溫建麟，黃鋒，曾志羽

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧530021)

隨著冠狀動(dòng)脈介入術(shù)、溶栓、冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)等再灌注治療的不斷發(fā)展和廣泛應(yīng)用，挽救了大量冠心病尤其是急性心肌梗死患者的生命。然而在臨床中，缺血心肌在梗死相關(guān)血管開通后可能導(dǎo)致比血管閉塞時(shí)更嚴(yán)重的急性損傷，患者出現(xiàn)惡性心律失常、無(wú)復(fù)流和心肌頓抑現(xiàn)象，致使心肌壞死面積擴(kuò)大甚至死亡，即心肌缺血再灌注損傷(MIRI)[1]。MIRI減弱了缺血心肌再灌注的效益，成為了冠心病預(yù)防與治療過(guò)程中亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題。但是MIRI的確切機(jī)制尚未明確，目前認(rèn)為與自由基的作用、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、白細(xì)胞的激活及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等因素密切相關(guān)。而最新有研究表明，線粒體自噬與心肌缺血再灌注密切相關(guān)，線粒體自噬的相關(guān)分子通路被認(rèn)為是一個(gè)潛在的缺血性心臟病再灌注治療中的干預(yù)靶點(diǎn)。因此，本文將對(duì)線粒體自噬與MIRI的關(guān)系作一綜述。

1 線粒體自噬

自噬是一種通過(guò)溶酶體降解長(zhǎng)壽蛋白和細(xì)胞器的代謝途徑[2]，以此途徑機(jī)體可維持自身結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和功能正常。自噬不單是細(xì)胞保守的防御機(jī)制，也是細(xì)胞程序性死亡的一種機(jī)制，與機(jī)體許多病理或生理進(jìn)程密切相關(guān)。根據(jù)細(xì)胞內(nèi)底物運(yùn)送到溶酶體腔的方式不同，可以分為大自噬、小自噬等非選擇性自噬；自噬也可以是選擇性的，比如線粒體自噬、過(guò)氧化物酶體自噬、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬和核糖體自噬等[3]。不同的自噬途徑又有著不同的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，但是其具體的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)并沒有完全闡明，線粒體自噬是研究得較多的一種自噬途徑。

線粒體是真核細(xì)胞有氧呼吸的主要場(chǎng)所，通過(guò)氧化磷酸化的方式為細(xì)胞提供能量，有“能量工廠”之稱。同時(shí)線粒體也是細(xì)胞凋亡的調(diào)控中心和活性氧產(chǎn)生的場(chǎng)所，因?yàn)樵诰€粒體產(chǎn)生能量的同時(shí)，也會(huì)產(chǎn)生活性氧自由基(ROS)，ROS過(guò)度積累，可以攻擊線粒體DNA，從而損傷線粒體，導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)和功能紊亂。線粒體對(duì)缺血、缺氧等環(huán)境較為敏感，當(dāng)心肌缺血時(shí)，三磷酸腺苷(ATP)的缺乏影響了Ca2+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性，線粒體內(nèi)鈣超載導(dǎo)致Ca2+依賴性離子通道開放，從而使得線粒體膜通透性改變，其膜間隙內(nèi)的促凋亡蛋白會(huì)釋放至胞漿，通過(guò)一系列復(fù)雜的機(jī)制，最終引起細(xì)胞發(fā)生凋亡。

線粒體自噬作為一種選擇性自噬，是細(xì)胞內(nèi)清除損傷或過(guò)多線粒體的過(guò)程[4]，指在缺血、缺氧、氧化應(yīng)激和衰老等刺激下，細(xì)胞內(nèi)的線粒體發(fā)生去極化損傷，從而激活自噬體-溶酶體途徑，完成受損線粒體的降解，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的過(guò)程。因此，及時(shí)清除受損或過(guò)多的線粒體對(duì)機(jī)體細(xì)胞正常功能的維持至關(guān)重要，而真核生物主要通過(guò)激活線粒體自噬途徑來(lái)清除積累或者損傷的線粒體。根據(jù)線粒體自噬過(guò)程的特征，將線粒體自噬分為前期、早期、中期和末期四個(gè)時(shí)期，各個(gè)時(shí)期都有不同的特點(diǎn)。前期：線粒體自噬相關(guān)蛋白的活化；早期：線粒體自噬小體形成；中期：形成線粒體自噬溶酶體；末期：線粒體被溶酶體降解。參與這個(gè)過(guò)程的蛋白主要有：編碼線粒體外膜激酶(PINK1)、E3泛素連接酶(Parkin)、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(BCL2)和腺病毒相互作用蛋白3(BNIP3)、自噬相關(guān)基因(Atg)蛋白和Uthl蛋白。其中PINK1及Parkin蛋白：誘導(dǎo)線粒體自噬的發(fā)生，清除過(guò)多或損傷的線粒體，維持線粒體結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定；定位于線粒體外膜的BNIP3蛋白在發(fā)育過(guò)程中線粒體自噬的清除發(fā)揮了重要的作用；Atg蛋白系統(tǒng)主要作用是參與早期線粒體自噬體的形成；Uthl蛋白是線粒體內(nèi)蛋白質(zhì)，其基因突變或者缺失都會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞不能清除受損傷或者衰老的線粒體。因此線粒體自噬過(guò)程中各個(gè)時(shí)期的協(xié)同作用，也需要相關(guān)的分子機(jī)制來(lái)調(diào)控。

