韓 春，吳林韜，胡曉琴，孫 龍，黃張建，張奕華*

(1長(zhǎng)治學(xué)院化學(xué)系，長(zhǎng)治 046000；2中國(guó)藥科大學(xué)新藥研究中心,南京 210009;3中國(guó)藥科大學(xué)江蘇省代謝性疾病藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210009)

肺癌是一種發(fā)病率和死亡率非常高的惡性腫瘤[1]，其中非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)約占肺癌總發(fā)病率的85%[2]。由于表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)在NSCLC中過度表達(dá)或突變[3]，EGFR酪氨酸激酶抑制劑近年來已成為臨床治療NSCLC的有效藥物[4]。文獻(xiàn)報(bào)道，具有母核苯胺基嘧啶的EGFR酪氨酸激酶抑制劑(osimertinib、rociletinib和WZ4002等)能夠選擇性地抑制EGFR的突變體T790M，克服EGFR激酶抑制劑由于EGFR突變引起的耐受性差和/或因其抑制突變型/野生型(WT)EGFR選擇性差的缺點(diǎn)，在NSCLC治療上頗具特色和優(yōu)勢(shì)[5-7]。

一氧化氮(NO)作為一種重要的信使和效應(yīng)分子，在體內(nèi)心血管、神經(jīng)、免疫等系統(tǒng)具有重要功能[8]。近年來研究表明，一些NO供體具有顯著的抗腫瘤活性[9]。偶氮鎓二醇鹽是一類重要的NO供體，與細(xì)胞毒藥物聯(lián)用或與抗腫瘤藥物雜合可協(xié)同發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)[10]。本文在前期研究基礎(chǔ)上[11-13]，以苯胺基嘧啶為母核，將其與偶氮鎓二醇鹽分別通過硫醚、亞砜、砜等雜合得到新化合物9a～9e、10a～10e、11a～11e，并對(duì)其NSCLC細(xì)胞增殖抑制活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，希望獲到新型、高效的抗NSCLC藥物。

1 合成路線

目標(biāo)化合物9a～9e、10a～10e、11a～11e的合成見路線1。2-溴-1-三氟甲磺酰氧基乙烷(2)在相轉(zhuǎn)移催化劑15-冠-5的作用下與不同仲胺取代的偶氮鎓二醇鹽1a～1e發(fā)生反應(yīng)，生成O2-溴乙基-偶氮鎓二醇鹽3a～3e。間羥基苯甲醇4選擇性溴代芐位羥基，生成間羥基溴芐5。用KSAc將5的芐位溴取代，生成硫代乙酸酯6?；衔?與2,4,5-三氯嘧啶反應(yīng)生成芳醚7。化合物7與2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-)苯胺縮合生成苯胺基嘧啶8，然后與化合物3a～3e在堿性條件下發(fā)生取代反應(yīng)得到化合物9a～9e?；衔?a～9e在不同溫度下與間氯過氧苯甲酸(m-CPBA)反應(yīng)，分別得到亞砜類和砜類化合物10a～10e和11a～11e。

Scheme1Synthetic route to the target compounds9a-9e,10a-10eand11a-11e

Reagents and conditions:(a) 15-crown-5,dry THF,25 °C,5 h;(b) PBr3,CHCl3,0 °C-r.t.,2 h;(c) KSAc,dry THF,reflux,1 h;(d) 2,4,5-trichloropyrimidine,K2CO3,DMF,r.t.,2 h;(e) 2-methoxy-4-(4-methylpiperazin-1-yl)aniline,TFA,2-BuOH,reflux,3 h;(f)3a-3e,KOH,MeOH,r.t.,4 h;(g)m-CPBA,anhydrous CH2Cl2,-20 °C,30 min;(h)m-CPBA,anhydrous CH2Cl2,-5 °C,30 min

2 合成實(shí)驗(yàn)

2.1 儀器與試劑

采用SGWX-4顯微熔點(diǎn)儀(上海儀電物理光學(xué)儀器有限公司)測(cè)定化合物熔點(diǎn)(溫度未經(jīng)校正)；質(zhì)譜采用HP 1100 LC/MSD質(zhì)譜儀(美國(guó)安捷倫科技公司)測(cè)定；核磁共振氫譜采用Bruker ACF-300型磁共振儀(德國(guó)布魯克公司)測(cè)定，TMS為內(nèi)標(biāo)。實(shí)驗(yàn)所用試劑均為市售化學(xué)純或分析純，必要的情況下，按照標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行純化和干燥處理?；衔?a～1e、2[14]、3a、3c、3e[15]、5[16]參照文獻(xiàn)方法合成。

