趙永超，石蓓

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，貴州遵義563000)

我國步入老年化社會，缺血性心肌病發(fā)病率及病死率居高不下，目前臨床上治療手段主要有藥物治療、支架置入術(shù)、冠脈搭橋等，然而這些傳統(tǒng)技術(shù)僅能挽救瀕危的心肌細(xì)胞，并不能使梗死的心肌細(xì)胞再生。胚胎干細(xì)胞、成體干細(xì)胞以及骨髓源性干細(xì)胞在臨床上的應(yīng)用為缺血性心肌病患者帶來曙光。干細(xì)胞具有多向分化特性，可通過分化為特定細(xì)胞譜系的特異組織發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。目前研究較多的干細(xì)胞可分為胚胎干細(xì)胞[1]、多能干細(xì)胞[2]、成體干細(xì)胞[1,3]三大類，而成體干細(xì)胞根據(jù)組織來源又可細(xì)分為間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)、內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)、心臟祖/干細(xì)胞(CPCs/CSCs)。迄今為止，因為成體干細(xì)胞提取自自體組織，所以具有倫理壓力及免疫排斥較小、易于分離提取等優(yōu)勢，使得成體干細(xì)胞廣泛應(yīng)用于心肌梗死后心臟再生治療。干細(xì)胞治療雖然能明顯改善心肌梗死后心臟功能，但是其具有致畸作用、排斥反應(yīng)等危險，并且干細(xì)胞獲取困難、移植細(xì)胞定植率低、難以增殖分化等困難，使得干細(xì)胞臨床應(yīng)用受限。至今，越來越多的實驗及臨床研究提示[2, 4]，干細(xì)胞移植后主要通過旁分泌途徑分泌外泌體作用于受損區(qū)域的內(nèi)源性成體CSCs/心肌細(xì)胞，發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡、抗纖維化形成、促進(jìn)血管新生、促進(jìn)心肌細(xì)胞分化進(jìn)而改善心功能。

1 外泌體的生物學(xué)特征

既往人們認(rèn)為外泌體是細(xì)胞排泄廢物的重要機(jī)制之一，然而近年研究表明，外泌體是細(xì)胞與細(xì)胞之間進(jìn)行信息交流的重要媒介物質(zhì)。外泌體[5]是一類由哺乳動物細(xì)胞通過旁分泌方式分泌的天然的內(nèi)源性納米級囊泡(直徑30～100 nm)，可通過超速離心法或試劑盒法等多種方法從細(xì)胞條件培養(yǎng)基及多種體液(如血液、唾液、汗液、淚液、精液、尿液等)中分離提取。外泌體由細(xì)胞芽生而成，其質(zhì)膜上會表達(dá)一些保守蛋白，如跨膜蛋白(CD9、CD63、CD81等)，此外根據(jù)細(xì)胞的不同來源外泌體膜上還可能攜帶某些細(xì)胞特異性膜蛋白，如MSCs來源的外泌體可能攜帶CD29分子。外泌體可攜帶多種信息成分，包括蛋白質(zhì)因子、脂質(zhì)體、基因片段、非編碼RNA等，需要特別提出的是，其分子成分與水平變化隨來源細(xì)胞類型、大小、分化階段及其所處微環(huán)境的不同而存在差異。外泌體通過抗體配體配對機(jī)制被靶細(xì)胞識別、內(nèi)化或以質(zhì)膜融合方式，將其攜帶的遺傳信息分子傳遞給靶細(xì)胞，影響其生物學(xué)進(jìn)程。

2 干細(xì)胞非細(xì)胞治療

干細(xì)胞治療逐漸被批準(zhǔn)進(jìn)入臨床實驗，目前發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞治療能夠明顯改善心肌梗死后心臟功能，但也面臨諸多問題與輿論壓力，例如干細(xì)胞移植具有致畸作用、排斥反應(yīng)等危害，并且面臨惡劣微環(huán)境的移植細(xì)胞定植率低、存活率低等難題。

Lai等[6]首次將人胚胎干細(xì)胞來源的MSCs條件培養(yǎng)液注射至急性心肌梗死動物模型中，發(fā)現(xiàn)可顯著改善心肌梗死后后心臟功能且心肌梗死面積明顯減小，這說明了干細(xì)胞治療缺血性心肌病可能并非通過干細(xì)胞的遷移、增殖、分化過程起作用，而是通過分泌某些效應(yīng)分子影響心肌梗死區(qū)域內(nèi)源性細(xì)胞起心臟修復(fù)作用。為進(jìn)一步探討其潛在機(jī)制，該團(tuán)隊從培養(yǎng)液中提取出一種膜性囊泡并對其進(jìn)行鑒定，最后將其命名為外泌體。該項研究為心肌梗死后干細(xì)胞的非細(xì)胞治療策略奠定了重要的理論及實驗基礎(chǔ)。

