梅娜娜，婁在祥*，王洪新*，寇興然，孟映霞

（江南大學(xué)食品學(xué)院，國(guó)家功能食品工程技術(shù)研究中心，江蘇 無(wú)錫 214122）

金釵石斛（Dendrobium nobile Lindl.）莖部表面金黃色或者帶綠色，有深縱溝。質(zhì)硬而脆，斷面平坦而疏松；氣微、味苦，是常用名貴中藥材，為蘭科石斛屬多年生附生草本植物。其中主要含有多糖、生物堿、酚類和鞣質(zhì)類等化學(xué)成分[1-3]。研究發(fā)現(xiàn)金釵石斛具有降血糖血脂[4-5]、抗腫瘤[6]、治療白內(nèi)障[7]和護(hù)胃[8]等功效[9-10]?！侗静菥V目》記載其“久服，厚腸胃，補(bǔ)內(nèi)絕不足，平胃氣”?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》（2015版）記載其具有“益胃生津，滋陰清熱”之功效。研究表明，在抗腫瘤和對(duì)心血管、胃腸道抑制及止痛退熱等方面生物堿起著重要的作用，2000年日本學(xué)者M(jìn)orita等[11]發(fā)現(xiàn)從金釵石斛中分離得到的Picrotoxane倍半萜型生物堿Flakinins A和B以及Mubironine C具有減輕小鼠白血病L1210細(xì)胞毒性的作用，體外半抑制濃度（50% inhibitory concentration，IC50）分別為4.0、8.5、2.6 μg/mL。陳曉梅等[8]研究發(fā)現(xiàn)石斛堿能抑制離體兔腸管活動(dòng)，推測(cè)這是由于石斛能使血中胃泌素濃度升高；石斛通過(guò)直接刺激G細(xì)胞，引起胃泌素的釋放增加，使血清中胃泌素的濃度升高，而胃泌素刺激壁細(xì)胞，使胃酸分泌增加，從而明顯降低小鼠胃腸推動(dòng)作用。鐵皮石斛多糖能夠顯著提升小白鼠外周白細(xì)胞數(shù)和促進(jìn)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生移動(dòng)抑制因子，并且能夠強(qiáng)有力地消除實(shí)驗(yàn)條件下免疫抑制劑環(huán)磷酰胺加入所引發(fā)的副作用，是一種高價(jià)值的中藥類免疫增強(qiáng)劑[12]。金釵石斛多糖具有直接促進(jìn)淋巴細(xì)胞有絲分裂的作用[13]。石斛中所含有的石斛酚、杓唇石斛素、1,3-苯二醇、5-[2-（4-羥基-3-甲氧基苯基）乙基]（苷類）、玫瑰石斛素、4-羥基-3,3’,4’,5-四甲氧基聯(lián)芐、2,4,8-三甲氧基菲-3,7-二醇、毛蘭菲、4-甲氧基菲-2,5-二醇、皮樹脂醇和丁香脂素等酚類化合物具有抗氧化活性，對(duì)三價(jià)鐵硫氰酸鹽的抗氧化活性高于丁基羥基茴香醚[14]。

Gullon等[15]用體外模擬消化方法研究了副產(chǎn)品石榴皮粉體外消化液中總酚及總黃酮類物質(zhì)的穩(wěn)定性，并得出經(jīng)體外模擬消化液消化后總酚物質(zhì)的含量降低，除鞣花酸含量有所增加。袁春龍等[16]利用體外模擬消化液對(duì)葡萄籽超微粉進(jìn)行消化，同時(shí)測(cè)定多酚類物質(zhì)和白藜蘆醇溶出率。結(jié)果表明，多酚、白藜蘆醇的溶出率分別為：霞多麗60.87%～67.43%、23.65%～40.64%；赤霞珠60.48%～69.99%、20.63%～43.38%。經(jīng)模擬腸液消化5～15 h后，多酚、白藜蘆醇的溶出率分別為：霞多麗1.96%～17.86%、17.51%～50.25%；赤霞珠3.38%～15.23%、14.02%～44.71%。葡萄籽中多酚物質(zhì)的消化吸收主要集中在胃環(huán)境中，而白藜蘆醇在腸、胃環(huán)境中的消化吸收幾乎各占一半。張冠亞等[17]采用3 種體外模擬消化液對(duì)鐵皮石斛多糖進(jìn)行體外模擬消化研究，結(jié)果表明，在體外模擬胃腸道的消化體系中，鐵皮石斛多糖的分子質(zhì)量減小，糖苷鍵發(fā)生斷裂，但沒有游離單糖的釋放。然而有關(guān)采用模擬胃腸道消化過(guò)程來(lái)比較研究金釵石斛功能性成分被人體吸收情況鮮有報(bào)道；因此，本實(shí)驗(yàn)?zāi)M口腔、胃、腸環(huán)境條件，體外模擬消化金釵石斛全粉（超微粉/普通粉）、提取物（水提物/醇提物）的消化過(guò)程，探究金釵石斛中石斛堿、多糖和其他化學(xué)成分（多酚類）在體外模擬消化過(guò)程中含量的變化和多糖消化產(chǎn)物，為今后探索金釵石斛功能性的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和金釵石斛保健產(chǎn)品的開發(fā)和應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)參考。

