王文杰，申社林

(邢臺(tái)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河北邢臺(tái)054000)

據(jù)我國(guó)流行病學(xué)資料顯示，我國(guó)冠心病患病人數(shù)已達(dá)2.3億，且年新發(fā)病人數(shù)高達(dá)60萬(wàn)，每天死亡9 590人，是我國(guó)首要死亡原因[2]。當(dāng)前冠心病病因研究雖然并未完全明確，但遺傳因素和環(huán)境因素是公認(rèn)的主要病機(jī)。環(huán)境因素包括性別、年齡、肥胖、高血脂、高血壓、不良生活習(xí)慣等[3～5]，但僅可解釋50%～60%冠心病的發(fā)病原因，而其余40%～50%的冠心病的發(fā)病原因則歸因于遺傳因素[6]，因此，遺傳因素方面的病因也是冠心病發(fā)病機(jī)制研究熱點(diǎn)。Shea 等[7]首次報(bào)道了白種人冠心病的易感位點(diǎn)基因，如CDKN2A、CDKN2B、MTAP、ANRIL等，而這些基因均為9p21染色體區(qū)域相關(guān)基因。由于易感位點(diǎn)基因存在人種差異，且國(guó)內(nèi)尚無(wú)9p21染色體區(qū)域冠心病易感位點(diǎn)基因的相關(guān)報(bào)道。因此，本研究擬探討冠心病患者9p21染色體位點(diǎn)CDKN2A、CDKN2B、MTAP及ANRIL的表達(dá)變化。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年1～8月邢臺(tái)市人民醫(yī)院住院治療的冠心病患者30例為病例組，以同期健康體檢人群30例為對(duì)照組。病例組入選標(biāo)準(zhǔn)：①臨床癥狀及心電圖顯像符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)心血管病學(xué)分會(huì)《中國(guó)心血管病預(yù)防指南》[8]冠心病診斷標(biāo)準(zhǔn)；②冠狀動(dòng)脈造影顯示，至少有1支冠狀動(dòng)脈管腔狹窄至少50%；③所有入選冠心病患者無(wú)血緣關(guān)系；④所有入選冠心病患者民族均為漢族。病例組排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并擴(kuò)展型心臟病、風(fēng)濕性心臟病等其它心血管疾病患者；②具有嚴(yán)重肝、腎疾病及全身性免疫系統(tǒng)疾病患者；③曾接受靜脈溶栓術(shù)、心臟大型手術(shù)患者。對(duì)照組納入排除標(biāo)準(zhǔn)：均為漢族，病史詢問(wèn)、體檢確診為非冠心病，且本人、家族直系三代無(wú)冠心病史。所有研究對(duì)象經(jīng)知情同意后，采集空腹抗凝靜脈血2 mL，本研究樣本選取及實(shí)驗(yàn)檢測(cè)均經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.2 外周血總RNA提取 采用TRIzol法，主要提取步驟為：①新鮮血液2 mL置于離心管內(nèi)，加入6 mL紅細(xì)胞裂解液混勻后，4 ℃ 12 000 r/min離心處理2 min，棄上清紅色液體；②沉淀部分加入4 mL紅細(xì)胞裂解液混勻后，4 ℃ 12 000 r/min離心處理2 min，棄上清紅色液體；③沉淀部分加入4 mL PBS溶液混勻后，4 ℃ 12 000 r/min離心處理2 min，棄上清液體；④沉淀部分加入1 mL TRIzol溶液混勻，室溫下靜置10 min；⑤再加入0.2 mL氯仿混勻后，4 ℃下以12 000 r/min離心處理15 min，棄上清液體，保留底部針尖大小白色物質(zhì)；⑥再加入1 mL的70%乙醇旋轉(zhuǎn)洗滌，4 ℃ 12 000 r/min離心處理5 min，去除乙醇加入30 μL DEPC水融解沉淀，得到外周血總RNA樣品液。

1.3 外周血cRNA合成 反轉(zhuǎn)錄體系配置：①RNase Free DH2O(20 μL)；②Prime Script TM Buffer×5(1 μL)；③Prime Script TM RT Enzyme Mix I(1 μL)；④Oligo d T Primer(1μL)；⑤Random 6 mer(1 μL)；⑥Total RNA(500 ng)。將上述反轉(zhuǎn)錄體系溶液混勻后，在反應(yīng)條件(37 ℃ 10 min，85 ℃ 10 s，4 ℃ 1 h)中可合成外周血cRNA。

