劉桂紅，鄧偉楠，陳耀勇，孫筱放，陳敦金，余波瀾

(廣東省產(chǎn)科重大疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省普通高校生殖與遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院婦產(chǎn)科研究所，廣州 510150)

代謝組學(xué)是研究生物體系代謝途徑的一種技術(shù)，主要應(yīng)用于疾病診斷、藥物代謝、毒理代謝等方面，是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后，系統(tǒng)生物學(xué)的又一重要研究平臺(tái)，并逐漸成為生命科學(xué)的研究熱點(diǎn)[1-2]。串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的臨床應(yīng)用越來(lái)越廣泛，尤其在新生兒遺傳代謝病檢測(cè)方面，其檢測(cè)結(jié)果的優(yōu)勢(shì)是準(zhǔn)確性好、靈敏度高，特別是在小分子化合物代謝方面的檢測(cè)，彌補(bǔ)了其他檢測(cè)技術(shù)的短板，是目前具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)的一種代謝產(chǎn)物檢測(cè)技術(shù)。妊娠疾病不同于一般內(nèi)外科疾病，因新陳代謝異常產(chǎn)生的不良代謝產(chǎn)物，可對(duì)母體和胎兒造成危害，導(dǎo)致不良妊娠結(jié)局。本文重點(diǎn)研究采用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)分析妊娠期疾病患者體內(nèi)氨基酸和?；鈮A的表達(dá)水平，以期為后續(xù)研究代謝產(chǎn)物的作用機(jī)制提供思路。

資料與方法

一、一般資料

回顧性分析廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院產(chǎn)科2015～2016年收治的孕婦78例，按照有無(wú)合并妊娠期疾病分為兩組：正常對(duì)照組31例、妊娠疾病組47例，妊娠疾病組又根據(jù)妊娠期合并疾病的不同分為3個(gè)亞組：妊娠期糖尿病組(GDM組)16例、妊娠期高血壓疾病組(HDP組)20例、GDM+HDP組11例。

上述血清樣本采于患者，保存于廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院生物樣本庫(kù)，巢式病例對(duì)照研究所需要的樣本均來(lái)自于國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目所建設(shè)的中國(guó)產(chǎn)科聯(lián)盟妊娠隊(duì)列(COACS隊(duì)列)。本研究經(jīng)廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)，倫理批號(hào)為廣醫(yī)2016年(申0406)號(hào)，臨床研究注冊(cè)號(hào)為Clinical Trials NCT03038555。

病例納入、《知情同意書》簽署、樣本采集和臨床隨訪均由專職人員擔(dān)任，并保存于廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院生物樣本庫(kù)。所有患者均知情同意，并簽署《知情同意書》。

妊娠疾病組納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)孕產(chǎn)婦年齡在20～45歲之間，單活胎，包括自然分娩和剖宮產(chǎn)；GDM組、HDP組、GDM+HDP組入選標(biāo)準(zhǔn)均按照《婦產(chǎn)科學(xué)》第8版診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)排除死胎與死嬰、急慢性并發(fā)癥(腎病、視網(wǎng)膜病變、心血管和消化道疾病等)。正常對(duì)照組的納入標(biāo)準(zhǔn)為：(1)孕產(chǎn)婦年齡在20～45歲之間，無(wú)不良孕產(chǎn)史，單活胎，胎齡為37～41周，包括自然分娩和剖宮產(chǎn)；(2)排除產(chǎn)婦妊娠期并發(fā)癥、原發(fā)性內(nèi)外科疾病(但乙肝病毒攜帶者肝功能正常者可納入)；(3)產(chǎn)程順利，排除胎兒、胎盤、胎膜、羊水異?；虼嬖谔杭膊≌?。

