張文政，楊 洋，陳 雅，肖 濤，傅曉鐘，董永喜

(貴州醫(yī)科大學(xué) 1藥學(xué)院；2貴州省藥物制劑重點實驗室；3國家苗藥工程技術(shù)研究中心；4民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心，貴陽 550004)

阿德福韋酯(adefovir dipivoxil,圖1)是由Gilead Science公司研制的第1個非環(huán)核苷膦酸酯類抗HBV藥物，2002年被FDA批準上市。由于其能有效繞過病毒編碼激酶催化的首次磷酸化過程，因此，對拉米呋啶(lamivudine)、泛昔洛維(famcicloir)及恩曲他濱(emtricitabine)等核苷類似物產(chǎn)生耐藥的變異HBV能產(chǎn)生較好的抑制效果[1-2]。但是阿德福韋酯臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)其主要不足是釋放原藥過程中產(chǎn)生毒性載體片段，臨床應(yīng)用中易產(chǎn)生劑量依賴性腎毒性[3-4]，并且藥物在肝細胞中富集能力差，肝臟靶向定位能力較弱[4-6]。因此設(shè)計、合成含有內(nèi)源性載體，能實現(xiàn)藥物肝靶向性富集，同時非靶器官毒性降低的阿德福韋前藥對于研制、開發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的新型抗HBV藥物具有重要價值。

膽汁酸(包括膽酸、去氧膽酸與熊去氧膽酸等)是內(nèi)源性的肝細胞特異性天然底物。其在肝細胞內(nèi)生成后隨膽汁流入小腸，參與脂類物質(zhì)吸收，之后在回腸末端被迅速重吸收，通過門靜脈重新進入肝臟，形成肝腸循環(huán)(enterohepatic circulation,EC)[7],該過程中其僅有少量膽汁酸(<5%)進入血液,因此膽汁酸具有高度的器官特異性。成人體內(nèi)肝腸循環(huán)每天重復(fù)6～15次,參與循環(huán)的膽酸總量達到17～40 g,表明膽汁酸同時具有極高的轉(zhuǎn)運能力。報道顯示，膽汁酸可以作為肝靶向性藥物轉(zhuǎn)運載體，藥物膽酸偶聯(lián)物能夠借助于腸肝循環(huán)中兩種重要的膽汁酸轉(zhuǎn)運載體，回腸末端上皮細胞頂端刷狀緣膜中的鈉離子依賴性膽酸轉(zhuǎn)運體(human apical sodium-dependent bile acid transporter,hASBT)與肝細胞表面的鈉離子-牛磺膽酸轉(zhuǎn)運多肽(Na+/taurocholate cotransporting polypeptide,NTCP)轉(zhuǎn)運并參與膽汁酸的腸肝循環(huán)[6,8]，從而提高藥物的吸收及在肝臟中的濃度，賦予藥物肝臟選擇性。這種修飾策略被成功應(yīng)用于膽酸-苯丁酸氮芥偶合物、硝基化阿魏酸與熊去氧膽酸偶聯(lián)物(NCX1000)以及熊去氧膽酸載體偶聯(lián)的加巴噴丁衍生物設(shè)計上(圖1)，明顯提高了藥物的肝細胞靶向性及口服生物利用度[4-6]。

Figure1 Structures of adefovir dipivoxil and bile acid conjugated prodrugs

為探索膽酸酯結(jié)構(gòu)片段的引入能否適用于阿德福韋酯結(jié)構(gòu)修飾，以期發(fā)現(xiàn)具有較強抗病毒活性與較高肝臟分布特性的抗HBV阿德福韋前藥，本研究以前期獲得的具有較強抗病毒活性與較低毒性的阿德福韋雙L-氨基酸酯為先導(dǎo)化合物[9-10]，結(jié)合膽酸酯前藥具有的結(jié)構(gòu)特征，應(yīng)用藥物設(shè)計上的亞結(jié)構(gòu)拼合原理(sub-structure combination method)，設(shè)計、合成了阿德福韋單L-(硫代)氨基酸酯，單膽酸酯衍生物(6a～6j)(圖2)。通過對HepG 2.2.15細胞系分泌的HBV-DNA的抑制作用考察目標化合物的抗HBV活性，篩選出具有較強抗病毒活性及較高作用選擇性指數(shù)的化合物進行小鼠體內(nèi)組織分布實驗。目標化合物的結(jié)構(gòu)鑒定及藥理活性結(jié)果見表1～3。