體外模擬消化道的實(shí)驗(yàn)方法在了解食品或者藥物胃腸運(yùn)行狀態(tài)中應(yīng)用廣泛。盡管人體營(yíng)養(yǎng)研究仍是全球普遍采用的方法，但是體外實(shí)驗(yàn)具有成本低、快速、便捷和無(wú)倫理限制的優(yōu)勢(shì)。體外模擬消化的方法包括口腔、胃部和小腸部分，偶爾包括大腸發(fā)酵部分[18]。體外模擬消化方法中，研究者嘗試著模仿生理學(xué)的條件，其中考慮到的因素有消化酶及其濃度、pH值、消化時(shí)間、鹽濃度和其他因素[19-20]。因此，本實(shí)驗(yàn)以人體胃、腸道模擬系統(tǒng)為基礎(chǔ)，并加以適當(dāng)改進(jìn)[21]，希望探索出金釵石斛化學(xué)成分在體內(nèi)的消化情況。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金釵石斛（莖部）由貴州赤水金釵石斛國(guó)禮發(fā)展有限公司提供。金釵石斛超微粉（submicron powder，SP）（500 目）由濟(jì)南納力德超微粉碎技術(shù)公司制得。普通粉（common powder，CP）、水提物（water extract，WE）、醇提物（alcohol extract，AE）、粗石斛堿（dendrobine，D）和粗多糖（polysaccharide，P）均由江南大學(xué)食品營(yíng)養(yǎng)與功能因子實(shí)驗(yàn)室自制。

淀粉酶（10 U/mg）、胃蛋白酶（40 U/mg）美國(guó)Sigma公司；胰酶、豬膽粉、黏蛋白 上海源葉生物科技有限公司；氯化鈉、硝酸銨、磷酸鉀、氯化鉀、檸檬酸鉀、尿酸鈉、乳酸鈉、鹽酸、氫氧化鈉等均為分析純；巖藻糖、氨基葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖、氨基半乳糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、核糖的標(biāo)準(zhǔn)品 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蕓香葉苷、綠原酸、阿魏酸、對(duì)羥基苯甲酸、熊果酸、芹菜素、沒食子酸、槲皮素的標(biāo)準(zhǔn)品 上海阿拉丁試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GC7890氣相色譜儀 美國(guó)安捷倫公司；UV-1800型紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；AR224CN電子天平奧豪斯儀器（上海）有限公司；BS-1E溫控?fù)u床 瑞華儀器有限公司；GZX-9240MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；TGL-16C臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；超高效液相色譜串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（ultra-high performance liquid chromatographytriple quadrupole mass spectrometry，UPLC-TQD-MS）美國(guó)沃特世公司。

1.3 方法

1.3.1 金釵石斛全粉、提取物、粗石斛堿及粗多糖的制備

1.3.1.1 金釵石斛超微粉和普通粉的制備

金釵石斛莖鮮品→去葉、清洗→切段（4～5 cm）→熱風(fēng)干燥（水分低于5%）→粉碎（過(guò)60 目）→普通粉→包裝備用。超微粉由普通粉經(jīng)超微粉碎機(jī)進(jìn)一步粉碎制得（500 目）。金釵石斛超微粉和普通粉主要為石斛全粉。

1.3.1.2 金釵石斛水提物和醇提物的制備

水提物：稱取金釵石斛干粉160 g，加入3.2 L超純水，于70 ℃條件下提取2 h后紗布濾過(guò)，共提2 次。8 000 r/min離心10 min，再于65 ℃條件下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。濃縮后真空干燥得水提物，主要成分為水溶性成分。

醇提物：稱取金釵石斛干粉120 g，加入2.4 L體積分?jǐn)?shù)95%乙醇，按照上述水提物制備方法操作，得醇提物備用，主要成分為醇溶性成分[22]。

1.3.1.3 金釵石斛多糖和石斛堿的提取分離

多糖：向金釵石斛干粉中加入體積分?jǐn)?shù)95%乙醇，在75 ℃條件下攪拌脫脂2 次。經(jīng)過(guò)濾后向所留殘?jiān)屑尤? L超純水，70 ℃條件下提取2 h，共提2 次。紗布過(guò)濾后8 000 r/min離心10 min，再于65 ℃條件下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。然后向濃縮后的膠狀溶液里加入4 倍體積的純乙醇，加入的過(guò)程中不斷攪拌。4 ℃條件下靜置24 h后，8 000 r/min離心10 min后取沉淀，并用純乙醇、丙酮和乙醚進(jìn)一步?jīng)_洗。最終將沉淀物凍干，得到粗多糖[23]。主要成分為粗多糖。