二、試劑與儀器

1.主要試劑：非衍生化多種氨基酸、?；鈮A測(cè)定試劑盒(串聯(lián)質(zhì)譜法)購(gòu)自廣州豐華生物工程有限公司，檢測(cè)18種氨基酸和31種?；鈮A。檢測(cè)項(xiàng)目包括：苯丙氨酸(Phe)、蛋氨酸(Met)、亮-異亮氨酸(Leu-Ile)、纈氨酸(Val)、精氨酸(Arg)、瓜氨酸(Cit)、組氨酸(His)、鳥氨酸(Orn)、酪氨酸(Tyr)、蘇氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、絲氨酸(Ser)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、脯氨酸(Pro)，游離肉堿(C0)、乙酰基肉堿(C2)、丙酰基肉堿(C3)、丁?；鈮A(C4)、異戊?；鈮A(C5)、己?；鈮A(C6)、辛?；鈮A(C8)、癸?；鈮A(C10)、十二烷?；鈮A(C12)、十四烷酰基肉堿(C14)、十六烷?；鈮A(C16)、十八烷?；鈮A(C18)、丙二?；鈮A/3-羥基丁酰肉堿(C3DC/C4OH)、戊二?；鈮A/3-羥基己?；鈮A(C5DC/C6OH)、甲基丙二?；鈮A/3-羥基異戊?；鈮A(C4DC/C5OH)、異戊烯酰基肉堿(C5∶1)、己二?；鈮A(C6DC)、辛烯酰基肉堿(C8∶1)、癸烯?；鈮A(C10∶1)、癸二烯酰基肉堿(C10∶2)、二烯?；鈮A(C12∶1)、十四烯?；鈮A(C14∶1)、十四二烯酰基肉堿(C14∶2)、3-羥基十四烷?；鈮A(C14OH)、十六烯酰基肉堿(C16∶1)、3-羥基十六烷?；鈮A(C16OH)、3-羥基十六烯?；鈮A(C16∶1OH)、十八烯?；鈮A(C18∶1)、十八二烯?；鈮A(C18∶2)、3-羥基十八烷?；鈮A(C18OH)、3-羥基十八烯?；鈮A(C18∶1OH)。

2.儀器：API3200MD型串聯(lián)質(zhì)譜儀購(gòu)自美國(guó)生物應(yīng)用系統(tǒng)公司(Applied Biosysterms)；Shmazu DGU-20A3型高效液相儀購(gòu)自日本島津公司；96孔板加熱振蕩裝置采用FWZ-II恒溫微量振蕩器，購(gòu)自廣州豐華生物工程有限公司。

三、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法

1.樣品處理：抽取孕婦外周靜脈血，采用血清標(biāo)本。配置日常萃取工作液(氨基酸內(nèi)標(biāo)∶肉堿內(nèi)標(biāo)∶萃取液體積比為1∶1∶108)。樣品經(jīng)過(guò)沉降、干燥、溶解處理。96孔U型板中，樣品60 μl與240 μl甲醇/乙腈(1∶1，V∶V)混合，-20℃靜置10 min，14 000 r/m 4℃離心10 min。離心后取上清15 μl，真空干燥1 300 r/m，60℃，約15 min至溶劑完全蒸發(fā)，管內(nèi)無(wú)任何液體。干燥后每孔加入日常萃取工作液100 μl，封片37℃ 750 r/m振蕩30 min溶解萃取。揭膜轉(zhuǎn)移：取75 μl至V型微孔板。鋁膜覆蓋，即可上樣檢測(cè)。

2.儀器設(shè)置：流動(dòng)相采用試劑盒自配非衍生法流動(dòng)相。四元泵流速設(shè)置為 30 μl/min，自動(dòng)進(jìn)樣器設(shè)置為每次進(jìn)樣20 μl。每次測(cè)定同時(shí)采用中性粒子丟失、母離子掃描、多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)3種掃描方式完成。

3.數(shù)據(jù)處理：采用軟件ChemoView2.0版本(美國(guó)生物應(yīng)用系統(tǒng)公司)定量處理。

4.質(zhì)量控制：室內(nèi)質(zhì)控品購(gòu)自廣州豐華生物工程有限公司。1份血清標(biāo)本做復(fù)孔，取兩次檢測(cè)結(jié)果的平均值。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件，非正態(tài)分布計(jì)量資料以平均秩(Z)表示，多組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)(Kruskal-Wallis H檢驗(yàn))，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、各組間氨基酸及?；鈮A檢測(cè)情況比較

各組檢測(cè)的49種氨基酸及酰基肉堿濃度相比較，其中有12項(xiàng)指標(biāo)(氨基酸3項(xiàng)、酰基肉堿9項(xiàng))組間有顯著性差異(P<0.05)，具體如下：Gly、Gln、Trp、C3、C3DC/C4OH、C4、C5、C6、C6DC、C8∶1、C14、C16∶1OH；其中有8項(xiàng)指標(biāo)(氨基酸2項(xiàng)、?；鈮A6項(xiàng))在正常對(duì)照組的表達(dá)水平(平均秩)顯著低于妊娠疾病組(P<0.05)，具體如下：Gly、Trp、C3、C3DC/C4OH、C4、C5、C6、C6DC。其余37項(xiàng)指標(biāo)組間比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)。數(shù)據(jù)結(jié)果詳見表1～2。