Table1 Yields,1H NMR,13C NMR and MS data of target compounds6a-6j

CompdTotalyield/%1HNMR(CDCl3，400MHz)δ13CNMR(CDCl3，100MHz)δESI?MS(m/z)ESI?HRMS(m/z)Calcd(Found)6a178829(1H，s，2?H)，792(1H，s，8?H)，608(2H，brs，NH2)，440(2H，t，J=56Hz，NCH2)，418?405(9H，m，2×P(O)OCH2，2×CH2OCO，CHNH2)，391(2H，t，J=40Hz，NCH2CH2)，378(2H，d，J=80Hz，OCH2P)，355?345(2H，m，2×CHOH)，239?230(1H，m)，223?216(1H，m)，197?096(36H，m)，093?086(12H，m，4×CH3)17501，17416，15547，15292，14976，14134，11912，7133，7116，6577，6410，6406，6311，6304，6286，6059，6011，5891，5573，5469，5073，4368，4241，4008，3915，3725，3689，3517，3490，3402，3101，3029，2975，2934，2863，2682，2477，2355，2112，1835，1565，1209，116386350[M+H]+8635042(8635052)C43H72N6O10P[M+H]+6b197825(1H，s，2?H)，796(1H，s，8?H)，607(2H，brs，NH2)，439(2H，t，J=56Hz，NCH2)，417?407(9H，m，2×P(O)OCH2，2×CH2OCO，CHNH2)，390(2H，t，J=40Hz，NCH2CH2)，377(2H，d，J=80Hz，OCH2P)，356?345(2H，m，2×CHOH)，240?232(1H，m)，224?215(1H，m)，199?098(36H，m)，093?084(12H，m，4×CH3)17503，17397，15486，15246，14974，14097，11929，7156，7112，6575，6401，6397，6305，6301，6285，6057，5889，5568，5468，5072，4366，4334，4241，4007，3914，3723，3666，3515，3489，3402，3101，3029，2975，2967，2934，2862，2681，2354，2111，1833，1546，1207，109986350[M+H]+8635042(8635043)C43H72N6O10P[M+H]+6c236822(1H，s，2?H)，801(1H，s，8?H)，698(2H，brs，NH2)，438(2H，m，NCH2)，428(2H，m，NCH2CH2)，415?406(6H，m，CH2OCO，2×P(O)OCH2)，395(1H，m，CHNH2)，389(2H，m，CH2OCO)，382(2H，d，J=80Hz，OCH2P)，358?351(2H，m，2×CHOH)，232?227(1H，m)，220?217(1H，m)，193?189(2H，m，OCH2CH2)，177?114(28H，m)，106?100(3H，m)，095?091(3H，m)，085(3H，s，CH3)，062(3H，s，CH3)17450，17450，15581，15264，14980，14171，11897，7301，7161，6559，6446，6398，6333，6009，5835，5072，4927，4833，4677，4663，4352，4213，3633，3599，3532，3363，3359，3082，3078，3041，2979，2962，2955，2864，2766，2717，2624，2378，1771，127382145[M+H]+8214560(8214533)C40H66N6O10P[M+H]+6d256823(1H，s，2?H)，791(1H，s，8?H)，448(2H，t，J=52Hz，NCH2)，433?425(2H，m，NCH2CH2)，412?403(6H，m，CH2OCO，2×P(O)OCH2)，398?386(5H，m，CH2OCO，OCH2P，CHNH2)，354?349(2H，m，2×CHOH)，239?233(1H，m)，228?220(1H，m)，201?123(29H，m)，118?112(6H，m)，102?096(9H，m，3×CH3)，091(6H，s，2×CH3)，087?082(2H，m)17585，16985，15652，15264，15067，14372，11981，7951，7395，7249，7220，6583，6481，6426，6337，6146，5827，4835，4800，4456，4358，3773，3740，3715，3668，3640，3527，3478，3217，3196，3104，3077，3072，3046，2988，2866，2745，2673，2483，2369，1756，1499，1318，120487752[M+H]+8775199(8775192)C44H74N6O10P[M+H]+6e226822(1H，s，2?H)，801(1H，s，8?H)，440?439(4H，m，NCH2，NCH2CH2)，429?427(2H，m，CH2OCO)，418?405(6H，m，2×P(O)OCH2，CH2OCO)，397(1H，m，CHNH2)，389(2H，m，CH2OCO)，380(2H，d，J=80Hz，OCH2P)，370?368(1H，m，CHOH)，354?350(1H，m，CHOH)，235?228(1H，m)，224?218(1H，m)，194?189(4H，m，OCH2CH2，CHCH2)，180?117(29，m)，097?091(15H，m，5×CH3)17454，17448，15547，15213，14949，14174，11874，7315，7157，6571，6406，6401，6328，6011，5805，5057，4833，4830，4681，4674，4355，4213，3784，3639，3601，3544，3539，3367，3096，3085，3047，2968，2857，2766，2717，2625，2531，2376，2320，1728，1520，1273，117686350[M+H]+8635003(8634976)C43H72N6O10P[M+H]+

