIPA裂解液購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司，Tritc-鬼筆環(huán)肽購(gòu)于上海翊圣生物科技有限公司，羊抗兔Dyligt488熒光二抗購(gòu)于美國(guó)Abbkine公司，小干擾RNA(siRNA)由廣州市銳博生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成。主要儀器：蛋白成像系統(tǒng)(Fluorchem Q型)購(gòu)于美國(guó)Alpha公司，激光共聚焦顯微鏡(LSM 700型)購(gòu)于德國(guó)ZEISS公司，Transwell小室購(gòu)于美國(guó)Corning公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及CTTN基因沉默 將A549細(xì)胞以含有10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基作為完全培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2條件下進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。待A549細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，將其以1×105個(gè)/mL接種于6孔板，每孔2 mL完全培養(yǎng)基。待細(xì)胞融合至60%左右時(shí)隨機(jī)分為觀察組和對(duì)照組，兩組均采用Lipofectamine2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法分別轉(zhuǎn)染CTTN siRNA、陰性siRNA(siRNA:Lipofectamine2000=5 μL∶5 μL)。作用48 h時(shí)取兩組細(xì)胞，采用Western blotting法檢測(cè)Cortactin相對(duì)表達(dá)量：采用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白。SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳進(jìn)行蛋白分離，冰水浴中100 V電壓下轉(zhuǎn)膜100 min。脫脂奶粉封閉1 h，加入兔抗Cortactin一抗(稀釋比例為1∶3 500)室溫孵育1 h，加入山羊抗兔二抗(稀釋比例為1∶5 000)室溫孵育1 h，加入ECL化學(xué)發(fā)光液后于Fluorchem Q型蛋白成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光，采用Image J軟件分析條帶灰度值。以目的蛋白與內(nèi)參蛋白GAPDH灰度值的比值計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 CTTN基因沉默后細(xì)胞侵襲性偽足數(shù)量檢測(cè) 作用48 h時(shí)取兩組細(xì)胞，于1 mL細(xì)胞懸液中計(jì)數(shù)3 000個(gè)細(xì)胞，加到直徑為15 mm的共聚焦小皿中。細(xì)胞充分貼壁后，4%多聚甲醛固定，0.2% TRIton-X-100破膜。加入兔抗Cortactin蛋白一抗(稀釋比例為1∶1 000)室溫孵育1 h，加入呈綠色熒光的羊抗兔Dyligt488熒光二抗(稀釋比例為1∶2 000)室溫孵育1 h，加入呈紅色熒光的Tritc-鬼筆環(huán)肽5 μg/mL室溫避光孵育30 min。共聚焦顯微鏡下Tritc-鬼筆環(huán)肽標(biāo)記的F-actin和Dyligt488標(biāo)記的Cortactin共定位于細(xì)胞核周圍，并呈現(xiàn)黃色熒光，即為侵襲性偽足。使用LSM700型激光共聚焦顯微鏡隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)算共定位的黃色熒光(侵襲性偽足)細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分率，即侵襲性偽足百分率。

1.4 CTTN基因沉默后細(xì)胞侵襲能力檢測(cè) 采用Transwell小室試驗(yàn)。試驗(yàn)前1天將Matrigel基質(zhì)膠置于4 ℃冰箱中融化過(guò)夜，試驗(yàn)時(shí)用預(yù)冷的槍頭抽取已用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋至1 mg/mL的Matrigel基質(zhì)膠80 μL，鋪于孔徑為8 μm的Transwell小室膜上?；啄に?，取兩組作用48 h的細(xì)胞，從1×106個(gè)/mL密度的無(wú)血清細(xì)胞懸液中抽取200 μL加至Transwell上室。24孔板下室加入700 μL完全培養(yǎng)基。作用24 h后，棄去孔中培養(yǎng)液，甲醇固定20 min；吉姆薩染色20 min，PBS洗滌2遍，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細(xì)胞。200倍顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)穿過(guò)基底膜的細(xì)胞。

2 結(jié)果

2.1 兩組Cortactin相對(duì)表達(dá)量比較 觀察組與對(duì)照組Cortactin相對(duì)表達(dá)量分別為0.17±0.02、0.79±0.15，兩組比較P<0.05。

2.2 兩組細(xì)胞侵襲性偽足數(shù)量比較 觀察組與對(duì)照組侵襲性偽足百分率分別為(22.37±4.80)%、(71.46±8.90)%，兩組比較P<0.05。

2.3 兩組細(xì)胞侵襲能力比較 觀察組與對(duì)照組穿過(guò)基底膜的細(xì)胞數(shù)分別為(51±10)、(220±27)個(gè)，兩組比較P<0.05。

3 討論

細(xì)胞偽足是腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的主要工具，尤其是侵襲性偽足在細(xì)胞運(yùn)動(dòng)過(guò)程中具有重要作用。肌動(dòng)蛋白是細(xì)胞偽足的主要組成部分，也是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的主要參與蛋白[8]。有研究通過(guò)免疫熒光標(biāo)記的方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，肌動(dòng)蛋白構(gòu)成的蛋白微絲明顯富集于細(xì)胞偽足[9]。另有文獻(xiàn)采用活體熒光標(biāo)記肌動(dòng)蛋白，證實(shí)微絲骨架在侵襲性腫瘤細(xì)胞偽足前沿的延展和形態(tài)構(gòu)建中發(fā)揮重要作用[10]。CTTN基因編碼的Cortactin是一種微絲肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，可與肌動(dòng)蛋白微絲的側(cè)面結(jié)合，并直接參與細(xì)胞骨架的成型[11]。目前研究發(fā)現(xiàn)，Cortactin是連接細(xì)胞骨架重建信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子，在調(diào)控細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、侵襲性以及腫瘤轉(zhuǎn)移灶形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用[12];Cortactin廣泛分布于諸如層狀偽足、侵襲性偽足和細(xì)胞膜皺褶等[13]；Cortactin參與了眾多以肌動(dòng)蛋白為基礎(chǔ)的過(guò)程，包括細(xì)胞極性、偽足形成、細(xì)胞黏附和運(yùn)動(dòng)等[14]；在病理情況下，如腫瘤分化、侵襲和轉(zhuǎn)移等，組織Cortactin表達(dá)異常升高[15]。

本研究采用siRNA將CTTN基因進(jìn)行特異性沉默，結(jié)果顯示觀察組Cortactin相對(duì)表達(dá)量明顯低于對(duì)照組，不僅表明CTTN基因確實(shí)編碼Cortactin蛋白，并證實(shí)本研究采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法成功沉默CTTN基因。本研究結(jié)果顯示，觀察組侵襲性偽足及穿過(guò)基底膜的細(xì)胞數(shù)均明顯低于對(duì)照組，表明觀察組細(xì)胞侵襲性偽足形成被抑制，細(xì)胞侵襲能力降低。說(shuō)明CTTN基因在細(xì)胞的侵襲過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用，沉默CTTN基因可通過(guò)減少A549細(xì)胞侵襲性偽足的產(chǎn)生而降低其細(xì)胞侵襲能力。但本研究只是通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)CTTN基因參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)與侵襲，其在動(dòng)物模型及臨床出現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移患者中的表達(dá)變化與作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

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