2 MIRI激活線粒體自噬的分子機(jī)制

目前廣泛認(rèn)可的介導(dǎo)哺乳動(dòng)物線粒體自噬的通路主要是由PINK1及Parkin介導(dǎo)的、BNIP3及其家族成員BNIP3a(又稱Nix)、FUNDC1等線粒體自噬受體介導(dǎo)的線粒體自噬[5]。而MIRI介導(dǎo)線粒體自噬主要通過(guò)以下幾條分子通路。

2.1 PINK1-Parkin經(jīng)典途徑 PINK1-Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬是哺乳動(dòng)物細(xì)胞線粒體自噬最常見的方式。正常狀態(tài)下，PINK1進(jìn)入線粒體后，被線粒體內(nèi)膜蛋白酶剪切并最終被降解，在細(xì)胞內(nèi)維持低水平的PINK1。MIRI時(shí)，ROS損傷線粒體，線粒體去極化可抑制PINK1向線粒體運(yùn)輸，完整的PINK1聚集在線粒體外膜，招募Parkin到受損的線粒體上，并通過(guò)對(duì)Parkin和泛素磷酸化激活Parkin E3連接酶活性。然后，Parkin泛素化線粒體外膜融合蛋白1和線粒體外膜融合蛋白2等使線粒體泛素化[6]。泛素結(jié)合蛋白p62識(shí)別泛素化線粒體基質(zhì)蛋白，并通過(guò)與自噬相關(guān)蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)結(jié)合，把線粒體輸送到自噬泡，促進(jìn)線粒體降解[7]。

2.2 線粒體自噬受體介導(dǎo)的線粒體自噬途徑 線粒體自噬受體蛋白，具有與LC3反應(yīng)的特征性氨基酸序列模體，受體蛋白通過(guò)模體募集、結(jié)合LC3，從而介導(dǎo)線粒體自噬的發(fā)生[8, 9]。目前發(fā)現(xiàn)的線粒體自噬相關(guān)受體包括BNIP3、Nix和FUNDC1，其在線粒體自噬的激活過(guò)程中發(fā)揮重要作用。BNIP3屬于BCL2家族的一類非典型的、僅有BH3結(jié)構(gòu)域的促凋亡蛋白家族成員，主要定位于線粒體外膜，可促進(jìn)線粒體自噬與細(xì)胞凋亡的發(fā)生。Nix是線粒體膜表面的結(jié)合蛋白，與BNIP3同源。BNIP3、Nix在正常生理?xiàng)l件下低表達(dá)，但在心肌缺血過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)BNIP3、Nix表達(dá)上調(diào)，誘導(dǎo)線粒體自噬發(fā)生，維持細(xì)胞正常的功能。BNIP3、Nix調(diào)控線粒體自噬主要有以下幾個(gè)方面：Nix可調(diào)控Parkin向線粒體轉(zhuǎn)移，激活PINK1-Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬，與PINK1-Parkin途徑共同作用激活線粒體自噬[10]。作為Bcl-2家族成員，Nix可能與參與自噬泡生成的重要蛋白Beclin-1競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合Bcl-2或Bcl-XL,導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)中游離的Beclin-1增加,進(jìn)而誘導(dǎo)自噬發(fā)生。同時(shí)Nix也可以作為自噬受體招募Atg8 蛋白家族啟動(dòng)線粒體自噬。FUNDC1是存在于線粒體外膜上的三次跨膜蛋白。FUNDC1主要參與低氧及線粒體膜電勢(shì)降低引起的線粒體自噬，但是其介導(dǎo)線粒體自噬具體機(jī)制并未明確。有研究表明，在正常情況下，F(xiàn)UNDC1被第13位絲氨酸的激酶(CK2)和第18位酪氨酸的激酶(Src)磷酸化，磷酸化的FUNDC1與LC3 相互作用減弱，表現(xiàn)為對(duì)線粒體自噬起到抑制的作用；而在心肌缺血時(shí)，去磷酸化的FUNDC1和LC3 相互作用增強(qiáng)，介導(dǎo)線粒體自噬的發(fā)生[11]。同時(shí)Chen等[12]也發(fā)現(xiàn)FUNDC1與視神經(jīng)萎縮蛋白和動(dòng)力蛋白基因結(jié)合可以引起線粒體膜蛋白裂解，這也說(shuō)明FUNDC1參與了線粒體自噬的發(fā)生。