2.2 化學(xué)合成

1-(2-溴乙氧基)-3-甲基-3-苯基三氮-1-烯-2-氧化物(3b) 仲胺取代的偶氮鎓二醇鈉鹽1b(1.00 g，5.29 mmol)加到無水THF中，滴加15-冠-5，然后在0 ℃下緩慢將2-溴-1-三氟甲磺酰氧基乙烷(2)滴加到反應(yīng)液中，室溫反應(yīng)5 h。將反應(yīng)液旋干，加乙酸乙酯溶解，然后用飽和食鹽水洗3遍，有機(jī)層用無水硫酸鈉干燥，濃縮，柱色譜(石油醚-乙酸乙酯，5∶1)。得黃色油狀物722 mg，收率50%。ESI-MS：m/z274.1[M+H]+；1H NMR(300 MHz，CDCl3)δ：3.34(3H，s，NCH3)，3.58(2H，t，J=6.78 Hz，BrCH2)，4.53(2H，t，J=6.81 Hz，OCH2)，7.16(2H，d，J=8.1 Hz，ArH)，7.23(1H，t，J=7.38 Hz，ArH)，7.39(2H，t，J=8.04 Hz，ArH)。

2-(2-溴乙氧基)-1-嗎啉二氮烯-1-氧化物(3d) 參照化合物3b的合成方法，由化合物1d(1.00 g，5.92 mmol)制得黃色油狀物823 mg，收率55%。ESI-MS：m/z254.0[M+H]+；1H NMR(300 MHz，CDCl3)δ:3.44(4H，t，J=4.32 Hz，2×NCH2)，3.59(2H，t，J=6.60 Hz，BrCH2)，3.84(4H，t，J=4.56 Hz，2×OCH2)，4.49(2H，t，J=6.66 Hz，OCH2)。

S-3-羥基苯甲基硫代乙酸(6) 將化合物5(505 mg，2.7 mmol)溶于THF中，加入KSAC(370 mg，3.24 mmol)，回流2 h后將THF旋干，向殘余物中加水，用CH2Cl2萃取(3×20 mL)，合并有機(jī)層，無水硫酸鈉干燥，柱色譜(石油醚-乙酸乙酯,10∶1)，得棕色油狀物390 mg，收率80%。ESI-MS：m/z181.0[M-H]-；1H NMR(300 MHz，CDCl3)δ：2.29(3H，s，SCOCH3)，4.06(2H，s，ArCH2)，6.77(1H，d，J=7.81 Hz，ArH)，6.87(1H，s，ArH)，6.96(1H，d，J=7.56 Hz，ArH)，7.14(1H，t，J=7.74 Hz，ArH)。

S-3-(2,5-二氯嘧啶-4-氧)苯甲基硫代乙酸(7) 中間體6(364 mg，2.00 mmol)、2,4,5-三氯嘧啶(0.23 mL，2.00 mmol)和K2CO3(552 mg，2.00 mmol)加到DMF 10 mL中，室溫?cái)嚢? h，將反應(yīng)液倒入冰水中，攪拌至有白色固體析出，過濾，濾餅即為產(chǎn)品，得560 mg，收率85%，無須純化直接投下一步使用。ESI-MS：m/z329.0[M+H]+；1H NMR(300 MHz，CDCl3)δ：2.29(3H，s，SCOCH3)，4.06(2H，s，ArCH2)，6.76(1H，d，J=7.83 Hz，ArH)，6.87(1H，s，ArH)，6.97(1H，d，J=7.65 Hz，ArH)，7.16(1H，t，J=7.74 Hz，ArH)，8.22(1H，s，ArH)。

S-3-(5-氯-2-(2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-苯基)氨基)嘧啶-4-氧)苯甲基硫代乙酸(8) 2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-)苯胺(372 mg，1.68 mmol)、7(496 mg，1.68 mmol)、TFA(0.25 mL，3.36 mmol)加到仲丁醇20 mL中，加熱到100 ℃反應(yīng)3 h。反應(yīng)液直接旋干，濃縮，制砂，柱色譜(二氯甲烷-甲醇，25∶1)。得黃色固體475 mg，收率55%。ESI-MS：m/z514.1[M+H]+；1H NMR(300 MHz，CDCl3)δ：2.30(3H，s，COCH3)，2.38(3H，s，NCH3)，2.62(4H，t，J=4.57 Hz，2×CH3NCH2CH2N)，3.14(4H，t，J=4.75 Hz，2×CH3NCH2CH2N)，3.82(3H，s，OCH3)，4.14(2H，s，ArCH2S)，6.19(1H，d，J=7.2 Hz，ArH)，6.46(1H，s，ArH)，7.09(1H，d，J=7.95 Hz，ArH)，7.16(1H，s，ArH)，7.25(2H，d，J=6.57 Hz，ArH)，7.39(1H，t，J=7.77 Hz，ArH)，7.48(1H，br.s，ArNH)，8.22(1H，s，ArH)。

