牛艷芳，閆 偉，陳立紅，崢 嶸(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學 林學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特0009；內(nèi)蒙古師范大學 生命科學與技術學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 000)

生物固氮是指微生物通過固氮酶的催化將大氣中的分子氮還原為氨的過程，在生物固氮中，固氮量的60%由陸生固氮生物完成，40%由海洋固氮生物完成[1-2]。到目前為止，所發(fā)現(xiàn)的生物固氮作用只存在于細菌域和古生菌域中,在分類地位上主要隸屬于固氮菌科(Azotobacteraceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、紅螺菌目(Rhodospirillales)、甲基球菌科(Methylococcacese)、藍細菌(Cyanobacteria)以及芽孢桿菌屬(Bacillus)和梭菌屬(Clostridium)中的部分菌種。自1886年人們首次分離出共生固氮的根瘤菌起，至2006年已發(fā)現(xiàn)的固氮微生物多達200余屬[3-6]。

近年來，很多學者熱衷于研究農(nóng)業(yè)作物及固氮樹種的固氮作用[7-13]，而對于非固氮樹種的固氮研究相對較少，僅限于楊樹、杉木、茶樹、馬尾松、桉樹等的初步研究，且集中在聯(lián)合固氮菌的回接對這些樹木的促生效應方面[14-21]。楊樹具有適應性強、生長速度快、輪伐期短等特點，已成為主要的造林樹種，廣泛地應用于森林保護、農(nóng)田防風固沙和道路兩邊的綠化等領域，其氮素來源于土壤和人工施用的氮肥，對土地消耗巨大[22-23]。楊樹作為非固氮樹種的典型代表，其固氮機制研究相對較少。因此，本研究對阿爾山國家森林公園自然保護區(qū)楊樹根際土壤固氮菌進行了篩選，并對其特性進行分析，旨在探明楊樹的固氮機制，為以非固氮樹種為主的森林生態(tài)系統(tǒng)的可持續(xù)發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于內(nèi)蒙古自治區(qū)東部興安盟的西北端，地處大興安嶺中段，被呼倫貝爾、錫林郭勒、科爾沁、蒙古四大草原所環(huán)抱，東鄰扎蘭屯市，西與錫林郭勒盟及蒙古國接壤，北與呼倫貝爾新巴爾虎左旗、鄂溫克旗毗鄰，南與興安盟科右前旗相接，地理坐標為北緯46°39′-47°39′，東經(jīng)119°28′-121°23′。年均溫度為-3.1 ℃，年平均濕度為70%，每年7-8月份濕度最大，約為80%，春季濕度在50%左右，冬季濕度為76%～79%。阿爾山森林資源豐富，森林面積46.4萬hm2，人工林10.53萬hm2，森林覆蓋率為79.2%，活立木蓄積量28 261 387.1 m3。林相以寒溫帶針闊葉混交林為主，樹種以興安落葉松、油松、山楊、白樺為主，均為非固氮樹種[24-25]。

2 研究方法

2.1 主要試劑

細菌基因組提取試劑盒，天根生化科技有限公司生產(chǎn)；TaqMaster Mix(2×)，購于南京博爾迪生物科技有限公司。試驗所用引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

阿須貝無氮培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，KH2PO40.2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaCl 0.2 g，CaSO40.2 g，CaCO35 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 000 mL，pH為7.0～7.2。

無機磷培養(yǎng)基：Ca3(PO4)25 g，葡萄糖10 g，(NH4)2SO40.5 g，NaCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，KCl 0.3 g，MnSO40.03 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。

2.2 土樣的采集

2015年8，在阿爾山國家森林公園自然保護區(qū)楊樹分布區(qū)內(nèi)選取一塊樣地，設置5個不同的采樣點(4個頂點加1個中心點)，每個采樣點選取一棵楊樹，去除地表的腐殖質，用無菌的鐵鍬挖取30 cm深的土壤，找到楊樹根系，將帶有根系的土壤裝入滅菌的密封袋，帶回實驗室于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 根際土壤固氮菌的分離與純化