石斛堿：向金釵石斛干粉中加入體積分?jǐn)?shù)95%乙醇4 L，75 ℃條件下提取2 h，共提2 次。紗布過(guò)濾后8 000 r/min離心10 min，再于65 ℃條件下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。濃縮后進(jìn)行真空干燥得粗生物堿備用。將粗生物堿溶于體積分?jǐn)?shù)30%乙醇，8 000 r/min離心5 min后取上清液，用氯仿萃取所得上清液2 次，真空干燥萃取物。經(jīng)大孔樹脂AB-8對(duì)石斛堿進(jìn)行純化，最后用氣相內(nèi)標(biāo)法測(cè)定石斛堿含量。測(cè)得所制石斛堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)為73%。

1.3.2 口腔模擬消化

將體外模擬消化實(shí)驗(yàn)分成金釵石斛超微粉、普通粉、水提物、醇提物、粗石斛堿和粗多糖共6 個(gè)組，分別記作SP、CP、WE、AE、D和P組。同時(shí)各組分成口腔、胃部和腸道3 個(gè)組。

人工唾液的配制按照表1所示方法進(jìn)行制備[24]。根據(jù)文獻(xiàn)[24]報(bào)道5 g/L黏蛋白可以有效模擬人類口腔的黏度，因此實(shí)驗(yàn)選取黏蛋白的質(zhì)量濃度為5 g/L。加入淀粉酶使其濃度為150 U/mL。將配制好的人工唾液用0.1 mol/L鹽酸或者氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6.8。取50 mL離心管，加入5 mL人工唾液，分別與一定量的金釵石斛超微粉、普通粉、水提物、醇提物、粗石斛堿及粗多糖充分混合后放入搖床，37 ℃、100 r/min條件下振動(dòng)15 min。

表1 體外消化中人工唾液各類化學(xué)組分組成[24]Table1 Chemical composition of artificial saliva used in the in vitro digestion model[24]

1.3.3 胃液模擬消化

將裝有經(jīng)口腔消化后樣品的50 mL離心管取出，分別加入按表2配制好的人工胃液10 mL，充分混勻后用1 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至2.5，放進(jìn)搖床中于37 ℃、100 r/min條件下繼續(xù)振蕩2 h。

表2 體外模擬消化中人工胃液的化學(xué)成分組成[25]Table2 Chemical composition of artificial gastric fluid (SGF) used in the in vitro digestion model[25]

1.3.4 腸液模擬消化

腸液模擬消化參照文獻(xiàn)[19]。人工腸液的配制（20 mL）：按照5 mL胰酶（5 mg/mL（以胰蛋白酶活力計(jì)））、2.5 mL豬膽粉溶液（8 mg/mL）、40 μL氯化鈣溶液（0.3 mol/L）、0.15 mL 氫氧化鈉溶液（1 mol/L）和12.31 mL水的組成配制人工腸液。將經(jīng)模擬胃液消化完的樣品從搖床中取出，按照20 mL胃腔樣品與20 mL人工腸液混勻。最后用1 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0，放進(jìn)搖床中于37 ℃、100 r/min條件下繼續(xù)振蕩2 h。

在模擬唾液、胃液和腸液3 步消化后，分別將消化液混合物在4 ℃條件下5 000 r/min離心5 min，取上清液。各個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別定容至50 mL備用。

1.3.5 金釵石斛石斛堿和多糖溶出率的計(jì)算

各組消化液（P組除外）中石斛堿含量的測(cè)定：取一定量消化液于離心管中，后加入等量氯仿萃取，重復(fù)2 次后收集有機(jī)相，旋蒸后甲醇定容，加入內(nèi)標(biāo)萘后采用氣相色譜儀按照《中華人民共和國(guó)藥典》（2015版）中金釵石斛堿的測(cè)定方法進(jìn)行。

各組消化液（AE、D組除外）中多糖含量的測(cè)定：取一定量消化液于離心管中，加入4 倍體積無(wú)水乙醇，混勻經(jīng)醇沉冷藏1 h后，5 000 r/min離心5 min，棄去上清液，加入無(wú)水乙醇振蕩離心吸去雜質(zhì)，重復(fù)上述步驟2 次。將沉淀的多糖用熱水定容后，參考藥典中鐵皮石斛多糖的測(cè)定方法（苯酚-硫酸法）進(jìn)行測(cè)定，溶出率按下式計(jì)算。