1.4 引物設(shè)計(jì)與合成 以9p21染色體區(qū)域的CDKN2A基因、CDKN2B基因、MTAP基因和ANRIL基因作為候選基因，以β-actin作為內(nèi)參基因，采用primer 5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。其中候選基因β-actin正向引物：5’-ACAGTGGAAGTGGCAAGGTC-3’，反向引物：5’-GTTTCAAGTATTACACCGGC-3’，CDKN2B正向引物：5’-TCAGTCGGCTTCCGAGGTA-3’，反向引物：5’-GTTGCGTGGTTCAATGCC-3’； ANRIL正向引物：5’-GAGAGAACCTTAGGAAACTTTACAG-3’， 反向引物：5’-ACACCATCAATCCCACACCATACAC-3’； MTAP正向引物：5’-ACGAAGGAGCACGAGGAAG-3’， 反向引物：5’-CTATCCCAGGTCTCTTACCAGTC-3’； CDKN2A正向引物：5’-TCAGTCGGCTTCCGAGGTA-3’，反向引物：5’-GTTCCGTGGAGCGCGTA-3’。引物合成送寶生物公司合成。

1.5 各組mRNA表達(dá)量測(cè)定 PCR擴(kuò)增體系：①PCR Reverse Primer(0.5 μL)；②SYBR Premix Ex Taq TM(12.5 μL)；③ROX Reference Dye Ⅱ(0.5 μL)；④PCR Forward Primer(0.5 μL)；⑤cRNA樣品液(2 μL)；⑥dH2O(9 μL)。將上述PCR擴(kuò)增體系溶液混勻后，在實(shí)時(shí)熒光 PCR擴(kuò)增儀中以反應(yīng)條件(95 ℃ 30 s，95℃ 5 s，60 ℃ 20 s)進(jìn)行反應(yīng)，共循環(huán)40次后，測(cè)定兩組CDKN2A、CDKN2B、MTAP和ANRIL的mRNA表達(dá)水平。

2 結(jié)果

與對(duì)照組相比，病例組的外周血9p21染色體區(qū)域的CDKN2A、CDKN2B mRNA表達(dá)水平降低(P均<0.05)，MTAP mRNA表達(dá)水平升高(P<0.05)，ANRIL mRNA表達(dá)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見表1。

表1 兩組CDKN2A、CDKN2B、MTAP和ANRIL的mRNA表達(dá)比較

3 討論

遺傳因素是當(dāng)前冠心病的病因及發(fā)病機(jī)制研究中的熱點(diǎn)方向。家族聚集性是冠心病明顯的遺傳病特征，即具有冠心病家族史人群的冠心病患病風(fēng)險(xiǎn)是無(wú)冠心病家族史人群的12倍，且這種高患病風(fēng)險(xiǎn)存在種族差異[9]。但是冠心病作為一種復(fù)雜的多基因遺傳病，其顯著特點(diǎn)是不符合孟德爾遺傳的質(zhì)量性狀變異，存在著數(shù)量級(jí)差改變，即冠心病病因和發(fā)病機(jī)制可能存在多種易感基因或易感區(qū)域[10]，因此冠心病遺傳基因研究頗為復(fù)雜。但隨著人類基因組計(jì)劃的進(jìn)展和單核苷酸多態(tài)性研究的不斷進(jìn)步，使基于候選基因策略的全基因組關(guān)聯(lián)研究法成為冠心病遺傳基因研究的主要方法。全基因組關(guān)聯(lián)研究法又稱為連鎖不平衡研究法，是一種通過(guò)疾病人群和健康對(duì)照人群間遺傳標(biāo)記基因表達(dá)差異，來(lái)分析疾病相關(guān)致病基因的有效方法。由于全基因組關(guān)聯(lián)研究法，既不需要了解致病基因在全基因組中的位置，也不需要假定疾病的相關(guān)基因，因此在冠心病遺傳基因研究中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛[11]。