3 線粒體自噬對(duì)心肌缺血再灌注的作用

在心肌缺血/再灌注損傷過(guò)程中，心肌細(xì)胞內(nèi)的線粒體在缺氧等刺激下產(chǎn)生活性氧增多，啟動(dòng)氧化應(yīng)激，進(jìn)一步造成線粒體損傷，而損傷的線粒體又會(huì)產(chǎn)生更多ROS，形成惡性循環(huán)，并有可能啟動(dòng)線粒體相關(guān)凋亡通路，從而造成細(xì)胞凋亡與壞死，加重MIRI。研究表明，適當(dāng)增強(qiáng)線粒體自噬功能可減輕MIRI，而損傷線粒體的數(shù)量超過(guò)線粒體自噬的清除能力，或者線粒體自噬發(fā)生缺陷，細(xì)胞則會(huì)啟動(dòng)死亡程序，加重MIRI損傷程度[13,14]。線粒體自噬在MIRI中是保護(hù)作用還是損傷作用，目前并沒有一致的看法。

3.1 線粒體自噬在MIRI中的有利作用 心臟組織是高耗能組織，心肌缺血再灌注會(huì)損傷線粒體，線粒體功能障礙是導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡的主要原因。線粒體自噬能通過(guò)自噬-溶酶體降解途徑特異性的降解受損傷的線粒體，維持線粒體內(nèi)氧自由基水平，防止活性氧、線粒體膜蛋白等造成線粒體內(nèi)容物的釋放從而激活細(xì)胞凋亡和壞死途徑。因此，線粒體自噬被認(rèn)為在MIRI中起到重要的保護(hù)作用。Yan 等[15]對(duì)豬的慢性心肌缺血模型進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)自噬現(xiàn)象的增加與心肌細(xì)胞的凋亡率下降有關(guān)。Loos 等研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞自噬現(xiàn)象輕度缺血時(shí)增加，而線粒體自噬對(duì)細(xì)胞膜的完整性具有保護(hù)作用，同時(shí)也對(duì)保持線粒體正常膜電位起著重要作用，這可降低細(xì)胞不可逆損傷。有研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠心肌梗死模型中，在急性期內(nèi)，發(fā)現(xiàn)Parkin易位至損傷的線粒體，并介導(dǎo)線粒體蛋白進(jìn)行泛素化降解。同時(shí)利用敲除Parkin基因的小鼠構(gòu)建心肌梗死模型，發(fā)現(xiàn)缺乏Parkin能夠抑制急慢性期心肌梗死后線粒體自噬的發(fā)生，導(dǎo)致線粒體功能障礙加重，心肌梗死范圍大、病死率高。上述研究均提示Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬在MIRI中起到保護(hù)心肌的作用。

3.2 線粒體自噬在MIRI中的有害作用 心肌細(xì)胞正常的代謝與功能與線粒體功能正常發(fā)揮密切相關(guān)，但如果缺血缺氧等刺激過(guò)度激活線粒體自噬則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)線粒體的清除過(guò)度，線粒體結(jié)構(gòu)和功能紊亂，加重心肌細(xì)胞損傷。心肌缺血再灌注過(guò)程中，過(guò)度激活的線粒體自噬-溶酶體蛋白降解系統(tǒng)使細(xì)胞內(nèi)重要蛋白和細(xì)胞器降解，形成細(xì)胞的不可逆性損傷，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡，但是其具體的發(fā)生機(jī)制并未明確。有實(shí)驗(yàn)證明，在心肌細(xì)胞缺血再灌注過(guò)程中，使用3-甲基腺嘌呤自噬抑制劑、下調(diào)或敲除Beclin-1等手段來(lái)抑制線粒體自噬，可使心肌細(xì)胞死亡率降低。此外研究發(fā)現(xiàn)， Beclin-1是再灌注階段調(diào)節(jié)自噬的關(guān)鍵因子，Bcl-2下調(diào)會(huì)影響其活性，進(jìn)而加劇激活細(xì)胞凋亡，加重MIRI。