表1 18種氨基酸測(cè)定含量的組間比較(Z，單位：μmol/L)

注：組間比較，*P<0.05

注：組間比較，*P<0.05

二、GDM組與對(duì)照組中氨基酸及?；鈮A檢測(cè)情況比較

多組間Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)結(jié)果顯示，12項(xiàng)有顯著性差異的指標(biāo)中，GDM組中表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組的有氨基酸3項(xiàng)和酰基肉堿6項(xiàng)，具體如下：Gly、Gln、Trp、C3、C3DC/C4OH、C4、C5、C6、C6DC。GDM組表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組的有酰基肉堿3項(xiàng)(C8∶1、C14、C16∶1OH)。

三、HDP組與對(duì)照組中氨基酸及?；鈮A檢測(cè)情況比較

根據(jù)多組間Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，HDP組中表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組的有氨基酸2項(xiàng)和?；鈮A8項(xiàng)，具體如下：Gly、Trp、C3、C3DC/C4OH、C4、C5、C6、C6DC、C8∶1、C14。HDP組中表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組的有2項(xiàng)(Gln、C16∶1OH)。

四、GDM+HDP組與對(duì)照組中氨基酸及酰基肉堿檢測(cè)情況比較

多組間Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)結(jié)果顯示，GDM+HDP組中表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組的有氨基酸3項(xiàng)和酰基肉堿7項(xiàng)，具體如下：Gly、Gln、Trp、C3、C3DC/C4OH、C4、C5、C6、C6DC、C8∶1。GDM+HDP組中表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組的有酰基肉堿2項(xiàng)(C14、C16∶1OH)。

五、GDM組與HDP組中氨基酸及?；鈮A檢測(cè)情況比較

HDP組中表達(dá)水平顯著高于GDM組的指標(biāo)有氨基酸2項(xiàng)和酰基肉堿7項(xiàng)，具體如下：Gly、Trp、C3、C4、C5、C6、C6DC、C8∶1、C14。HDP組中表達(dá)水平顯著低于GDM組的指標(biāo)有3項(xiàng)(Gln、C3DC/C4OH、C16∶1OH)。

六、GDM+HDP組、GDM組、HDP組中氨基酸及?；鈮A檢測(cè)情況比較

GDM+HDP組中表達(dá)水平顯著高于GDM組和HDP組的指標(biāo)有氨基酸2項(xiàng)和?；鈮A3項(xiàng)(Gly、Gln、C3DC/C4OH、C5、C6)，顯著低于GDM組和HDP組的有氨基酸1項(xiàng)和?；鈮A4項(xiàng)(Trp、C3、C4、C6DC、C8∶1)。GDM+HDP組中表達(dá)水平均顯著低于GDM組和HDP組的有酰基肉堿2項(xiàng)(C14、C16∶1OH)。

討 論

生命的新陳代謝是一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)過(guò)程，正常人血中游離氨基酸、游離脂肪酸、有機(jī)酸的水平處于動(dòng)態(tài)平衡中。為了滿足胎兒和母體的營(yíng)養(yǎng)需求，妊娠期間新陳代謝會(huì)發(fā)生復(fù)雜的變化。然而，妊娠期間的高血壓疾病、糖尿病因涉及到復(fù)雜的病理生理過(guò)程，導(dǎo)致體內(nèi)的新陳代謝發(fā)生異常變化，嚴(yán)重影響了母嬰健康。近幾年，已有研究報(bào)道游離氨基酸及脂肪酸的水平變化與高血壓病、糖尿病之間的相關(guān)性[3]，游離脂肪酸與代謝性疾病之間的關(guān)系[4]，認(rèn)為游離脂肪酸的代謝異常在胰島素抵抗(IR)、高胰島素血癥、高血壓病、2 型糖尿病等發(fā)病過(guò)程中具有非常重要的作用。盡管酰基肉堿是脂肪酸、有機(jī)酸代謝的中間產(chǎn)物，但較少學(xué)者研究妊娠疾病中孕婦外周血中氨基酸和?；鈮A的表達(dá)水平。

國(guó)外Lindsay等[5]報(bào)道健康妊娠期間幾種必需氨基酸和非必需氨基酸、長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸、游離肉堿、乙酰肉堿、磷脂酰膽堿和鞘磷脂的母體血漿濃度顯著降低。本研究運(yùn)用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)研究HDP組、GDM組、GDM+HDP組孕婦體內(nèi)49種氨基酸及?；鈮A的含量水平，與正常對(duì)照組比較，氨基酸或?；鈮A濃度增加，提示HDP、GDM與氨基酸或?；鈮A的代謝失衡關(guān)系密切。