隨后越來越多干細(xì)胞研究學(xué)者將眼光移向外泌體，研究發(fā)現(xiàn)多種干細(xì)胞、成熟細(xì)胞都具有旁分泌外泌體特性，且外泌體很可能是細(xì)胞與細(xì)胞間傳遞信號的載體。心肌細(xì)胞面臨應(yīng)激環(huán)境可分泌含特定遺傳信息的外泌體，干細(xì)胞將外泌體內(nèi)化后誘導(dǎo)其表型定向重組以適應(yīng)應(yīng)激；而干細(xì)胞也可分泌外泌體，致?lián)p傷心肌細(xì)胞中抗凋亡基因上調(diào)、促凋亡基因下調(diào)，從而抑制損傷心肌細(xì)胞凋亡、促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖及心肌梗死區(qū)域血管新生。簡而言之，損傷心肌細(xì)胞與干細(xì)胞間信息交流是雙向的。那么，干細(xì)胞來源的外泌體是如何促進(jìn)心肌梗死后心臟修復(fù)的呢，可能主要通過以下機(jī)制起作用。

2.1 外泌體促進(jìn)心肌細(xì)胞存活 正常條件下，功能性心肌細(xì)胞中三磷酸腺苷(ATP)的合成主要通過脂肪酸β氧化磷酸化產(chǎn)生，然而在缺血缺氧環(huán)境下，心肌細(xì)胞氧化磷酸化途徑受抑制，ATP生成急劇減少，嚴(yán)重制約了ATP依賴性的離子泵、基因轉(zhuǎn)錄、蛋白合成等諸多生物途徑進(jìn)程，最終可導(dǎo)致心肌細(xì)胞功能異常甚至細(xì)胞凋亡。有學(xué)者在研究糖尿病性心臟病的過程中發(fā)現(xiàn)[7]，無糖預(yù)處理心肌細(xì)胞可促進(jìn)心肌細(xì)胞通過旁分泌途徑分泌外泌體。心肌細(xì)胞來源的外泌體被內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)化后，將大量促進(jìn)糖轉(zhuǎn)運及糖酵解相關(guān)信息分子傳遞至內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)丙酮酸合成，進(jìn)而提高氧化應(yīng)激狀態(tài)下內(nèi)皮細(xì)胞的應(yīng)激閾。雖然該研究主要是糖尿病性心臟病個體的心肌細(xì)胞來源的外泌體作用于內(nèi)皮細(xì)胞，然而我們不難推測，在缺血性心肌病個體中損傷心肌細(xì)胞也可能借助外泌體作為載體將促糖轉(zhuǎn)運及糖酵解相關(guān)信息分子傳遞至梗死邊緣區(qū)心肌細(xì)胞，進(jìn)而促進(jìn)應(yīng)激狀態(tài)下心肌細(xì)胞糖酵解途徑、發(fā)揮心臟保護(hù)作用。

眾所周知，在缺血缺氧條件下，ATP嚴(yán)重不足，鈣調(diào)節(jié)異常、鈣超載形成，最終可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。miRNA-199a/214家族是缺氧誘導(dǎo)型miRNAs重要組成部分，在心肌缺血及心力衰竭狀態(tài)下呈高表達(dá)水平[8]。研究表明，EPCs所分泌的外泌體中富含miRNA-214[9]，Aurora等[10]也報道，miRNA-214可通過調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞鈣平衡相關(guān)基因表達(dá)，如鈉鈣交換蛋白1、細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)子、鈣調(diào)節(jié)蛋白Ⅱdeta、親環(huán)素D等，進(jìn)而抑制鈣超載，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-214還可能通過調(diào)控PTEN/PI3K/Akt信號通路對抗氧化應(yīng)激狀態(tài)下心肌細(xì)胞損傷[11]。此外，過表達(dá)GATA4的MSCs來源外泌體通過上調(diào)miRNA-19a激活A(yù)kt及Erk信號通路起到心肌細(xì)胞保護(hù)作用[12]。

Nakazato等[13]發(fā)現(xiàn)在氧化應(yīng)激狀態(tài)下心臟組織內(nèi)源性纖維母細(xì)胞來源外泌體可經(jīng)PKC信號通路調(diào)控心肌細(xì)胞線粒體ATP敏感性鉀離子通道，發(fā)揮心肌保護(hù)作用，增加心肌細(xì)胞存活率。此外，CPCs來源外泌體通過抑制凋亡執(zhí)行因子Caspase 3/7活化，進(jìn)而抑制心肌細(xì)胞凋亡[14]。