目標(biāo)化合物9a～9e的合成通法 先將KOH(300 mg，5.26 mmol)溶于甲醇3 mL中，配成KOH的甲醇溶液。將化合物3a～3e(1.30 mmol)、8(450 mg，0.88 mmol)溶于甲醇中，并滴加KOH的甲醇溶液，室溫反應(yīng)過夜。用稀鹽酸將反應(yīng)液調(diào)至中性，濃縮，制砂，柱色譜(二氯甲烷-甲醇，30∶1)。

2-(2-(3-(5-氯-2-(2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯胺)嘧啶-4-氧)芐基)硫乙氧基)-1-(哌啶-1-基)二氮烯-1-氧化物(9a) 由化合物3a和8反應(yīng)制得黃色固體542 mg，收率65%。mp：86～88 ℃；ESI-MS：m/z643.4[M+H]+；1H NMR(300 MHz，CDCl3)δ：1.48(2H，quint，J=5.64 Hz，NCH2CH2CH2)，1.76(4H，quint，J=5.73 Hz，2×NCH2CH2)，2.36(3H，s，NCH3)，2.59(4H，t，J=4.38 Hz，2×CH3NCH2CH2N)，2.72(2H，t，J=6.90 Hz，SCH2)，3.11(4H，t，J=4.44 Hz，2×CH3NCH2CH2N)，3.30(4H，t，J=5.49 Hz，2×NCH2)，3.80(2H，s，ArCH2S)，3.81(3H，s，OCH3)，4.26(2H，t，J=6.93 Hz，OCH2)，6.18(1H，d，J=5.49 Hz，ArH)，6.45(1H，s，ArH)，7.11(1H，d，J=7.95 Hz，ArH)，7.20(1H，s，ArH)，7.30(1H，d，J=7.53 Hz，ArH)，7.41(2H，t，J=7.68 Hz，ArH)，7.55(1H，br.s，ArNH)，8.23(1H，s，ArH)。

1-(2-(3-(5-氯-2-(2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯胺)嘧啶-4-氧)芐基)硫乙氧基)-3-甲基-3-苯基三氮-1-烯-2-氧化物(9b) 由化合物3b和8反應(yīng)制得黃色固體587 mg，收率68%。mp：36～38 ℃；ESI-MS：m/z665.3[M+H]+；1H NMR(300 MHz，CDCl3)δ：2.36(3H，s，NCH3)，2.58(4H，t，J=4.29 Hz，2×CH3NCH2CH2N)，2.72(2H，t，J=6.81 Hz，SCH2)，3.11(4H，t，J=4.5 Hz，2×CH3NCH2CH2N)，3.30(3H，s，ArNCH3)，3.80(5H，s，ArCH2S，OCH3)，4.31(2H，t，J=6.84 Hz，OCH2)，6.17(1H，d，J=5.49 Hz，ArH)，6.45(1H，s，ArH)，7.12(3H，d，J=7.74 Hz，ArH)，7.20(2H，t，J=6.54 Hz，ArH)，7.29(1H，d，J=6.15 Hz，ArH)，7.35(3H，t，J=7.89 Hz，ArH)，7.40(1H，t，J=7.62 Hz，ArH)，7.55(1H，br.s，ArNH)，8.22(1H，s，ArH)。

2-(2-(3-(5-氯-2-(2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯胺)嘧啶-4-氧)芐基)硫乙氧基)-1-(吡咯烷-1-基)二氮烯-1-氧化物(9c) 由化合物3c和8反應(yīng)制得黃色固體570 mg，收率70%。mp：51～53 ℃；ESI-MS：629.4m/z[M+H]+；1H NMR(300 MHz，CDCl3)δ：1.92(4H，m，2×NCH2CH2)，2.36(3H，s，NCH3)，2.58(4H，t，J=4.29 Hz，2×CH3NCH2CH2N)，2.71(2H，t，J=6.54 Hz，SCH2)，3.11(4H，t，J=4.5 Hz，2×CH3NCH2CH2N)，3.47(4H，m，2×NCH2)，3.81(5H，s，ArCH2S，OCH3)，4.22(2H，t，J=6.66 Hz，OCH2)，6.18(1H，d，J=5.49 Hz，ArH)，6.45(1H，s，ArH)，7.11(1H，d，J=7.62 Hz，ArH)，7.20(1H，s，ArH)，7.31(1H，d，J=7.56 Hz，ArH)，7.41(2H，t，J=7.17 Hz，ArH)，7.53(1H，br.s，ArNH)，8.23(1H，s，ArH)。