以上研究結(jié)果提示，心肌缺血、缺氧過(guò)程中線粒體功能紊亂在MIRI中有著重要的作用，而線粒體自噬能清除損傷的線粒體，減輕心肌缺血再灌注過(guò)程中的氧化應(yīng)激及自由基的產(chǎn)生，進(jìn)而緩解MIRI，但是過(guò)度的線粒體自噬卻可以激活細(xì)胞凋亡等途徑加重MIRI，因此，推測(cè)適度增強(qiáng)線粒體自噬改善線粒體功能是防治MIRI有效途徑之一。

綜上所述，線粒體自噬與MIRI密切相關(guān)。心肌缺血再灌注時(shí)，主要通過(guò)介導(dǎo)PINK1-Parkin、Nix、BNIP3 和FUNDC1等分子通路激活線粒體自噬，適度的線粒體自噬對(duì)線粒體膜電位的維持以及細(xì)胞膜正常結(jié)構(gòu)和功能具有保護(hù)作用，從而減輕MIRI；而線粒體功能障礙導(dǎo)致自噬功能受損清除不足或過(guò)度激活的線粒體自噬，可以加重MIRI。

參考文獻(xiàn)：

[1] Hansenloy DJ, Derek M. Myocardial ischemia-reperfusion injury: a neglected therapeutic target [J]. J ClinInves, 2013,123(1):92-100.

[2] Yu P, Zhang J, Yu S, et al. Protective effect of sevoflurane postconditioning against cardiac ischemia/reperfusion injury via ameliorating mitochondrial impairment, oxidative stress and rescuing autophagic clearance[J]. PLoS One, 2015,10(8):e0134666.

[3] Murrow L, Debnath J. Autophagy as a stress-response and quality-control mechanism: implications for cell injury and human disease[J]. Ann Rev Pathol, 2013,8:105-137.

[4] Bueno M, Lai YC, Romero Y, et al. PINK1 deficiency impairs mitochondrial homeostasis and promotes lung fibrosis[J]. J Clin Invest, 2015,125(2):521-538.

[5] Youle RJ, Narendra DP. Mechanisms of mitophagy[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2011,12(1):9-14.

[6] Sun N, Wang H, Wang L. Protective effects of ghrelin against oxidative stress, inducible nitric oxide synthase and inflammation in a mouse model of myocardial ischemia/reperfusion injury via the HMGB1 and TLR4/NF-κB pathway[J]. Mol Med Rep,2016,14(3):2764-2770.

[7] Song J, Liu Q, Tang H, et al. Activation of PI3Kγ/Akt pathway increases cardiomyocyte HMGB1 expression in diabetic environment[J]. Oncotarget, 2016,7(49):80803-80810.

[8] Novak I, Kirkin V, McEwan DG, et al. Nix is a selective autophagy receptor for mitochondrial clearance[J]. EMBO Rep, 2010,11(1):45-51.

[9] Liu L, Feng D, Chen G, et al. Mitochondrial outer-membrane protein FUNDC1 mediates hypoxia-induced mitophagy in mammalian cells[J]. Nat Cell Biol, 2012,14(2):177-185.

[10] Ding WX, Ni HM, Li M, et al. Nix is critical to two distinct phases of mitophagy, reactive oxygen species-mediated autophagy induction and Parkin-ubiquitin-p62-mediated mitochondrial priming[J]. J Biol Chem, 2010,285(36):27879-27890.

[11] Liu L, Feng D, Chen G, et al. Mitochondrial outer-membrane protein FUNDC1 mediates hypoxia-induced mitophagy in mammalian cells[J]. Nat Cell Biol, 2012,14(2):177-185.

[12] Chen M, Chen Z, Wang Y, et al. Mitophagy receptor FUNDC1 regulates mitochondrial dynamics and mitophagy[J]. Autophagy, 2016,14(2):689-702.

[13] Lam CK, Zhao W, Liu GS, et al. HAX-1 regulates cyclophilin-D levels and mitochondria permeability transition pore in the heart[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2015,112(47):E6466-E6475.

[14] Mukherjee UA, Ong SB, Ong SG, et al. Parkinson's disease proteins: Novel mitochondrial targets for cardioprotection[J]. PharmacolTher, 2015,156:34-43.

[15] Yan L, Vatner DE, Kim SJ, et al. Autophagy in chronically ischemic myocardium[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2005,102(39):13807-13812.