(Continued)CompdTotalyield/%1HNMR(CDCl3，400MHz)δ13CNMR(CDCl3，100MHz)δESI?MS(m/z)ESI?HRMS(m/z)Calcd(Found)6f154829(1H，s，2?H)，795(1H，s，8?H)，641(2H，brs，NH2)，440(2H，t，J=56Hz，NCH2)，419?407(7H，m，2×P(O)OCH2，CH2OCO，CHNH2)，393(2H，t，J=40Hz，NCH2CH2)，378(2H，d，J=80Hz，OCH2P)，357?347(2H，m，2×CHOH)，295?292(2H，m，CH2SCO)，238?231(1H，m)，224?218(1H，m)，198?093(36H，m)，089?082(12H，m，4×CH3)17503，17418，15549，15294，14978，14136，11914，7135，7118，6579，6412，6408，6313，6306，6288，6061，6013，5893，5575，5471，5075，4370，4243，4010，3917，3727，3691，3519，3492，3404，3103，3031，2977，2936，2865，2684，2479，2357，2117，1837，1567，1211，116587947[M+H]+8794774(8794750)C43H72N6O9PS[M+H]+6g181827(1H，s，2?H)，795(1H，s，8?H)，648(2H，brs，NH2)，439(2H，t，J=56Hz，NCH2)，417?403(7H，m，2×P(O)OCH2，CH2OCO，CHNH2)，389(2H，t，J=40Hz，NCH2CH2)，376(2H，d，J=80Hz，OCH2P)，354?343(2H，m，2×CHOH)，298?294(2H，m，CH2SCO)，237?230(1H，m)，222?215(1H，m)，196?094(36H，m)，092?085(12H，m，4×CH3)20444，17426，15575，15293，14976，14132，11918，7137，7119，7111，6720，6585，6494，6419，6312，6048，6026，5586，5484，4374，4347，4253，4018，3926，3737，3715，3529，3503，3412，3211，3116，3036，2978，2872，2695，2465，2349，2122，1976，1846，1663，1426，122087947[M+H]+8794774(8794767)C43H72N6O9PS[M+H]+6h116821(1H，s，2?H)，801(1H，s，8?H)，631(2H，brs，NH2)，437(2H，m，NCH2)，427(2H，m，NCH2CH2)，414?405(6H，m，CH2OCO，2×P(O)OCH2)，393(1H，m，CHNH2)，381(2H，d，J=80Hz，OCH2P)，357?351(2H，m，2×CHOH)，299?295(2H，m，CH2SCO)，231?227(1H，m)，220?216(1H，m)，192?189(2H，m，OCH2CH2)，176?112(28H，m)，106?100(3H，m)，094?091(3H，m)，085(3H，s，CH3)，062(3H，s，CH3)20381，17428，15561，15290，14981，14146，11921，7143，7135，7122，6707，6587，6479，6421，6318，6026，5585，5482，4376，4349，4253，4020，3927，3738，3706，3529，3503，3414，3199，3116，3039，2977，2874，2695，2348，2123，1971，1847，1662，122183743[M+H]+8374305(8374331)C40H66N6O9PS[M+H]+6i147823(1H，s，2?H)，791(1H，s，8?H)，630(2H，brs，NH2)，448(2H，t，J=52Hz，NCH2)，433?425(2H，m，NCH2CH2)，412?403(6H，m，CH2OCO，2×P(O)OCH2)，398?386(3H，m，OCH2P，CHNH2)，354?349(2H，m，2×CHOH)，299?295(2H，m，CH2SCO)，239?233(1H，m)，228?220(1H，m)，201?123(29H，m)，118?112(6H，m)，102?096(9H，m，3×CH3)，091(6H，s，2×CH3)，087?082(2H，m)20445，17447，15573，15302，14980，14137，11918，7306，7159，7123，6579，6425，6321，6021，5275，5209，4835，4697，4684，4661，4389，4355，4208，3637，3602，3539，3425，3415，3368，3106，3048，2973，2860，2763，2714，2622，2479，2374，2317，2300，2190，2055，1852，173289349[M+H]+8934931(8934999)C44H74N6O9PS[M+H]+6j169829(1H，s，2?H)，799(1H，s，8?H)，649(2H，brs，NH2)，442(2H，t，J=44Hz，NCH2)，418?408(6H，m，CH2OCO，2×P(O)OCH2)，402?398(1H，m，CHNH2)，394?391(2H，m，NCH2CH2)，380(2H，d，J=80Hz，OCH2P)，364?357(2H，m，2×CHOH)，295?291(2H，m，CH2SCO)，234?230(1H，m)，226?222(1H，m)，204?183(6H，m)，183?102(27H，m)，101?094(9H，m，3×CH3)，090?087(6H，m，2×CH3)20445，17428，15568，15299，14982，14128，11923，7140，7131，7120，6670，6587，6503，6420，6313，6027，5585，5482，4377，4348，4253，4017，3925，3895，3728，3708，3530，3504，3413，3115，3108，3057，3038，2986，2980，2695，2471，2409，2348，2123，1848，1613，1220，117887947[M+H]+8794774(8794742)C43H72N6O9PS[M+H]+