2-(2-(3-(5-氯-2-(2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯胺)嘧啶-4-氧)芐基)硫乙氧基)-1-嗎啉二氮烯-1-氧化物(9d) 由化合物3d和8反應(yīng)制得黃色固體653 mg，收率78%。mp：34～36 ℃；ESI-MS：m/z645.3[M+H]+；1H NMR(300 MHz，CDCl3)δ：2.37(3H，s，NCH3)，2.59(4H，t，J=4.29 Hz，2×CH3NCH2CH2N)，2.71(2H，t，J=6.54 Hz，SCH2)，3.11(4H，t，J=4.5 Hz，2×CH3NCH2CH2N)，3.37(4H，t，J=4.32 Hz，2×NCH2)，3.81(9H，m，2×OCH2，ArCH2S，OCH3)，4.26(2H，t，J=6.66 Hz，OCH2)，6.18(1H，d，J=5.49 Hz，ArH)，6.45(1H，s，ArH)，7.11(1H，d，J=7.56 Hz，ArH)，7.20(1H，s，ArH)，7.31(1H，d，J=7.80 Hz，ArH)，7.42(2H，t，J=7.17 Hz，ArH)，7.54(1H，br.s，ArNH)，8.23(1H，s，ArH)。

1-(2-(3-(5-氯-2-(2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯胺)嘧啶-4-氧)芐基)硫乙氧基)-3,3-二乙基三氮-1-烯-2-氧化物(9e) 由化合物3e和8反應(yīng)制得黃色固體590 mg，收率72%。mp：44～46 ℃；ESI-MS：m/z631.3[M+H]+；1H NMR(300 MHz，CDCl3)δ：1.06(6H，t，J=6.24 Hz，2×NCH2CH3)，2.37(3H，s，NCH3)，2.59(4H，t，J=4.29 Hz，2×CH3NCH2CH2N)，2.74(2H，t，J=6.66 Hz，SCH2)，3.09(8H，q，J=6.84 Hz，2×NCH2CH3，2×CH3NCH2CH2N)，3.81(5H，s，ArCH2S，OCH3)，4.32(2H，t，J=6.63 Hz，OCH2)，6.19(1H，d，J=5.49 Hz，ArH)，6.45(1H，s，ArH)，7.11(1H，d，J=7.71 Hz，ArH)，7.21(1H，s，ArH)，7.31(1H，d，J=7.80 Hz，ArH)，7.41(2H，t，J=7.62 Hz，ArH)，7.56(1H，br.s，ArNH)，8.23(1H，s，ArH)。

目標(biāo)化合物10a～10e的合成通法 將化合物9a～9e(0.32 mmol)溶于無水CH2Cl210 mL中，在-20 ℃下將75%的間氯過氧苯甲酸m-CPBA(74 mg，0.32 mmol)的無水CH2Cl2溶液緩慢滴加到反應(yīng)液中(約30 min)，滴加完畢即停止反應(yīng)，向反應(yīng)液中加入飽和碳酸氫鈉，分離有機(jī)層，用CH2Cl2萃取水層兩次，合并有機(jī)層。柱色譜(二氯甲烷-甲醇，5∶1)。

2-(2-(3-(5-氯-2-(2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯胺)嘧啶-4-氧)芐基)亞磺酰乙氧基)-1-(哌啶-1-基)二氮烯-1-氧化物(10a) 由化合物9a制得，黃色固體50 mg，收率24%。mp：104～106 ℃；ESI-MS：m/z659.3[M+H]+；1H NMR(300 MHz，CDCl3)δ：1.49(2H，quint，J=5.52 Hz，NCH2CH2CH2)，1.73(4H，quint，J=5.25 Hz，2×NCH2CH2)，2.72(2H，t，J=6.96 Hz，SOCH2)，3.30(4H，t，J=5.58 Hz，2×NCH2)，3.33(3H，s，NCH3)，3.49(4H，t，J=10.68 Hz，2×CH3NCH2CH2N)，3.70(4H，t，J=10.17 Hz，2×CH3NCH2CH2N)，3.81(2H，s，ArCH2SO)，3.82(3H，s，OCH3)，4.27(2H，t，J=6.93 Hz，OCH2)，6.24(1H，d，J=5.49 Hz，ArH)，6.48(1H，s，ArH)，7.12(1H，d，J=7.74 Hz，ArH)，7.20(1H，s，ArH)，7.32(1H，d，J=7.89 Hz，ArH)，7.42(2H，t，J=7.83 Hz，ArH)，7.48(1H，br.s，ArNH)，8.25(1H，s，ArH)。