[26-27]，采用阿須貝無氮培養(yǎng)基分離純化土壤樣品中的固氮菌。稱取土樣10 g，放入裝有90 mL無菌水的加玻璃珠的三角瓶中，在搖床上于150 r/min振蕩20 min，依次制成稀釋度分別為10-3，10-4，10-5的土壤懸液，分別接種到培養(yǎng)皿中，用無菌玻璃棒涂布均勻，28 ℃下培養(yǎng)6～7 d。將培養(yǎng)出來的固氮菌菌落利用劃線法進行分離，培養(yǎng)分離到的純種固氮菌4～5 d，之后再轉接3次，保證分離純化的固氮菌仍具有固氮作用。將純化后的固氮菌保存于試管中，置4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 根際土壤固氮菌的形態(tài)觀察及生理生化特性測定

依照《微生物學實驗》[28]及周國英等[29]的方法，對分離出的固氮菌進行菌體形態(tài)及生理生化鑒定，以不接菌的培養(yǎng)基作為空白對照(CK)。

2.5 根際土壤固氮菌系統(tǒng)發(fā)育樹的構建

利用細菌基因組提取試劑盒提取固氮菌基因組DNA，具體操作方法詳見試劑盒說明書。以細菌基因組DNA為模板，采用細菌通用引物27f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和 1492r(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)擴增16S rDNA。PCR反應體系為25 μL：DaeamTaqGreen PCR Master Mix(2×)12.5 μL，10 μmol/L引物27f 1.0 μL，10 μmol/L引物1492r 1.0 μL，模板DNA 1.0 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，43 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 15 min。PCR產(chǎn)物送上海生物工程有限公司進行16S rDNA測序。

將測定的固氮菌16S rDNA序列經(jīng)軟件DNAMAN6.0校正后引入EzTaxon(http://www.ezbiocloud.net/eztaxon)，進行菌株分類地位的初步確定，尋找相似性最高的模式種序列作為系統(tǒng)發(fā)育分析的參比序列，利用DNAMAN6.0進行多序列比對，然后采用MEGA 4中的鄰接法(NJ)構建系統(tǒng)發(fā)育樹，自展值(Bootstrap)為1 000，分析根際土壤固氮菌的系統(tǒng)發(fā)育地位[30-33]。

2.6 不同pH和溫度對根際土壤固氮菌生長的影響

2.6.1 pH 將篩選出的固氮菌制成菌懸液，使其在600 nm處的吸光值(D600 nm)為0.05，吸取不同固氮菌的菌懸液0.1 mL,分別接種于pH為 3，4，5，6，7，8，9，10和11的阿須貝無氮培養(yǎng)基中，每處理3個重復，28 ℃培養(yǎng)5 d，觀察菌落生長情況。

2.6.2 溫 度 吸取上述菌懸液0.1 mL接種于阿須貝無氮培養(yǎng)基中(pH 7.0)，每個處理3次重復，分別于4，15，28，37，45 ℃培養(yǎng)5 d，觀察不同溫度下菌落的生長情況。

2.7 根際土壤固氮菌解磷能力的測定

將不同固氮菌進行活化處理后，采用溶磷圈法[34]接種到無機磷培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)10 d，觀察菌落周圍是否有透明圈出現(xiàn)，如果出現(xiàn)，測定透明圈直徑(D)和菌落的直徑(d)，用D/d表示菌株解磷能力的強弱，其值越大，表明菌株解磷能力越強。

3 結果與分析

3.1 楊樹根際土壤固氮微生物的分離與純化

根據(jù)菌落大小、顏色、透明度、邊緣是否整齊等特征，最終從楊樹根際土壤中分離得到8株能在阿須貝無氮培養(yǎng)基上生長的細菌，分別命名為XY1、XY2、XY5、XY7、XY8、XY9、XY14和XY15。

3.2 楊樹根際土壤典型固氮菌菌落的形態(tài)及生理生化特性

從圖1可以看出，8株固氮菌的菌落形態(tài)各不相同，菌株XY1菌落較大，淡黃色，不透明，表面較濕潤、光滑，邊緣整齊，扁平；菌株XY2菌落大小中等，乳白色，不透明，表面較濕潤、光滑，邊緣整齊，扁平；菌株XY5菌落較小，乳白色，不透明，表面濕潤、光滑，邊緣整齊，突起；菌株XY7菌落較大，中間淡黃色，邊緣乳白色，不透明，表面濕潤、光滑，邊緣整齊，突起；菌株XY8菌落較大，乳白色，不透明，表面濕潤、光滑，邊緣整齊，突起；菌株XY14菌落大小中等，乳白色，不透明，表面較濕潤，邊緣不整齊，扁平；菌株XY15菌落較小，乳白色，不透明，表面較濕潤，邊緣不整齊，扁平；菌株XY9菌落大小中等，乳白色，不透明，干燥，邊緣不整齊，扁平。

