馮登超，高棟梁，白翠翠，高東東 ，武 斌，薛宏斌，楊喜明

（延安大學(xué)附屬醫(yī)院燒傷整形手外科，陜西 延安 716000）

增生性瘢痕多發(fā)于損傷深度累及真皮的創(chuàng)傷，與正常瘢痕相比，其形成過程中成纖維細(xì)胞增殖更活躍，膠原蛋白沉積更明顯，導(dǎo)致真皮纖維化更顯著[1]。目前，其治療方法主要有藥物、壓迫、放射、激光及外科手術(shù)等，但均無絕對的權(quán)威性[2]。研究證實(shí)，早期應(yīng)用丹芎瘢痕涂膜[3]和維芎瘢痕霜[4]可明顯抑制增生性瘢痕的增生。因此，如何調(diào)控瘢痕使其增生至適當(dāng)程度，成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。丹參川芎嗪注射液的主要化學(xué)成分為丹參素和川芎嗪，具有抑制炎癥[5]、抗纖維化[3]作用。本研究中采用兔耳瘢痕模型，觀察了丹參川芎嗪對增生性瘢痕組織的影響，為增生性瘢痕防治藥物的臨床應(yīng)用及開發(fā)提供理論和實(shí)驗依據(jù)?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

丹參川芎嗪注射液（貴州拜特制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字 H52020959，批號為20150512，規(guī)格為每支 5 mL）；鼠抗兔增殖細(xì)胞核抗原蛋白(PCNA)單克隆抗體（美國Santa Cruz公司）；三步法染色試劑盒和DAB試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 建模

取日本大耳白兔 16只，體質(zhì)量 2.0～2.5 kg，雌雄不論，購自延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗動物中心，分籠飼養(yǎng)。將動物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，參照文獻(xiàn)[6-7]方法，以30 g／L戊巴比妥鈉(30 mg／kg)作耳緣靜脈麻醉，兔耳腹側(cè)面皮膚碘伏、乙醇消毒，嚴(yán)格無菌操作技術(shù)下，在兔耳腹側(cè)中段沿長軸避開可見血管，作1 cm×1 cm大小創(chuàng)面，創(chuàng)面間隔1 cm以上，去掉兔耳全層皮膚，并用刮勺徹底刮除軟骨膜，創(chuàng)緣用電烙鐵燒灼，每耳6處，共192個創(chuàng)面，術(shù)后創(chuàng)面暴露，待其自行愈合后形成瘢痕增生塊。瘢痕組織高度不低于2 mm，硬度與兔耳軟骨相似時即為增生性瘢痕[8]。

1.2.2 動物分組及處理

分組：取16只日本大耳白兔，共制備192個全層皮膚缺損創(chuàng)面，傷后21 d創(chuàng)面均出現(xiàn)上皮化，局部注射丹參川芎嗪液。用微量注射器從創(chuàng)面周圍的正常皮膚進(jìn)針向中央內(nèi)注射，致瘢痕變蒼白并稍隆起。注射量每個瘢痕20 μL，每日 1 次，共 5 次。隨機(jī)分為 4 組(A，B，C，D 組)，各4只兔(48個瘢痕)。實(shí)驗組(以生藥鹽酸川芎嗪的質(zhì)量濃度為基準(zhǔn)）中B組給予質(zhì)量低濃度丹參川芎嗪組(100mg／L)，C 組給予中質(zhì)量濃度丹參川芎嗪(200mg／L)，D組給予高質(zhì)量濃度丹參川芎嗪(400 mg／L)；對照組(A組)給予相同容積的生理鹽水。

取材方式與處理：于術(shù)后第4周，每組隨機(jī)處死2只白兔，切取標(biāo)本。按1.2.1項下麻醉方式并消毒，切口沿瘢痕邊緣位于兔耳正常皮膚與瘢痕交界處，垂直于皮膚表面，深達(dá)軟骨表面，整個瘢痕組織完整切取。將每個瘢痕平均分成2份，1份用4%多聚甲醛固定24 h，常規(guī)脫水，透明，包埋，切片，然后分別進(jìn)行HE染色及PCNA免疫組織化學(xué)染色;1份用液氮快速冷凍，后轉(zhuǎn)為低溫冰箱-80℃保存，氯胺-T法測定羥脯氨酸(HPr)含量。其余繼續(xù)喂養(yǎng)，術(shù)后56 d，同樣在麻醉條件下處死每組最后2只白兔，切取瘢痕組織標(biāo)本。