1-(2-(3-(5-氯-2-(2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯胺)嘧啶-4-氧)芐基)亞磺酰乙氧基)-3-甲基-3-苯基三氮-1-烯-2-氧化物(10b) 由化合物9b制得，黃色固體45 mg，收率21%。mp：52～54 ℃；ESI-MS：m/z681.3[M+H]+；1H NMR(300 MHz，CDCl3)δ：2.72(2H，t，J=6.87 Hz，SOCH2)，3.30(8H，m，NCH3，ArNCH3，CH3NCH2CH2N)，3.45(2H，t，J=10.83 Hz，CH3NCH2CH2N)，3.69(4H，t，J=10.83 Hz，2×CH3NCH2CH2N)，3.81(5H，s，ArCH2SO，OCH3)，4.32(2H，t，J=6.84 Hz，OCH2)，6.22(1H，d，J=6.63 Hz，ArH)，6.47(1H，s，ArH)，7.12(3H，d，J=7.74 Hz，ArH)，7.20(2H，t，J=6.54 Hz，ArH)，7.29(1H，d，J=6.15 Hz，ArH)，7.35(3H，t，J=7.89 Hz，ArH)，7.44(1H，t，J=7.62 Hz，ArH)，7.49(1H，br.s，ArNH)，8.24(1H，s，ArH)。

2-(2-(3-(5-氯-2-(2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯胺)嘧啶-4-氧)芐基)亞磺酰乙氧基)-1-(吡咯烷-1-基)二氮烯-1-氧化物(10c) 由化合物9c制得，黃色固體58 mg，收率28%。mp：41～43 ℃；ESI-MS：m/z645.3[M+H]+；1H NMR(300 MHz，CDCl3)δ：1.92(4H，m，2×NCH2CH2)，2.71(2H，t，J=6.54 Hz，SOCH2)，3.34(7H，m，2×CH3NCH2CH2N，NCH3)，3.49(6H，m，2×NCH2，CH3NCH2CH2N)，3.67(2H，t，J=11.01 Hz，CH3NCH2CH2N)，3.82(5H，s，ArCH2SO，OCH3)，4.23(2H，t，J=6.66 Hz，OCH2)，6.21(1H，d，J=5.49 Hz，ArH)，6.47(1H，s，ArH)，7.11(1H，d，J=7.32 Hz，ArH)，7.20(1H，s，ArH)，7.32(1H，d，J=7.29 Hz，ArH)，7.43(1H，t，J=7.5 Hz，ArH)，7.49(1H，s，ArH)，7.53(1H，br.s，ArNH)，8.24(1H，s，ArH)。

2-(2-(3-(5-氯-2-(2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯胺)嘧啶-4-氧)芐基)亞磺酰乙氧基)-1-嗎啉二氮烯-1-氧化物(10d) 由化合物9d制得，黃色固體62 mg，收率29%。mp：96～98 ℃；ESI-MS：m/z661.3[M+H]+；1H NMR(300 MHz，CDCl3)δ：2.72(2H，t，J=6.84 Hz，SOCH2)，3.30(7H，m，2×CH3NCH2CH2N，NCH3)，3.38(4H，t，J=4.77 Hz，2×NCH2CH2O)，3.48(2H，t，J=12.75 Hz，CH3NCH2CH2N)，3.69(2H，t，J=11.22Hz，CH3NCH2CH2N)，3.81(9H，m，2×NCH2CH2O，ArCH2SO，OCH3)，4.27(2H，t，J=6.84 Hz，OCH2)，6.22(1H，d，J=5.49 Hz，ArH)，6.48(1H，s，ArH)，7.12(1H，d，J=7.8 Hz，ArH)，7.21(1H，s，ArH)，7.32(1H，d，J=6.72 Hz，ArH)，7.43(2H，t，J=7.8 Hz，ArH)，7.54(1H，br.s，ArNH)，8.25(1H，s，ArH)。