2.2 外泌體促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及血管新生 盡管干細(xì)胞移植治療對處于氧化應(yīng)激狀態(tài)下的心肌細(xì)胞保護(hù)作用顯著，然而急性心肌梗死后心肌梗死邊緣區(qū)僅有極少數(shù)細(xì)胞存活。心臟缺血性損傷后，心肌細(xì)胞凋亡/死亡、心臟代償/修復(fù)，終將導(dǎo)致心室重塑、心梗區(qū)瘢痕形成，那么促進(jìn)梗死區(qū)域血管新生的干細(xì)胞效應(yīng)顯得尤為重要。

成年哺乳動物心臟中含有固有CPCs/CSCs,具有與心臟細(xì)胞相似的遺傳背景[15]。CPCs源外泌體可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移，并且通過上調(diào)miRNA-132及miRNA-146a促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞管腔形成[14]。miRNA-146與TGF-β協(xié)同作用抑制p120RasGAP表達(dá)，隨后Ras通路活化，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)換[16]；另外miRNA-146a還能通過抑制CARD10進(jìn)而激活NF-κB信號通路[17]。除了miRNA-132及miRNA-146a參與內(nèi)皮細(xì)胞遷移及血管形成進(jìn)程外，miRNA-320、miRNA-31等亦參與其中，有研究表明，心肌細(xì)胞源性外泌體中miRNA-320與miRNA-216產(chǎn)生拮抗效應(yīng)，被內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)化后通過平衡IGF-1, Hsp20及Ets-2信號通路，進(jìn)而調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞增殖及血管新生等生物學(xué)進(jìn)程；脂肪MSCs來源的外泌體通過miRNA-31上調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子-1α平，促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞遷移及管腔形成。此外，外泌體中還攜帶大量效應(yīng)蛋白，如促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子合成、活化NF-κB信號通路，進(jìn)而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移及血管形成。

除了CSCs源性外泌體具有促進(jìn)細(xì)胞遷移、血管新生效應(yīng)外，多種干細(xì)胞來源的外泌體亦有相似作用。Bian等通過缺氧預(yù)處理MSCs促進(jìn)外泌體分泌，將外泌體注射進(jìn)急性心肌梗死動物模型中發(fā)現(xiàn)梗死邊緣區(qū)毛細(xì)血管密度增加，體外研究進(jìn)行驗證，發(fā)現(xiàn)缺氧預(yù)處理的MSCs源性外泌體可促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞血管形成，新近亦有報道稱EPCs源性外泌體也具有EPCs促血管的新生效應(yīng)[9]。

多數(shù)哺乳動物細(xì)胞可分泌外泌體，包括干細(xì)胞、體細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等，它存在于多種體液中，細(xì)胞與細(xì)胞間以外泌體為載體進(jìn)行信息交流。越來越多的實驗研究及臨床應(yīng)用已證實多種干細(xì)胞的外泌體可被靶細(xì)胞內(nèi)化后，改變其生物學(xué)進(jìn)程，進(jìn)而保護(hù)急性缺血缺氧的心臟。近些年，雖然干細(xì)胞移植治療日益成熟，但仍無法避免人倫輿論壓力及致畸致瘤、免疫排斥反應(yīng)、肺栓塞等危害以及移植率、存活率低等難題，并且干細(xì)胞移植后還需進(jìn)行常規(guī)藥物治療，最終無法區(qū)分干細(xì)胞治療與藥物治療為心臟功能改善貢獻(xiàn)孰重孰輕。

近些年，在心肌梗死后心臟再生醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中干細(xì)胞源性外泌體研究熱度持續(xù)升溫。大量研究表明，不同種類來源的外泌體具有干細(xì)胞相似效應(yīng)，可通過促進(jìn)促進(jìn)細(xì)胞遷移、促進(jìn)血管新生、抗細(xì)胞凋亡、抗炎癥等效應(yīng)。在心肌細(xì)胞間、心肌層間以及心肌組織與其他組織間，外泌體作為重要的細(xì)胞間信息交流媒介參與細(xì)胞的各種生物學(xué)進(jìn)程。外泌體根據(jù)其不同細(xì)胞來源可攜帶細(xì)胞特異性信息分子(包括蛋白因子、miRNAs、lncRNAs、脂質(zhì)體以及基因片段)以及特異性膜受體，并且對低滲微環(huán)境耐受，可在細(xì)胞間高效傳遞信息，其作為心肌梗死后干細(xì)胞非細(xì)胞治療新策略無可厚非。