圖1 阿爾山國家森林公園自然保護區(qū)楊樹根際8株土壤固氮菌的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of 8 tested nitrogen-fixing strains in Populus L.rhizosphere in Arxan National Forest Park

由表1可知，8株典型固氮菌的生理生化特征具有明顯的差異。菌株XY1的葡萄糖、乳糖、甘露醇、蔗糖、尿素水解、過氧化氫酶反應均為陽性；菌株XY2的葡萄糖、乳糖、甘露醇、蔗糖、吲哚試驗、淀粉水解、油脂水解、過氧化氫酶反應均為陽性；菌株XY5的葡萄糖、甘露醇、蔗糖、尿素水解、過氧化氫酶反應均為陽性；菌株XY7的葡萄糖、甘露醇、甲基紅試驗、VP試驗、尿素水解、過氧化氫酶反應均為陽性；菌株XY8的葡萄糖、乳糖、甘露醇、蔗糖、尿素水解、過氧化氫酶反應均為陽性；菌株XY14的葡萄糖、乳糖、甘露醇、蔗糖、吲哚試驗、淀粉水解、油脂水解、尿素水解、過氧化氫酶、明膠液化反應為均為陽性；菌株XY15的葡萄糖、甘露醇、吲哚試驗、VP試驗、油脂水解、過氧化氫酶、明膠液化均為陽性；菌株XY9的葡萄糖、甘露醇、蔗糖、VP試驗、油脂水解、過氧化氫酶、明膠液化、革蘭氏染色反應均為陽性。

表1 阿爾山國家森林公園自然保護區(qū)楊樹根際8株固氮菌的生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical features of 8 tested nitrogen-fixing strains in Populus L.rhizosphere in Arxan National Forest Park

注：“+”表示反應呈陽性，“-”表示反應呈陰性，“CK”表示空白對照。

Note：“+”.Positive，“-”.Negative，“CK”.Blank control

3.3 楊樹根際8株土壤固氮菌16S rDNA基因序列測定及系統(tǒng)發(fā)育分析

用細菌通用引物27f和1492r，對阿爾山楊樹根際土壤中分離出的8株固氮菌的16S rDNA基因片段進行擴增，所得片段長度均約為1.5 kb(圖2)，符合細菌16S rDNA的大小。

將測定的固氮菌16S rDNA序列引入EzTaxon進行序列比對，結果表明，從楊樹根際土壤分離出的8株固氮菌的16S rDNA與相關標準菌株的相似性為96.85%～99.8%。根據(jù)16S rDNA鑒定標準，同源性大于等于97%的屬于同一種，同源性大于85%而小于97%的認定為同一個屬不同的種[35-36]。從系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)可以看出，分離出的8株固氮菌分屬于8個不同的屬。

M．DNA Marker；1～8分別為菌株XY1、XY2、XY5、XY7、XY8、XY9、XY14、XY15擴增產(chǎn)物M．DNA Marker；1-8.Represent amplification products of XY1,XY2,XY5,XY7,XY8,XY9,XY14,and XY15,respectively圖2 阿爾山國家森林公園自然保護區(qū)楊樹根際8株固氮菌16S rDNA電泳圖譜Fig.2 Amplification products of 16S rDNA gene from nitrogen-fixing bacteria strains in Populus L.rhizosphere in Arxan National Forest Park

根據(jù)《伯杰氏鑒定細菌學手冊》[37]和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[38]，結合16S rDNA序列分析，最終確定，分離自阿爾山楊樹根際土壤的固氮菌XY1、XY2、XY5、XY7、XY8、XY14、 XY15 和XY9分別屬于柄桿菌屬(Caulobacter)、葉桿菌屬(Phyllobacterium)、紅球菌屬(Rhodococcus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、根瘤菌屬(Rhizobium)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、沙雷氏菌屬(Serratia)、芽孢桿菌屬(Bacillus)等。