1-(2-(3-(5-氯-2-(2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯胺)嘧啶-4-氧)芐基)亞磺酰乙氧基)-3,3-二乙基三氮-1-烯-2-氧化物(10e) 由化合物9e制得，黃色固體48 mg，收率23%。mp：155～157 ℃；ESI-MS：m/z647.4[M+H]+；1H NMR(300 MHz，CDCl3)δ：1.06(6H，t，J=6.96 Hz，2×NCH2CH3)，2.75(2H，t，J=6.75 Hz，SOCH2)，3.08(4H，q，J=6.96 Hz，2×NCH2CH3)，3.29(4H，t，J=12.75 Hz，2×CH3NCH2CH2N)，3.32(3H，s，NCH3)，3.50(2H，t，J=10.62 Hz，CH3NCH2CH2N)，3.71(2H，t，J=12.03 Hz，CH3NCH2CH2N)，3.81(5H，s，ArCH2SO，OCH3)，4.32(2H，t，J=6.84 Hz，OCH2)，6.23(1H，d，J=5.49 Hz，ArH)，6.49(1H，s，ArH)，7.11(1H，d，J=7.41 Hz，ArH)，7.21(1H，s，ArH)，7.31(1H，d，J=7.8 Hz，ArH)，7.43(1H，t，J=7.65 Hz，ArH)，7.48(1H，s，ArH)，7.58(1H，br.s，ArNH)，8.24(1H，s，ArH)。

目標(biāo)化合物11a～11e的合成通法 將化合物9a～9e(0.32 mmol)溶于無水CH2Cl210 mL中，在-5 ℃下將75%的間氯過氧苯甲酸(m-CPBA，148 mg，0.64 mmol)的無水CH2Cl2溶液緩慢滴加到反應(yīng)液當(dāng)中(約30 min)，滴加完畢即停止反應(yīng)，向反應(yīng)液中加入飽和碳酸氫鈉，分離有機(jī)層，用CH2Cl2萃取水層2次，合并有機(jī)層。柱色譜(四氫呋喃-甲醇，1∶2)。

2-(2-(3-(5-氯-2-(2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯胺)嘧啶-4-氧)芐基)磺酰乙氧基)-1-(哌啶-1-基)二氮烯-1-氧化物(11a) 由化合物9a制得，黃色固體78 mg，收率36%。mp：95～97 ℃；ESI-MS：m/z675.3[M+H]+；1H NMR(300 MHz，CDCl3)δ：1.47(2H，quint，J=5.52 Hz，NCH2CH2CH2)，1.72(4H，quint，J=5.25 Hz，2×NCH2CH2)，2.83(1H，m，SO2CH2)，3.02(1H，m，SO2CH2)，3.30(11H，m，2×NCH2，2×CH3NCH2CH2N，NCH3)，3.48(2H，t，J=11.07 Hz，CH3NCH2CH2N)，3.71(2H，t，J=12.03 Hz，CH3NCH2CH2N)，3.83(3H，s，OCH3)，4.04(1H，d，J=12.87 Hz，OCH2)，4.20(1H，d，J=13.02 Hz，OCH2)，4.52(2H，m，ArCH2SO2)，6.26(1H，d，J=7.98 Hz，ArH)，6.47(1H，s，ArH)，7.21(1H，s，ArH)，7.22(1H，d，J=6.99 Hz，ArH)，7.34(1H，d，J=7.53 Hz，ArH)，7.49(2H，t，J=6.42 Hz，ArH)，7.55(1H，br.s，ArNH)，8.25(1H，s，ArH)。

1-(2-(3-(5-氯-2-(2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯胺)嘧啶-4-氧)芐基)磺酰乙氧基)-3-甲基-3-苯基三氮-1-烯-2-氧化物(11b) 由化合物9b制得，黃色固體86 mg，收率39%。mp：52～54 ℃；ESI-MS：m/z697.3[M+H]+；1H NMR(300 MHz，CDCl3)δ：2.83(1H，m，SO2CH2)，3.02(1H，m，SO2CH2)，3.31(8H，m，NCH3，ArNCH3，CH3NCH2CH2N)，3.47(2H，t，J=10.83 Hz，CH3NCH2CH2N)，3.68(4H，t，J=10.95 Hz，2×CH3NCH2CH2N)，3.83(3H，s，OCH3)，4.04(1H，d，J=12.87 Hz，OCH2)，4.20(1H，d，J=13.02 Hz，OCH2)，4.57(2H，m，ArCH2SO2)，6.25(1H，d，J=6.63 Hz，ArH)，6.46(1H，s，ArH)，7.14(3H，d，J=7.74 Hz，ArH)，7.20(2H，t，J=6.54 Hz，ArH)，7.29(1H，d，J=6.15 Hz，ArH)，7.36(3H，t，J=7.89 Hz，ArH)，7.44(1H，t，J=7.62 Hz，ArH)，7.49(1H，br.s，ArNH)，8.32(1H，s，ArH)。