1.2.3 觀察指標(biāo)與方法

瘢痕厚度測定：術(shù)后32，56 d用彩色超聲診斷儀(探頭超聲頻率為13 MHz)，同一測定人在相同條件下測定各組創(chuàng)面形成瘢痕的厚度。

瘢痕組織HE染色：瘢痕組織標(biāo)本用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)5 mm厚度切片，常規(guī)爬片。HE染色，觀察增生性瘢痕的病理表現(xiàn)。

PCNA免疫組化：于光鏡下觀察陽性信號，陽性信號為黃色。在400倍光鏡下觀察結(jié)果，在每張切片的上、中、下、左、右找5個視野進(jìn)行計數(shù)，陽性細(xì)胞反應(yīng)率(R)=陽性細(xì)胞數(shù)／細(xì)胞總數(shù)，結(jié)果取均數(shù)。

HPr含量測定[9-10]：標(biāo)準(zhǔn)管中加入 10 μg ／mL 的L-HPr，空白管調(diào)零。計算最終結(jié)果：每 1 g組織中HPr含量(mg／g)=測量管光度值÷標(biāo)準(zhǔn)管光度值×10(μg／mL)÷100÷標(biāo)本質(zhì)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件處理。計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用配對設(shè)計的 t檢驗、單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 瘢痕組織學(xué)觀察結(jié)果

術(shù)后32 d和56 d，實(shí)驗組瘢痕面積變小，高度變低，質(zhì)地變軟，與對照組比較，差異顯著。在HE染色法切片上，對照組瘢痕組織內(nèi)大量成纖維細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)和毛細(xì)血管可見膠原纖維呈環(huán)形或螺旋樣排列，組織內(nèi)少量炎性細(xì)胞；實(shí)驗組瘢痕組織內(nèi)成纖維細(xì)胞明顯少于對照組，膠原纖維及成纖維細(xì)胞排列較整齊，細(xì)胞外基質(zhì)多，毛細(xì)血管減少。在術(shù)后56 d，實(shí)驗組兔耳瘢痕組織較術(shù)后32 d真皮層更薄，膠原及成纖維細(xì)胞排列更整齊。HE染色結(jié)果見圖1。

2.2 瘢痕厚度測定

術(shù)后32 d和56 d，A組瘢痕組織厚度明顯高于B，C，D組，而B組又高于C，D組，C組高于D組。結(jié)果見表1。

2.3 PCNA免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

術(shù)后32 d和56 d，A組兔耳瘢痕組織PCNA表達(dá)明顯，黃色為陽性表達(dá)，D組PCNA表達(dá)明顯下降。術(shù)后32，56 d，實(shí)驗組PCNA較對照組標(biāo)的均有明顯下降。詳見表1。PCNA免疫組織化學(xué)染色結(jié)果見圖2。

