段淑香,徐慶國,周國,張洪強,孟海燕

(1山東省立第三醫(yī)院，濟南250031；2濟南軍區(qū)總醫(yī)院)

急性冠脈綜合征(ACS)患者病死率高、預(yù)后差，是心血管疾病的重中之重，2型糖尿病(T2DM)的患者中ACS的發(fā)病率是非糖尿病患者的2～3倍[1,2]。過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPAR-γ)是一類核轉(zhuǎn)錄因子，由配體或激活物激活，有研究證明PPAR-γ在冠狀動脈粥樣硬化斑塊(AS)中高表達(dá)。PPAR-γ與T2DM密切相關(guān)，通過多種途徑改善糖脂代謝[3]。PPAR-γ通過激活內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)，產(chǎn)生NO，降低氧化應(yīng)激，增強NO的生物利用度，抑制黏附級聯(lián)和血管炎癥，可有效防止ACS的發(fā)生、發(fā)展。基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)，是一種以鋅離子為輔助因子，降解細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白酶，通過崩解纖維帽成分參與AS纖維帽破裂的過程，已經(jīng)證實在AS破裂處高度表達(dá)[4]。本課題旨在觀察ACS合并T2DM的患者與單純ACS患者外周血淋巴細(xì)胞中PPAR-γ、MMP-9、eNOS蛋白和mRNA表達(dá)水平的不同，分析其與冠脈病變程度的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年1～10月于山東省立第三醫(yī)院確診為ACS并經(jīng)冠狀動脈造影術(shù)明確冠狀動脈粥樣硬化病變的患者82例，男67例、女45例，年齡(62.59±8.4)歲，其中合并T2DM患者42例(ACSDM組)，男26例、女16例，年齡(63.91±8.7)歲；不合并T2DM患者40例(ACS組)，男25例、女15例，年齡(61.72±8.3)歲。入選標(biāo)準(zhǔn)：ACS和T2DM的診斷標(biāo)準(zhǔn)參見文獻(xiàn)[5,6]。排除標(biāo)準(zhǔn)：心功能不全經(jīng)評定為NYHA Ⅲ～Ⅳ級的患者；左室射血分?jǐn)?shù)<40%；有嚴(yán)重的肝、腎、肺功能損害；心肌炎、心肌病、感染性心內(nèi)膜炎等心臟疾??；妊娠；低血壓、高血壓危象、酮癥酸中毒、高血糖高滲狀態(tài)；惡性腫瘤；嚴(yán)重感染、免疫性疾病、近期服用TZDs、貝特類等藥物；依從性差的患者。另選取同期健康體檢者30例(對照組)，男16例、女14例，年齡(62.15±8.1)歲。三組入試者性別、年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。所有入試者均已簽署知情同意書。

1.2 外周血淋巴細(xì)胞PPAR-γ、MMP-9、eNOS mRNA表達(dá)檢測 采用RT-PCR法。所有入選者在胸痛發(fā)作24 h內(nèi)(對照組于入院后)抽取靜脈血3 mL，分離外周血淋巴細(xì)胞，提取外周血淋巴細(xì)胞總RNA，嚴(yán)格按照操作說明進行，RNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；利用PPAR-γ、MMP-9、eNOS特異性引物序列擴增合成cDNA，在PCR儀上進行定量檢測，結(jié)合擴增曲線及溶解曲線分析，將符合要求的樣本基因定量PCR原始數(shù)據(jù)取3次重復(fù)的平均值，經(jīng)β-actin校正，用Light Cycler自帶分析軟件進行數(shù)據(jù)處理，用2-ΔΔCt法分析數(shù)據(jù)。