Figure2 Design of the target compounds as anti HBV agents

1 目標化合物合成路線

目標化合物的合成參考文獻[11-12]的報道方法，合成路線見路線1。

Scheme1 Synthetic route of the target compounds6a-6j

Reagenets and conditions:(I) 3-bromo-1-propanol,THF,DCC,DMAP,0 ℃-r.t.,24 h;(II) anhydrous DMF,DCMC,40 °C,48 h;(III) anhydrous DMF,DCMC,80 °C,48 h;(IV) 85%H3PO4/CHCl3,0 °C,4 h

2 合成實驗

N-Boc L-(硫代)氨基酸-2-溴-乙基酯，N-Boc L-(硫代)氨基酸-3-溴-丙基酯參考文獻[12-13]報道的方法合成；其余試劑均為市售分析純。

核磁共振光譜采用日本JEOL JNM-ECS 400型核磁共振儀測定，TMS內(nèi)標；質(zhì)譜用Acquity系統(tǒng)超高液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國Waters公司)測定；高分辨質(zhì)譜采用液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Bruker Daltonics公司)測定。小型臺式冷凍高速離心機(美國Thermo scientific公司)；EL-204電子天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)。

分布實驗動物采用SPF級雄性KM小鼠(20～30 g)，由長沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供，動物合格證號：SCXK黔2016-0021。

2.1 去氧膽酸-3-溴-1-丙基酯(3a)

在250 mL反應(yīng)瓶中加入去氧膽酸(7.84 g,20 mmol)、干燥四氫呋喃(THF)100 mL、3-溴-1-丙醇(3.35 g,24 mmol)、4-二甲氨基吡啶(DMAP,0.25 g,0.2 mmol)，于0 ℃條件下攪拌溶解，緩慢滴加干燥四氫呋喃溶解的二環(huán)己基碳二亞胺(DCC,5 g,25 mmol)40 mL，0 ℃反應(yīng)0.5 h自然升至室溫后再反應(yīng)20 h，過濾沉淀，收集濾液減壓旋干，殘余物硅膠柱色譜分離純化(洗脫劑：石油醚-乙酸乙酯，1.5∶1)，得到無色油狀物8.76 g，收率85.3%。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:4.17(2H,t,J=6.0 Hz),3.92～3.94(1H,m),3.51～3.61(1H,m),3.42(2H,t,J=6.0 Hz),2.29～2.37(1H,m),2.10～2.23(3H,m),0.98～1.85(26H,m),0.93(3H,d,J=8.0 Hz),0.85(3H,s),0.62(3H,s)。ESI-MS (m/z):513.51[M+H]+。