臨床推廣前需解決的問題可能為：①干細(xì)胞來源是否符合倫理及其獲取的難易程度；②如何從干細(xì)胞中獲取大量外泌體，如缺氧誘導(dǎo)、基因修飾及表觀遺傳修飾等；③目前外泌體提取技術(shù)多為超速離心法或試劑盒法，需挖掘高效且快速提取的新方法；④外泌體內(nèi)成分復(fù)雜，需進(jìn)一步了解各種效應(yīng)成分之間的作用及其機(jī)制；⑤即便大量臨床前實驗已證明外泌體治療缺血性心肌病的安全性，但仍需進(jìn)一步考察，如外泌體干預(yù)后畸胎瘤的發(fā)生等。總之，雖然外泌體在動物研究中取得了巨大成果，但若將其向臨床推廣還需要大量基礎(chǔ)及臨床研究進(jìn)一步探索。

參考文獻(xiàn)：

[1] Xiong Q, Ye L, Zhang P, et al. Bioenergetic and functional consequences of cellular therapy activation of endogenous cardiovascular progenitor Cells[J]. Circ Res, 2012,111(4):455-468.

[2] Zhang L, Guo J, Zhang P, et al. Derivation and high engraftment of patient-specific cardiomyocyte sheet using induced pluripotent stem cells generated from adult cardiac fibroblast[J]. Circ Heart Fail, 2015,8(1):156-166.

[3] Williams AR, Hatzistergos KE, Addicott B, et al. Enhanced effect of combining human cardiac stem cells and bone marrow mesenchymal stem cells to reduce infarct size and to restore cardiac function after myocardial infarction[J]. Circulation, 2013,127(2):213-223.

[4] Gao LR, Chen Y, Zhang NK, et al. Intracoronary infusion of Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells in acute myocardial infarction: double-blind, randomized controlled trial[J]. BMC Med, 2015,13(1):162.

[5] Tkach M, Théry C. Communication by extracellular vesicles: Where we are and where we need to go[J]. Cell, 2016,164(6):1226-1232.

[6] Lai RC, Arslan F, Lee MM, et al. Exosome secreted by MSC reduces myocardial ischemia/reperfusion injury[J]. Stem Cell Res, 2010,4(3):214-222.

[7] Garcia NA, Moncayo-Arlandi J, Sepulveda P, et al. Cardiomyocyte exosomes regulate glycolytic flux in endothelium by direct transfer of GLUT transporters and glycolytic enzymes[J]. Cardiovasc Res, 2016,109(3):397-408.

[8] Duan Q, Yang L, Gong W, et al. MicroRNA-214 Is Upregulated in Heart Failure Patients and Suppresses XBP1-Mediated Endothelial Cells Angiogenesis[J]. J Cell Physiol, 2015,230(8):1964-1973.

[9] van Balkom BWM, De Jong OG, Smits M, et al. Endothelial cells require miR-214 to secrete exosomes that suppress senescence and induce angiogenesis in human and mouse endothelial cells[J]. Blood, 2013,121(19):3997-4006.

[10] Aurora AB, Mahmoud AI, Luo X, et al. MicroRNA-214 protects the mouse heart from ischemic injury by controlling Ca2+overload and cell death[J]. J Clin Invest, 2012,122(4):1222-1232.

[11] Lv G, Shao S, Dong H, et al. MicroRNA-214 protects cardiac myocytes against H2O2-induced injury[J]. J Cell Biochem, 2014,115(1):93-101.

[12] Arslan F, Lai RC, Smeets MB, et al. Mesenchymal stem cell-derived exosomes increase ATP levels, decrease oxidative stress and activate PI3K/Akt pathway to enhance myocardial viability and prevent adverse remodeling after myocardial ischemia/reperfusion injury[J]. Stem Cell Res, 2013,10(3):301-312.

[13] Nakazato K, Naganuma W, Ogawa K, et al. Attenuation of ischemic myocardial injury and dysfunction by cardiac fibroblast-derived factor (s)[J]. Fukushima J Med Sci, 2010,56(1):1-16.

[14] Barile L, Lionetti V, Cervio E, et al. Extracellular vesicles from human cardiac progenitor cells inhibit cardiomyocyte apoptosis and improve cardiac function after myocardial infarction[J]. Cardiovasc Res, 2014,103(4):530-541.

[15] Chugh AR, Beache GM, Loughran JH, et al. Administration of cardiac stem cells in patients with ischemic cardiomyopathy: the SCIPIO trial surgical aspects and interim analysis of myocardial function and viability by magnetic resonance[J]. Circulation, 2012,126(11 suppl 1):S54-S64.

[16] Anand S, Majeti BK, Acevedo LM, et al. MicroRNA-132-mediated loss of p120RasGAP activates the endothelium to facilitate pathological angiogenesis[J]. Nat Med, 2010,16(8):909-914.

[17] Rau CS, Yang JC, Chen YC, et al. Lipopolysaccharide-induced microRNA-146a targets CARD10 and regulates angiogenesis in human umbilical vein endothelial cells[J]. Toxicol Sci, 2014,140(2):315-326.