1.3 外周血淋巴細(xì)胞PPAR-γ、MMP-9、eNOS蛋白表達(dá)檢測 采用Western blotting法。首先使用裂解液提取淋巴細(xì)胞總蛋白，配制濃縮膠和分離膠，上樣量30 μg，濃縮膠為80 V，分離膠120 V進行電泳，電泳結(jié)束后，取出凝膠，進行轉(zhuǎn)膜， 200 mA恒流轉(zhuǎn)膜約1～2 h，電壓在80～95 V；5%脫脂奶粉封閉非特異性蛋白，37 ℃搖床中振動約2 h；分別加入抗β-actin(稀釋度1∶1 000)、抗PPAR-γ(稀釋度1∶1 000)、抗MMP-9(稀釋度1∶1 000)、抗eNOS(稀釋度1∶1 000)一抗4 ℃孵育過夜約18 h；TBST漂洗15 min×3次；加入辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔或抗小鼠IgG二抗(1∶10 000用封閉液配制)，37 ℃搖床中搖動約1 h；TBST漂洗后 ECL發(fā)光液進行發(fā)光，凝膠掃描成像系統(tǒng)進行掃描，顯示條帶，軟件分析灰度值，進行比較。

1.4 冠狀動脈造影術(shù)后冠脈病變程度評估 入院后第7天，行冠狀動脈造影術(shù)，采集6個不同體位圖像，定性分析病變特點。Gensini系統(tǒng)評分方法評估冠脈病變狹窄水平： 1%～25%狹窄記1分；26%～50%記2分；51%～75%記4分；76%～90%記8分；91%～99%記16分；100%(全閉)記32分；LM病變記5分；LAD或LCX近段記2.5分；LAD中段記2.5分；LAD遠(yuǎn)段、LCX中遠(yuǎn)段、RCA記1分；小分支病變記0.5分。每處病變狹窄程度分值乘以病變部位分值為一處病變的積分值，每位患者最后Gensini積分為所有病變積分總和。

2 結(jié)果

2.1 三組外周血淋巴細(xì)胞PPAR-γ、MMP-9、eNOS蛋白表達(dá)比較 ACS組、ACSDM組外周血淋巴細(xì)胞PPAR-γ 、eNOS蛋白表達(dá)均低于對照組(P均<0.05)，ACSDM組PPAR-γ、eNOS蛋白表達(dá)均低于ACS組(P均<0.05)，ACS組、ACSDM組MMP-9蛋白表達(dá)均高于對照組(P均<0.05)，ACSDM組MMP-9蛋白表達(dá)高于ACS組(P<0.05)。見表1。

表1 三組PPAR-γ、eNOS、MMP-9蛋白表達(dá)比較

注：與對照組比較，aP<0.05；與ACS組比較，bP<0.05。

2.2 三組外周血淋巴細(xì)胞PPAR-γ、MMP-9、eNOS mRNA表達(dá)比較 ACS組、ACSDM組外周血淋巴細(xì)胞PPAR-γ 、eNOS mRNA表達(dá)均低于對照組(P均<0.05)，ACSDM組PPAR-γ、eNOS mRNA表達(dá)均低于ACS組(P均<0.05)，ACS組、ACSDM組MMP-9 mRNA表達(dá)均高于對照組(P均<0.05)，ACSDM組MMP-9 mRNA表達(dá)高于ACS組(P<0.05)。見表2。

表2 三組外周血淋巴細(xì)胞PPAR-γ、eNOS、MMP-9 mRNA表達(dá)比較

注：與對照組比較，aP<0.05；與ACS組比較，bP<0.05。

2.3 ACS組及ACSDM組Gensini積分比較 ACSDM組Gensini積分高于ACS組(42.49±5.02 vs 27.93±7.11，P<0.05)。

2.4 PPAR-γ、eNOS、MMP-9蛋白表達(dá)水平與Gensini積分的相關(guān)性 Gensini積分與PPAR-γ、eNOS蛋白表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)(r分別為-0.803、-0.873，P均<0.05)，與MMP-9蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.965，P<0.05)；PPAR-γ蛋白表達(dá)與eNOS蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.95，P<0.05)，PPAR-γ蛋白表達(dá)及eNOS蛋白表達(dá)與MMP-9蛋白表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)(r分別為-0.816、-0.865，P均<0.05)。