2.2 阿德福韋單L-(硫代)氨基酸酯，單膽酸酯衍生物的合成通法

稱取阿德福韋(1.09 g,4 mmol)、N,N-二環(huán)己基-4-嗎啉脒(DCMC,2.05 g,7 mmol)加入100 mL反應(yīng)瓶中，加入干燥的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)30 mL，氮氣保護，于80 ℃條件下攪拌溶解，自然降溫至40 ℃后，加入中間體3a～3b(8 mmol)，40 ℃恒溫反應(yīng)48 h，TLC(展開劑：乙酸乙酯-甲醇，1∶2)顯示生成的單酯點最多(4a,4b)時，加入中間體5a～5h(10 mmol)升溫至85 ℃繼續(xù)反應(yīng)48 h后停止反應(yīng)。將N,N-二甲基甲酰胺蒸干，得到淡黃色物，加入乙酸乙酯溶解，于4 ℃條件下靜置8 h，過濾收集濾液，用4×40 mL的0.1%稀鹽酸，飽和食鹽水洗滌(4×40 mL)，收集有機相，加入無水硫酸鈉干燥，抽濾后減壓旋干，得到淡黃色油狀液體，硅膠柱色譜分離純化(洗脫劑:氯仿-甲醇，25∶1)得到淡黃色油狀液體，再將產(chǎn)物放入冰浴中，加入氯仿-磷酸(3∶1)脫保護4 h，加入蒸餾水40 mL和氯仿40 mL淬滅，用5%碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7左右，用氯仿萃取(4×50 mL)，收集有機相，無水硫酸鈉干燥，濾液減壓蒸干，硅膠柱色譜分離純化(洗脫劑：氯仿-甲醇，25∶1)得到淡黃色油狀產(chǎn)物?？偣埠铣闪?0個目標化合物，收率、核磁共振氫譜和碳譜及質(zhì)譜數(shù)據(jù)見表1。

3 活性評價實驗

參照文獻[13]方法，采用HepG2.2.15細胞系評價6a～6j對HBV-DNA復(fù)制的抑制效果及細胞毒性。受試化合物經(jīng)HPLC檢測，純度在96%以上，符合實驗要求。

3.1 細胞毒性試驗

HepG2.2.15 單細胞懸液100 μL加入96孔培養(yǎng)板中，放置于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。次日吸棄上清液，加入含不同受試化合物濃度(1 000,100,10和0 mol/L)的DMEM培養(yǎng)基，每組3復(fù)孔，加畢置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h后棄上清液，各孔加入100 μL(含CCK-8試劑10 μL)的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，用酶標儀檢測450 nm處各孔的吸收度，以阿德福韋酯作為陽性對照，用GraphPad Prism 5.0軟件計算各受試化合物的半數(shù)毒性濃度(CC50)。結(jié)果見表2。

3.2 細胞上清液HBV DNA的抑制試驗

取濃度為每毫升5×104個HepG2.2.15單細胞懸液100 μL加入96孔培養(yǎng)板中，于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，次日吸棄上清液，加入含不同受試化合物濃度(10,1,0.1和0 mol/L)的DMEM培養(yǎng)基中，每組3復(fù)孔。每次作用2 d后換同樣藥物濃度的細胞培養(yǎng)液，并于第10天收集各孔上清液至1.5 mL離心管中，-20 ℃凍存?zhèn)溆?。取待測樣品100 μL，用HBV熒光定量PCR試劑盒測定其HBV的DNA含量。以GraphPad Prism 5.0軟件計算各受試化合物的EC50，以及作用選擇性指數(shù)SI=CC50/EC50，以阿德福韋酯作為陽性對照。結(jié)果見表2。

Table2 Anti-HBV evaluation result of target compounds6a-6j

CompdEC50/(μmol/L)CC50/(μmol/L)SI6a11258657076956b3344066812186c09247162512636d-128679-6e35248502137796f969618433819016g71582131114876h1479207161140076i32389670229866j881788538950Adefovirdipivoxil3094389214204