2.4 HPr含量測定

在術(shù)后32 d和56 d的瘢痕組織中，HPr含量測定結(jié)果表明，實(shí)驗組較對照組明顯下降。結(jié)果見表1。

表1 各組兔耳瘢痕增生指數(shù)、PCNA陽性表達(dá)率和HPr含量比較（±s，mm，n=24）

表1 各組兔耳瘢痕增生指數(shù)、PCNA陽性表達(dá)率和HPr含量比較（±s，mm，n=24）

注：與 A 組同時點(diǎn)比較，#P ＜0.01；與本組 32 d時比較，bP ＜0.01。

組別 瘢痕增生指數(shù) P C N A陽性表達(dá)率 H P r含量(m g／g)A組B組C組D組3 2 d 3.1 2 7 ± 0.2 3 5 2.8 2 9 ± 0.1 9 3#2.4 3 8 ± 0.1 6 5#1.8 5 2 ± 0.1 8 3#5 6 d 3.0 1 5 ± 0.2 2 7 2.6 7 5 ± 0.1 8 5#b 2.3 7 3 ± 0.1 5 4#b 1.7 3 9 ± 0.1 9 2#b 3 2 d 6 8.7 ± 8.3 5 3.2 ± 6.5#4 6.5 ± 5.4#3 2.4 ± 3.9#5 6 d 5 4.9 ± 7.8 4 2.5 ± 5.4#b 3 5.7 ± 4.2#b 2 6.2 ± 3.8#b 3 2 d 1 6.5 8 3 ± 0.2 1 5 1 4.3 2 7 ± 0.1 9 4#1 3.2 5 3 ± 0.1 6 9#1 1.5 8 4 ± 0.1 7 3#5 6 d 1 5.8 6 9 ± 0.2 0 3 1 3.5 1 6 ± 0.1 8 4#b 1 2.7 2 3 ± 0.1 7 9#b 1 0.6 9 4 ± 0.1 8 2#b

圖1 術(shù)后32 d兩組瘢痕組織化學(xué)染色結(jié)果（HE×400）

圖2 術(shù)后32 d兩組PCNA免疫組織化學(xué)染色結(jié)果（SP×400）

3 討論

增生性瘢痕是整形外科基礎(chǔ)研究的重要課題之一，嚴(yán)重創(chuàng)傷、燒傷及外科手術(shù)后常常遺留增生性瘢痕，影響外觀和功能，但一直都缺乏理想的治療方法。近年研究結(jié)果顯示，越來越多的學(xué)者從中醫(yī)中藥中篩選出療效確切、不良反應(yīng)小的藥物來抗疤痕纖維化，其中丹參川芎嗪注射液是中藥丹參及川芎嗪按科學(xué)配方提取的復(fù)方注射液。研究證實(shí)，川芎嗪為一種新型鈣離子拮抗藥，可通過直接清除氧自由基、抗脂質(zhì)過氧化、抑制成纖維細(xì)胞分裂和增殖，從而起到抗組織損傷和防治肺纖維化的作用[11]；通過抑制肝脂質(zhì)過氧化、抑制星狀細(xì)胞活化增殖、降低膠原合成等途徑改善肝功能[12-13]。

本研究中采用局部注射丹參川芎嗪對兔耳瘢痕進(jìn)行治療，為避免注射不同濃度或?qū)φ账幬锍霈F(xiàn)相互影響，造模、隨機(jī)分組后行局部藥物干預(yù)，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗組中瘢痕組織厚度、硬度與藥物濃度呈負(fù)相關(guān)，實(shí)驗組瘢痕組織中PCNA蛋白陽性表達(dá)率和HPr含量明顯減少，呈劑量效應(yīng)關(guān)系；與對照組比較，其表達(dá)呈顯著性降低；不同時間點(diǎn)(術(shù)后32 d和56 d)取材的同濃度實(shí)驗組間相比，術(shù)后56 d的PCNA蛋白陽性表達(dá)率和HPr含量較術(shù)后32 d明顯減少。表明丹參川芎嗪可以明顯抑制PCNA蛋白陽性表達(dá)率和HPr的生成，進(jìn)而抑制成纖維細(xì)胞的增殖，減少膠原的合成。HE染色結(jié)果顯示，實(shí)驗組中成纖維細(xì)胞明顯少于對照組，表皮層增厚，成纖維細(xì)胞排列較規(guī)則，細(xì)胞外基質(zhì)多，可見少量毛細(xì)血管。說明丹參川芎嗪通過抑制成纖維細(xì)胞的增殖，可起到減輕瘢痕形成的作用，其療效與藥物濃度在一定范圍內(nèi)成正比。這與商慶新等[14]的研究結(jié)果一致。丹參川芎嗪為中藥丹參素和川芎嗪的衍生合成制劑，其藥理作用強(qiáng)，不良反應(yīng)小。進(jìn)一步研究其藥理活性，可望開發(fā)出高效、低毒、價廉的抗瘢痕新藥，有望通過改變藥物的劑型，增加藥物皮膚的滲透性，從而成為預(yù)防和治療人皮膚增生性瘢痕的有效藥物。

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