3 討論

ACS包括急性心肌梗死、不穩(wěn)定型心絞痛和心源性猝死，它們均有共同的病理生理機制，即AS破裂，繼而出血和血栓形成，引起冠狀動脈完全或不完全閉塞導(dǎo)致的一系列臨床癥候群[7]。糖尿病是心血管疾病主要的危險因素之一。糖尿病患者動脈硬化及其動脈并發(fā)癥進行性增加，50%以上的糖尿病患者死亡的主要原因是動脈并發(fā)癥[8]。內(nèi)皮功能障礙是糖尿病主要的病理生理改變，是引發(fā)血管并發(fā)癥的基礎(chǔ)。有研究發(fā)現(xiàn)，在高血糖狀況下，大約7 d左右心臟瓣膜即可出現(xiàn)動脈粥樣硬化改變[9]。 國內(nèi)學(xué)者分析了1 419名冠狀動脈造影患者的血管狹窄程度，在比較了冠狀動脈病變血管數(shù)量、完全閉塞血管比例和Gensini評分后，發(fā)現(xiàn)冠脈血管病變嚴(yán)重程度隨著空腹血糖水平增加而增加[10]。

PPAR-γ是核轉(zhuǎn)錄因子超家族成員之一，除了在脂肪組織中表達(dá)豐富外，在血管平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和心肌細(xì)胞中均有表達(dá)。PPARs作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)激活物，是調(diào)節(jié)糖、脂質(zhì)代謝的重要因子，參與機體的炎癥反應(yīng)、脂質(zhì)代謝、細(xì)胞凋亡、基質(zhì)的重構(gòu)、平滑肌遷移、分化和AS等病理過程。研究者認(rèn)為PPAR-γ是心血管疾病的預(yù)警指標(biāo)，是負(fù)性調(diào)節(jié)因子，具有抗炎和抗AS的作用。PPAR-γ能通過多種途徑抑制炎癥介質(zhì)的表達(dá)，延緩AS形成的進展。PPAR-γ有兩種配體，分為天然配體和人工合成配體。天然配體包括花生四烯酸系列產(chǎn)物如15-脫氧前列腺素J2(15d-PGJ2)，多不飽和脂肪酸，二十六碳六烯酸等，其中15d-PGJ2是目前使用最廣泛的PPAR-γ配體。

研究顯示，PPAR-γ激動劑具有促進eNOS 產(chǎn)生更多的內(nèi)皮源性NO(EDNO)，提高內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移活性的作用。有研究表明，EDNO不僅可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移，還參與干細(xì)胞或祖細(xì)胞的動員、招募作用，因此可介導(dǎo)血管生長因子的血管新生作用，但外源性 NO 可能不具有此作用。近來有學(xué)者提出，PPARs是通過內(nèi)皮細(xì)胞的NO和磷脂肌醇信號途徑來抑制內(nèi)皮素的產(chǎn)生。利用腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞實驗證明，PPARs可以激活磷脂肌醇信號途徑來提高NO水平。本實驗研究證實，ACS組和ACSDM組PPAR-γ、eNOS蛋白和mRNA表達(dá)均低于對照組，其中ACSDM組降低更甚，冠脈病變程度與PPAR-γ、eNOS表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，PPAR-γ表達(dá)與eNOS表達(dá)呈正相關(guān)。說明PPAR-γ、eNOS 在保護內(nèi)皮細(xì)胞功能中發(fā)揮重要作用，PPAR-γ可能通過上調(diào)eNOS的表達(dá)發(fā)揮內(nèi)皮保護作用。