有研究將原發(fā)性高血壓患者與健康受試者的代謝狀態(tài)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)原發(fā)性高血壓患者血漿中3-甲基組氨酸、甘氨酸、鞘氨醇等濃度顯著升高，而門冬氨酸、亮氨酸、異亮氨酸等濃度顯著下降[6]。結(jié)合本研究結(jié)果，我們分析表明原發(fā)性高血壓和HDP中氨基酸代謝的種類變化不一致，推測(cè)妊娠因素決定了兩者之間的氨基酸代謝發(fā)生變化的機(jī)制不一致，進(jìn)而影響了氨基酸代謝水平的差異。董愛(ài)華[7]的碩士學(xué)位論文報(bào)道，HDP組血清游離脂肪酸水平升高，這為本研究HDP組的?；鈮A水平比正常對(duì)照組呈現(xiàn)升高趨勢(shì)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提供了一定的“橋梁”價(jià)值。同時(shí)，Odibo等[8]研究表明妊娠期氨基酸和?；鈮A代謝組學(xué)的測(cè)定篩選在先兆子癇中具有潛在的預(yù)警生物標(biāo)志物的作用。

Weng等[9]研究表明在糖耐量受損并高血壓病的白種人和非裔美國(guó)人中，氨基酸(纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸)的血漿水平與代謝綜合征相關(guān)。Rahimi等[10]研究表明氨基酸(精氨酸、甘氨酸和甲硫氨酸)的水平與GDM風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，Chorell等[11]研究表明GDM的支鏈氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸)水平顯著提高。國(guó)內(nèi)汪思陽(yáng)等[12]亦對(duì)2型糖尿病患者中血漿氨基酸變化特點(diǎn)進(jìn)行了研究。結(jié)合本研究表明，無(wú)論是2型糖尿病，還是GDM，其氨基酸含量水平呈升高趨勢(shì)；兩者疾病之間是否存在共同代謝途徑的異常機(jī)制尚不完全清楚。Nevalainen等[13]研究表明氨基酸或酰基肉堿的血清水平在孕早期GDM中存在顯著差異，是重要的預(yù)測(cè)標(biāo)志物。

本研究表明妊娠期間高血壓疾病、糖尿病，在妊娠因素、不同疾病的影響下，機(jī)體內(nèi)氨基酸或?；鈮A的代謝水平有差異。同一疾病的氨基酸或?；鈮A變化的種類報(bào)道不一，這可能與不同的人群種族特異性表型、代謝組學(xué)研究方案和檢測(cè)方法不一致有關(guān)，需要流行病學(xué)方法進(jìn)一步研究分析。氨基酸或?；鈮A含量水平的升高是否作為妊娠期間的高血壓疾病、糖尿病的危險(xiǎn)因素和早期預(yù)警生物標(biāo)志物，有待于進(jìn)一步深入探討研究。

目前氨基酸和酰基肉堿代謝途徑的異常機(jī)制尚不完全清楚。Cooper-Dehoff等[14]報(bào)道評(píng)估了異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的代謝水平與支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶1(BCAT1)和苯丙氨酸羥化酶(PAH)的單核苷酸多態(tài)性、糖耐量受損發(fā)展的關(guān)系。Ho等[15]在口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)檢測(cè)前后進(jìn)行110種代謝物分析，證實(shí)氨基酸、糖異生和各種氧化還原反應(yīng)等的代謝途徑受胰島素作用影響。Berti等[16]研究妊娠母體營(yíng)養(yǎng)和后代健康有關(guān)的生物化學(xué)機(jī)制以及它們?cè)谔ケP中的轉(zhuǎn)運(yùn)和利用?；谥把芯繄?bào)道，我們推測(cè)HDP或GDM的氨基酸或酰基肉堿水平的代謝變化機(jī)制與BCAT1和PAH的單核苷酸多態(tài)性、胰島素作用、胎盤營(yíng)養(yǎng)代謝和胎兒轉(zhuǎn)移蛋白合成功能有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)的不足之處是樣本量較小，可能會(huì)對(duì)結(jié)果造成一定的偏倚，后續(xù)應(yīng)進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量和對(duì)基線資料分析，控制混雜因素，以進(jìn)一步探討和驗(yàn)證現(xiàn)有結(jié)論。

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