SI=CC50/EC50

4 動物體內(nèi)分布實驗

課題組先前研究顯示，該類化合物在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染NTCP的HEK293細胞中攝取率的增加可能是由于結(jié)構(gòu)中存在能夠被NTCP蛋白特異性識別和轉(zhuǎn)運的底物而參與的主動轉(zhuǎn)運過程[14]。為了進一步考察該類藥物在體內(nèi)是否有肝靶向性，本研究篩選出一個抗病毒活性好且作用選擇性指數(shù)高的化合物6c，進行小鼠體內(nèi)分布實驗。

4.1 檢測條件與樣品處理方法

4.1.1 色譜條件 色譜柱：Waters BEH C18柱(2.1 mm×50 mm,1.7 μm)；保護柱：Waters Van Guard BEH C18柱(2.1 mm×5 mm,1.7 μm)；流動相：A：乙腈(含0.1%甲酸)，B：水(含0.1%甲酸)，梯度洗脫：5% A (0～1 min),5%～100% A(1～3 min),5% A(3～4 min)；流速：0.30 mL/min；柱溫：45 ℃；進樣體積：2.0 μL。

4.1.2 質(zhì)譜條件 離子監(jiān)測(NIM)，選擇離子監(jiān)測(SIR)模式，選擇正離子模式(ESI+)，碰撞氣流量：0.16 mL/min；毛細管電壓：3 kV，離子源溫度：120 ℃；噴霧氣與反吹氣：氮氣，去溶劑氣流速：650 L/h，去溶劑氣溫度：350 ℃，反吹氣流速為50 L/h，確定母離子(m/z)：501.48(阿德福韋酯)、821.45(6c)；錐孔電壓分別為30和35 V。

4.1.3 內(nèi)標液的制備 稱取格列脲苯5.0 mg，置100 mL量瓶甲醇超聲定容，得濃度為2.0 μg/mL內(nèi)標液，-20 ℃保存。

4.1.4 生物樣品處理 分別取小鼠心、肝、脾、肺、腎各器官，用生理鹽水漂洗殘留血，濾紙吸干，再取各器官100 mg，加生理鹽水900 μL手動勻漿，5 000 r/min，4 ℃離心10 min，取上清液。取10%組織勻漿液500 μL，加內(nèi)標溶液2 μL，渦旋混合30 s，加乙酸乙酯1.0 mL渦旋1 min，12 000 r/min，4 ℃離心10 min，取上清液氮氣吹干，加甲醇500 μL 復(fù)溶，渦旋1 min，12 000 r/min，4 ℃離心20 min，取上清液240 μL待測。

4.1.5 標準曲線的繪制[15]精密量取10%組織勻漿液500 μL分別加入等物質(zhì)的量濃度的阿德福韋酯、化合物6c，配制成0.5,1.0,2.5,5.0,10.0,20.0 μg/g的樣品，取240 μL置進樣瓶中，進樣量2 μL。以濃度c為橫坐標，峰面積A為縱坐標做線性回歸圖，得到血液及組織中受試化合物含量測定的標準曲線。結(jié)果表明ADV和化合物6c濃度在0.5～20.0 μg/g線性良好。

4.1.6 精密度、回收率、穩(wěn)定性 精密量取10%組織勻漿液500 μL分別加入等物質(zhì)的量濃度的阿德福韋酯、化合物6c，配制成1.0,5.0,20.0 μg/g的樣品，根據(jù)“4.1.4”項方法處理樣品，參考文獻[15-17]進行方法學(xué)驗證，結(jié)果顯示，ADV、化合物6c在心、肝、脾、肺、腎1～20 μg/g測定范圍內(nèi)RSD小于5%，其精密度、回收率、穩(wěn)定性均符合實驗要求。

4.2 給藥及組織樣品采集方案

取SPF級雄性昆明種小鼠80只，隨機分為阿德福韋酯、受試化合物6c兩組，每組40只小鼠。禁食不禁水12 h后，均按82.3 mg/kg灌胃阿德福韋酯或等物質(zhì)的量濃度受試化合物6c。給藥后15,30,45 min以及 1,2,6,8,12 h各取5只小鼠頸椎脫臼處死、解剖，取心、肝、脾、肺、腎各器官，用生理鹽水漂洗殘留血，濾紙吸干，再取各器官100 mg，加生理鹽水900 μL手動勻漿，5 000 r/min，4 ℃離心10 min，取上清液。取10%組織勻漿液500 μL，加內(nèi)標溶液2 μL，渦旋混合30 s，加乙酸乙酯1.0 mL渦旋1 min，12 000 r/min，4 ℃離心10 min，取上清液氮氣吹干，加甲醇500 μL復(fù)溶，渦旋1 min，12 000 r/min，4 ℃離心20 min，取上清液240 μL待測。