當(dāng)前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者采用候選基因策略的全基因組關(guān)聯(lián)研究法，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)較多與冠心病病情發(fā)展相關(guān)的基因易感位點(diǎn)和基因易感區(qū)域，這無(wú)疑是冠心病基因研究的一個(gè)進(jìn)步。而這些基因易感位點(diǎn)和基因易感區(qū)域主要集中在9p21染色體區(qū)域，使9p21染色體位點(diǎn)成為被廣泛關(guān)注的熱點(diǎn)。本世紀(jì)初，《Science》報(bào)道了美國(guó)、加拿大、英國(guó)等學(xué)者的相關(guān)報(bào)道，其研究顯示9p21染色體位點(diǎn)是白種人群的冠心病易感位點(diǎn)[12,13]。之后芬蘭、瑞典、法國(guó)、愛爾蘭、日本等國(guó)為主的一個(gè)國(guó)際合作研究小組，分別對(duì)自己所在國(guó)冠心病人群的9p21染色體區(qū)域基因進(jìn)行了研究，印證了9p21染色體區(qū)域基因與冠心病發(fā)病的關(guān)系[14]。9p21染色體位點(diǎn)具有高度的不平衡特性，目前研究顯示，與9p21染色體位點(diǎn)相關(guān)聯(lián)的基因主要包括CDKN2A、CDKN2B、ANRIL 和MTAP[15]。

CDKN2A和CDKN2B基因均屬于9p21染色體區(qū)域基因編碼周期，均屬于依賴性蛋白激酶家族成員，主要在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)中產(chǎn)生抑制細(xì)胞增殖作用，且與冠心病的動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[16]。已經(jīng)有研究顯示CDKN2A和CDKN2B基因位于9p21染色體位點(diǎn)上游，與白種人冠心病發(fā)病密切相關(guān)[17]。ANRIL基因?yàn)?p21染色體位點(diǎn)的一種反義非編碼RNA基因，主要表達(dá)于血管巨噬細(xì)胞、血管上皮組織細(xì)胞及動(dòng)脈粥樣硬化板塊細(xì)胞之中，其通過(guò)轉(zhuǎn)錄來(lái)控制該病細(xì)胞增殖通路相關(guān)基因的表達(dá)[18]。近年研究顯示，冠心病患者的單核細(xì)胞和動(dòng)脈粥樣硬化斑塊組織中，9p21染色體位點(diǎn)的ANRIL 基因呈高表達(dá)，提示ANRIL 與冠心病患者動(dòng)脈粥樣硬化有關(guān)，推測(cè)ANRIL基因可促進(jìn)9p21染色體變異，從而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬的發(fā)生[19]。MTAP 基因在甲硫腺苷磷酸化酶的代謝中起重要作用，有文獻(xiàn)研究顯示MTAP 基因多態(tài)性與缺血性腦卒中、心肌梗死的發(fā)生具有相關(guān)性[20]。因此將9p21染色體位點(diǎn)相關(guān)聯(lián)的CDKN2A、CDKN2B、ANRIL和MTAP基因作為候選基因，探討其與冠心病的冠心，可以為冠心病臨床診治提供新的靶向基因。本研究結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比，冠心病病例組的外周血9p21染色體區(qū)域的CDKN2A、CDKN2B mRNA表達(dá)水平明顯降低，這可能是由于CDKN2A基因和CDKN2B基因作為一種具有抑制細(xì)胞增殖作用的基因，其在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)中的抑制作用受到限制，因此導(dǎo)致患者冠心病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的增大。MTAP mRNA表達(dá)水平明顯升高，這可能是因?yàn)镸TAP 基因作為一種具有促進(jìn)細(xì)胞代謝功能的基因[21]，作用于慢性進(jìn)展性的冠心病，其表達(dá)上調(diào)加速了冠心病的進(jìn)展。ANRIL mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯差異，提示ANRIL基因可能與冠心病發(fā)生發(fā)展無(wú)關(guān)，與國(guó)外研究存在差異，原因可能在于人種差異和病例樣本較小。

綜上所述,冠心病的發(fā)生可能與9p21染色體位點(diǎn)CDKN2A、CDKN2B表達(dá)下降和MTAP 表達(dá)升高有關(guān)，9p21染色體位點(diǎn)CDKN2A、CDKN2B和MTAP 有希望成為冠心病臨床診治的潛在靶基因。

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