圖3 基于16S rDNA序列的阿爾山國家森林公園自然保護區(qū)楊樹根際固氮菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences from nitrogen-fixing bacteria strains in Populus L.rhizosphere in Arxan National Forest Park

3.4 pH和溫度對楊樹根際8株土壤典型固氮菌生長的影響

3.4.1 pH 從表2可以看出，不同固氮菌生長的pH范圍有差異，菌株XY1、XY2、 XY5 生長pH為3～9，其中XY1和XY2的最適pH為6～8，XY5的最適pH為6～7；菌株XY7的生長pH為4～10，最適pH為6～8；菌株XY8的生長pH為3～10，最適pH為7；菌株XY 14生長的pH為3～11，最適pH為7；菌株XY15生長的pH為5～9，最適pH為6～7；菌株XY9生長的pH為4～10，最適pH為7。

表2 阿爾山國家森林公園自然保護區(qū)楊樹根際8株固氮菌在不同pH下的生長情況Table 2 Effect of different pH on growth of strains from Populus L.in Arxan National Forest Park

注：“-”表示不生長，“+”表示生長，“++”表示生長較好，“+++”表示生長旺盛。下表同。

Note:“-” Represents no growth，“+” Represents growth，“++” Represents good growth,“+++” Represents lush growth.The same below.

3.4.2 溫 度 從表3可以看出，不同固氮菌生長溫度不同，菌株XY2、XY5、XY8、XY9的生長溫度范圍比較廣，在4～45 ℃都能生長；菌株XY1和XY7生長溫度為15～28 ℃；菌株XY14生長溫度為15～37 ℃；菌株XY15生長溫度為4～37 ℃。

表3 阿爾山國家森林公園自然保護區(qū)楊樹根際8株固氮菌在不同溫度下的生長情況Table 3 Effect of different temperature on growth of strain in Populus L.rhizosphere in Arxan National Forest Park

3.5 楊樹根際8株固氮菌的解磷能力

固氮菌除了具有固氮能力外，張曉勇等[39]和Malik等[40]還發(fā)現(xiàn)，有些固氮菌具有解磷作用。本試驗對篩選出的8株固氮菌的解磷能力進行了測定,結果發(fā)現(xiàn)，只有菌株XY2、XY7在培養(yǎng)基上出現(xiàn)了透明圈，其他菌株在培養(yǎng)基上未出現(xiàn)透明圈，其中菌株XY2的透明圈直徑(D)為1.35 cm，菌落直徑(d)為1.12 cm，其D/d值為1.21；菌株XY7的D為1.2 cm，d為0.9 cm，其D/d值為1.33。結果表明，只有XY2、XY7具有解磷能力，其他菌株無解磷能力。

4 討 論

植物根際土壤固氮菌具有豐富的多樣性，對一種植物而言，其根際土壤中能分離出幾種甚至十幾種不同類型的固氮菌[41]。本研究利用阿須貝無氮培養(yǎng)基從阿爾山國家森林公園自然保護區(qū)楊樹根際土壤中分離得到8株固氮菌，經(jīng)菌落形態(tài)、生理生化特性及分子生物學鑒定，分別屬于柄桿菌屬、葉柄菌屬、紅球菌屬、假單胞菌屬、根瘤菌屬、類芽孢桿菌屬、沙雷氏菌屬、芽孢桿菌屬等8個不同的屬，表明該地區(qū)楊樹根際土壤固氮菌資源豐富。

本研究中，不同固氮菌的生長pH和溫度有差異，其中有的固氮菌pH生長范圍比較寬，既可以在堿性條件下生長，也可以在酸性條件下生長，如菌株XY14；有的菌株具有較寬的溫度生長范圍，在4～45 ℃都能生長，如菌株XY2、XY5、XY8和XY9；有的固氮菌除了具有固氮能力之外，還具有解磷能力，為樹木的生長提供氮素營養(yǎng)的同時又提供磷素營養(yǎng)，如菌株XY2和XY7。綜上所述可知，不同類型固氮菌的生物特性不同，這為森林生態(tài)系統(tǒng)非固氮樹種的固氮研究提供了理論依據(jù)。在后續(xù)的研究中，將分離鑒定出的不同固氮菌回接到楊樹根際，結合楊樹生長的特殊生境，篩選出可促進楊樹生長的優(yōu)良菌株，為研制適合楊樹生長的專用微生物肥料提供理論依據(jù)。

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