4.3 數(shù)據(jù)分析

4.4 結(jié) 果

實驗結(jié)果顯示，兩種藥物灌胃給藥后在各組織內(nèi)濃度分布呈現(xiàn)先增后減趨勢，且達峰時間均為2 h，化合物6c給藥后的15 min到12 h之間，每個時間點上，在肝中的含量均最高，其次是肺、脾、心，在腎中含量最低，阿德福韋酯在每個時間點上在腎中的含量高，其次是肝、心、肺，在脾中含量最低。見圖3、圖4。

5 結(jié)果與討論

抗HBV活性研究發(fā)現(xiàn)，除了化合物6d外目標化合物均具有抗病毒活性(EC500.92～96.96 μmol/L)，其中化合物6c的抗HBV活性最強，作用選擇性指數(shù)最高(EC500.92 μmol/L,SI 512.63)，其體外抗病毒效果明顯優(yōu)于陽性對照阿德福韋酯(EC503.09 μmol/L,SI 142.04)。初步構(gòu)效關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)，目標化合物結(jié)構(gòu)中含有硫酯結(jié)構(gòu)的化合物(6f～6j)抗病毒活性與作用選擇性指數(shù)(EC507.15～96.96 μmol/L,SI 19.01～140.07)均低于氧酯結(jié)構(gòu)的化合物(6a～6e)(EC500.92～11.25 μmol/L,SI 76.95～512.63)；目標化合物結(jié)構(gòu)中引入熊去氧膽酸片段的化合物活性(EC500.92～17.79 μmol/L)抗病毒活性強于引入去氧膽酸片段化合物活性(EC503.52～96.96 μmol/L)；當膽酸片段相同時，L-氨基酸酯片段中的烴基部分為1-甲基丙基時，其氧酯和硫酯化合物的抗病毒活性(EC503.52～8.81 μmol/L)比烴基部分為其他基團活性(EC5011.25～96.96 μmol/L)要強；另外，L-氨基酸與阿德福韋膦酸間的連接鏈長對抗病毒活性也有影響，當其為L-氨基酸乙酯時(n=1)，化合物(6c,6e,6h,6j)抗病毒活性(EC500.92～14.79 μmol/L)強于其為L-氨基酸丙酯(n=2)的化合物(6a,6b,6d,6f,6g)(EC503.34～96.96 μmol/L)。

小鼠體內(nèi)分布實驗結(jié)果顯示，化合物6c和陽性對照藥物阿德福韋酯在小鼠體內(nèi)分布廣泛，在心、肝、脾、肺、腎中均能檢測到。藥物在各器官中的達峰時間均為2 h，并且各器官中的藥物含量不同。在給藥0.25～2 h每個檢測時間點，化合物6c在肝中的含量均為最高，腎中含量均最低；阿德福韋酯在上述各時間點在腎中的含量均為最高，在脾中均最低。在給藥15 min～2 h的每個檢測時間點上，化合物6c在肝中的含量[(8.02±0.48)～(12.13±1.09)μg/g]均高于阿德福韋酯的含量[(2.05±0.12)～(5.65±0.42)μg/g]，同時在上述各時間點上化合物6c在腎中的含量[(1.75±0.11)～(3.96±0.10)μg/g]均低于阿德福韋酯的含量[(6.59±0.41)～(9.33±0.82)μg/g]，該結(jié)果表明，化合物6c在肝中分布效率明顯高于陽性對照阿德福韋酯，而在腎中分布效率明顯低于阿德福韋酯。以上研究結(jié)果提示采用單L-氨基酸酯，單膽酸酯前藥修飾策略能夠賦予目標化合物肝靶向性分布特征并降低其腎分布。

鑒于化合物6c的抗病毒活性、作用選擇性指數(shù)均優(yōu)于阿德福韋酯，并且提示其具有較高肝分布特性、較低的腎分布特性，因此，其具有進一步研究的價值。

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