2-(2-(3-(5-氯-2-(2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯胺)嘧啶-4-氧)芐基)磺酰乙氧基)-1-(吡咯烷-1-基)二氮烯-1-氧化物(11c) 由化合物9c制得，黃色固體95 mg，收率45%。mp：101～103 ℃；ESI-MS：m/z661.3[M+H]+；1H NMR(300 MHz，CDCl3)δ：1.93(4H，m，2×NCH2CH2)，2.83(1H，m，SO2CH2)，3.02(1H，m，SO2CH2)，3.29(7H，m，2×CH3NCH2CH2N，NCH3)，3.48(6H，m，2×NCH2，CH3NCH2CH2N)，3.71(2H，t，J=10.59 Hz，CH3NCH2CH2N)，3.83(3H，s，OCH3)，4.05(1H，d，J=12.84 Hz，OCH2)，4.21(1H，d，J=12.99 Hz，OCH2)，4.48(2H，m，ArCH2SO2)，6.26(1H，d，J=7.92 Hz，ArH)，6.48(1H，s，ArH)，7.22(2H，d，J=7.32 Hz，ArH)，7.35(1H，d，J=7.65 Hz，ArH)，7.52(3H，m，2×ArH，ArNH)，8.25(1H，s，ArH)。

2-(2-(3-(5-氯-2-(2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯胺)嘧啶-4-氧)芐基)亞磺酰乙氧基)-1-嗎啉二氮烯-1-氧化物(11d) 由化合物9d制得，黃色固體83 mg，收率38%。mp：107～109 ℃；ESI-MS：m/z677.3[M+H]+；1H NMR(300 MHz，CDCl3)δ：2.83(1H，m，SO2CH2)，3.02(1H，m，SO2CH2)，3.30(7H，t，J=12.18 Hz，2×CH3NCH2CH2N，NCH3)，3.40(4H，t，J=4.86 Hz，2×NCH2CH2O)，3.47(2H，t，J=10.95 Hz，CH3NCH2CH2N)，3.68(2H，t，J=11.28 Hz，CH3NCH2CH2N)，3.81(7H，t，J=4.86 Hz，2×NCH2CH2O，OCH3)，4.03(1H，d，J=11.73 Hz，ArCH2SO2)，4.20(1H，d，J=12.99 Hz，ArCH2SO2)，4.54(2H，m，OCH2)，6.26(1H，d，J=7.74 Hz，ArH)，6.48(1H，s，ArH)，7.21(1H，s，ArH)，7.25(1H，d，J=7.44 Hz，ArH)，7.34(1H，d，J=7.68 Hz，ArH)，7.50(2H，t，J=7.83 Hz，ArH)，7.61(1H，br.s，ArNH)，8.25(1H，s，ArH)。

1-(2-(3-(5-氯-2-(2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯胺)嘧啶-4-氧)芐基)磺酰乙氧基)-3,3-二乙基三氮-1-烯-2-氧化物(11e) 由化合物9e制得，黃色固體80 mg，收率38%。mp：49～51 ℃；ESI-MS：m/z663.4[M+H]+；1H NMR(300 MHz，CDCl3)δ：1.05(6H，t，J=6.96 Hz，2×NCH2CH3)，2.86(H，m，SO2CH2)，3.04(H，m，SO2CH2)，3.11(4H，q，J=6.96 Hz，2×NCH2CH3)，3.29(4H，t，J=12.75 Hz，2×CH3NCH2CH2N)，3.31(3H，s，NCH3)，3.49(2H，t，J=10.20 Hz，CH3NCH2CH2N)，3.69(2H，t，J=11.22 Hz，CH3NCH2CH2N)，3.82(3H，s，OCH3)，4.05(1H，d，J=12.81 Hz，ArCH2SO2)，4.19(1H，d，J=12.99 Hz，ArCH2SO2)，4.58(2H，m，OCH2)，6.24(1H，d，ArH，J=5.49 Hz)，6.47(1H，s，ArH)，7.21(1H，s，ArH)，7.23(1H，d，J=7.41 Hz，ArH)，7.34(1H，d，J=7.83 Hz，ArH)，7.50(3H，t，J=7.35 Hz，2×ArH，ArNH)，8.25(1H，s，ArH)。

3 體外抗NSCLC活性測(cè)試

3.1 目標(biāo)化合物對(duì)H1975細(xì)胞的抑制率測(cè)定

以吉非替尼(gefitinib)為對(duì)照，采用MTT法測(cè)定目標(biāo)化合物9a～9e、10a～10e、11a～11e對(duì)含EGFR L858R/T790M突變體的人肺腺癌細(xì)胞H1975的增殖抑制活性。