PPAR-γ可通過調(diào)節(jié)核因子-κB、激活蛋白-1、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制炎癥因子如MMP-9等表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)，從而預(yù)防和減緩AS的發(fā)生和發(fā)展。PPAR-γ可通過抑制MMP-9的表達(dá)，抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，影響斑塊穩(wěn)定性。PPAR-γ配體可通過抑制MMP-9的表達(dá)，抑制單核細(xì)胞的游走現(xiàn)象。Nikolaus等研究發(fā)現(xiàn)配體激活的PPAR-γ能夠通過抑制血小板源性生長因子誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞MMP-9表達(dá)和降低明膠酶的分解活性，抑制平滑肌細(xì)胞遷移，延緩動脈粥樣硬化進程。本實驗結(jié)果顯示，冠脈病變程度與與MMP-9表達(dá)呈正相關(guān)，PPAR-γ與MMP-9表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，PPAR-γ在ACS合并T2DM患者中表達(dá)明顯下降，而MMP-9在ACS合并T2DM患者中表達(dá)高于對照組和ACS組，提示糖尿病患者出現(xiàn)易損斑塊并發(fā)生急性冠脈綜合征與MMP-9水平升高有關(guān)，而MMP-9已經(jīng)證實是斑塊不穩(wěn)定因素之一，則PPAR-γ可通過抑制MMP-9的表達(dá)，影響斑塊穩(wěn)定性，防止ACS等惡性心血管事件的發(fā)生，降低心血管疾病的病死率。

參考文獻(xiàn)：

[1] Kiu Weber CI, Duchateau-Nguyen G, Solier C, et al. Cardiovascular risk markersassociated with arterial calcification in patients with chronickidneydisease Stages 3 and 4[J]. Clin Kidney, 2014,7(2):167-173.

[2] Basu A, Sukumar N, Ryder RE. Young Asian men with diabetes have the highest risk for acute coronary events: retrospective cohort analyses[J]. JRSM Open, 2018,9(1):2054270417732699.

[3] Han L, Shen WJ, Bittner S, et al. PPARs: regulators of metabolism and as therapeutic targets in cardiovascular disease. Part II: PPAR-β/δand PPAR-γ[J]. Future Cardiol, 2017,13(3):279-296.

[4] Gómez-Hernández A, Martín-Ventura JL, Sánchez-Galán E, et al. Overexpression of COX-2,Prostaglandin E synthase-1 and prostaglandin E receptors in blood mononuclear cellsand plaque of patients with carotid atherosclerosis: regulation by nuclear factor-kappaB[J]. Atherosclerosis, 2006, 187(1):139-149.

[5] 陸再英,鐘南山.內(nèi)科學(xué)[M] .第7版,北京:人民衛(wèi)生出版社, 2008:274.

[6] 中華醫(yī)學(xué)會心血管病學(xué)分會,中華心血管病雜志編輯委員會.急性ST段抬高型心肌梗死診斷和治療指南[J].中華心血管病雜志,2010,38(8):675-690.

[7] Chandrasekhar J, Baber U, Sartori S, et al. Associations between complex PCI and prasugrel or clopidogrel use in patients with acute coronary syndrome who undergo PCI: from the PROMETHEUS study[J]. Can J Cardiol, 2018,34(3):319-329.

[8] Ayumu H, Ken K, Aki HS, et al. Qualitative score of systemic arteriosclerosis by vascular ultrasonography as a predictor of coronary artery disease in type 2 diabetes[J]. Atherosclerosis, 2011,219(2):623-629.

[9] Ohira M , Endo K, Oyama T, et al. Improvement of postprandial hyperglycemia and arterial stiffness upon switching from premixed human insulin 30/70 to biphasic insulin aspart 30/70[J]. Metabolism, 2011,60(1):78-85.

[10] Gui MH, Li X, Lu ZQ, et al. Fasting plasma glucose correlates with angiographic coronary artery disease prevalence and severity in Chinese patients without known diabetes[J]. Acta Diabetol, 2013,50(3): 33-34.