按每孔1×103個(gè)細(xì)胞將H1975細(xì)胞株接種到96孔板中，在含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。目標(biāo)化合物以10 μmol/L的終濃度進(jìn)行給藥，每個(gè)化合物設(shè)3個(gè)復(fù)孔，加藥后繼續(xù)培養(yǎng)72 h。向每孔中加入MTT(5 g/L)20 μL 溶液繼續(xù)孵育4 h。棄上清液后，每孔加入DMSO 100 μL，振蕩10 min后選擇570 nm為測(cè)試波長(zhǎng)、630 nm為參比波長(zhǎng)于酶標(biāo)儀上測(cè)定吸收度(A)。按公式：抑制率=(1-藥物處理孔平均A/細(xì)胞對(duì)照孔平均A)×100%，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。結(jié)果如表1所示，當(dāng)藥物濃度為10 μmol/L時(shí)，硫醚類9a～9e對(duì)H1975細(xì)胞的增殖抑制率為92.30%～94.90%，均強(qiáng)于吉非替尼(54.84%)；亞砜類10a～10e和砜類11a～11e的抑制率分別為36.45%～84.25%和29.00%～50.60%，與吉非替尼相當(dāng)或弱于吉非替尼。

Table1Inhibition rate of target compounds against H1975 cells at 10 μmol/L

CompdInhibition/%CompdInhibition/%9a944510d84259b945010e36459c949011a29359d931011b35309e923011c506010a487511d351510b669011e290010c4260Gefitinib5484

3.2 目標(biāo)化合物9a～9e對(duì)H1975細(xì)胞的IC50測(cè)定

以吉非替尼為對(duì)照，對(duì)化合物8和活性較好的9a～9e分別設(shè)置0，0.000 1，0.001，0.01，0.05，0.1，1，10 μmol/L 8個(gè)濃度對(duì)腫瘤細(xì)胞H1975進(jìn)行增殖抑制實(shí)驗(yàn)，方法同上述篩選實(shí)驗(yàn)。利用GraphPad Prism 5.0中的Sigmodial Dose Response的非線性回歸模型計(jì)算化合物的IC50，結(jié)果見表2?；衔?a～9e(IC50=0.65～2.05 μmol/L)優(yōu)于吉非替尼(IC50=9.47 μmol/L)，其中化合物9b(IC50=0.65 μmol/L)活性最強(qiáng)。

Table2IC50of compounds9a-9eagainst H1975 cells

CompdIC50/(μmol/L)9a2059b0659c1219d0909e1128254Gefitinib947

3.3 分子對(duì)接研究

利用Discovery Studio 2017 R2軟件LibDock模塊進(jìn)行分子對(duì)接，預(yù)測(cè)化合物9b與EGFR T790M(PDB code：3IKA)的結(jié)合模式?；衔?b與EGFR T790M分別通過“Prepare Ligands”和“Prepare Protein”程序處理，利用3IKA的配體確定結(jié)合位點(diǎn)。模擬結(jié)果如圖1所示，ARG841與苯胺基嘧啶母核形成氫鍵；CYS797和ASP800分別通過氫鍵和靜電作用力與偶氮鎓二醇鹽片段中的O原子和N原子結(jié)合。

Figure1Predicted binding mode for compound9band EGFR T790M

4 結(jié)果和討論

構(gòu)效關(guān)系分析可知：(1)隨著目標(biāo)化合物中硫原子氧化程度的增加，抑制活性有所減弱，其順序?yàn)椋毫蛎杨?a～9e>亞砜類10a～10e>砜類11a～11e?？赡苁请S著硫原子氧化程度增加，化合物極性也相應(yīng)增加，不利于化合物透過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮作用；(2)含NO供體偶氮鎓二醇鹽的9a～9e其抑制作用整體上強(qiáng)于結(jié)構(gòu)上不含偶氮鎓二醇鹽的類似物8，提示NO可能對(duì)9a～9e的活性具有重要貢獻(xiàn)。

初步藥理研究結(jié)果表明，苯胺基嘧啶/偶氮鎓二醇鹽雜合物9b具有顯著抑制NSCLC細(xì)胞增殖的活性；此外，分子對(duì)接提示，化合物9b主要通過氫鍵和靜電作用力與靶點(diǎn)EGFR T790M結(jié)合。因此，有必要對(duì)化合物9b進(jìn)行深入研究。本研究將在后期工作中，研究其對(duì)EGFR激酶的抑制作用、體內(nèi)抗NSCLC活性及其作用機(jī)制等，結(jié)果將另文報(bào)道。

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