式中：ρ1為消化后上清液中石斛堿或多糖的質(zhì)量濃度/（mg/mL）；ρ2為消化前原料中石斛堿或多糖的質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.3.6 金釵石斛粗多糖消化產(chǎn)物的測(cè)定

將粗多糖配成2 mg/mL的溶液，按照1.3.2、1.3.3、1.3.4節(jié)的方法進(jìn)行多糖在口腔、胃和腸道的模擬消化實(shí)驗(yàn)。取上述模擬消化反應(yīng)后的樣品溶液，4 800 r/min離心10 min后取上清液，用水定容到50 mL備用。然后進(jìn)行模擬消化后消化產(chǎn)物分子質(zhì)量、還原糖質(zhì)量濃度和單糖組成的測(cè)定。

模擬消化物還原糖質(zhì)量濃度的測(cè)定：具體方法參照《中華人民共和國(guó)藥典》（2015版）中槲葉多糖含量測(cè)定中還原糖的測(cè)定方法（3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法）。精密量取多糖在口腔、胃和腸模擬消化反應(yīng)后的樣品溶液各2 mL，置于25 mL稱量瓶中，分別加入DNS 1.5 mL，搖勻，沸水浴中加熱5 min，迅速用涼水冷卻，加水至刻度，搖勻后在530 nm波長(zhǎng)處分別測(cè)定吸光度。以2 mL水同法制成空白溶液按上述步驟進(jìn)行同樣操作。

消化產(chǎn)物分子質(zhì)量的測(cè)定：離心過(guò)的上清液經(jīng)0.22 μm水相膜過(guò)濾，通過(guò)1525高效液相色譜儀（配2414示差折光檢測(cè)器和Empower3工作站）測(cè)定其分子質(zhì)量的變化。色譜條件為：色譜柱為UltrahydrogelTMLinear（7.8 mm×300 mm，10 μm）；流動(dòng)相為0.1 mol/L NaNO3；流速為0.9 mL/min；柱溫35 ℃。

模擬多糖消化物單糖的測(cè)定：將剩余上清液全部裝入5 00～1 000 Da透析袋后，將透析袋置于含有50 mL生理鹽水的燒杯中，使透析時(shí)間與模擬消化時(shí)間一致。取透析袋外的液體，經(jīng)0.22 μm水相膜過(guò)濾，通過(guò)陰離子色譜ICS 5000檢測(cè)單糖組成。以生理鹽水作為空白對(duì)照。

離子色譜條件為：C a r b o P a c PA 2 0分析柱（150 mm×3 mm，6.5 μm）和CarboPac PA 20G保護(hù)柱（30 mm×3 mm，6.5 μm）；流速為0.5 mL/min；進(jìn)樣量25 μL；檢測(cè)器工作電極為金電極；柱溫箱溫度為30 ℃；檢測(cè)器溫度為35 ℃[26]。其中，單糖混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制過(guò)程如下：取巖藻糖、氨基葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖、氨基半乳糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖和核糖標(biāo)準(zhǔn)品，用去離子水配制成3.85 mg/L的混標(biāo)溶液。

1.3.7 模擬消化后金釵石斛酚類物質(zhì)的成分分析

模擬消化后金釵石斛酚類物質(zhì)的成分分析參照文獻(xiàn)[27-28]?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)品的配制：分別精確稱取適量的蕓香葉苷、綠原酸、阿魏酸、對(duì)羥基苯甲酸、熊果酸、芹菜素、沒食子酸、槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品，用體積分?jǐn)?shù)50%甲醇溶解，配制成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使得每種標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度均為1 mg/mL。4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

色譜條件：色譜柱為HSST3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相B為水和0.1%甲酸。梯度洗脫（洗脫程序見表3）；流速0.3 mL/min；柱溫35 ℃。

表3 梯度洗脫參數(shù)Table3 Parameters of gradient elution procedure

質(zhì)譜條件：電噴霧電離離子源（electrospray ionization，ESI）負(fù)離子模式（ESI-）；離子源溫度130 ℃；脫溶劑溫度400 ℃；錐孔氣流N2流速50 L/h；脫溶劑氣流速400 L/h；碰撞氣體流量0.12 mL/min；毛細(xì)管電泳電壓3 500 V；載氣為氦氣；多反應(yīng)檢測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）模式。

1.4 數(shù)據(jù)分析

以上實(shí)驗(yàn)均平行進(jìn)行3 次，得到的數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 20.0軟件處理，采用Dunnett’s檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 金釵石斛石斛堿在口腔、胃和腸道模擬消化過(guò)程中溶出率的變化

經(jīng)人工模擬口腔、胃液和小腸消化后，各個(gè)實(shí)驗(yàn)組（除P組外）中石斛堿溶出率如圖1所示。

圖1 金釵石斛石斛堿溶出率Fig.1 Dissolution rate of dendrobine from D. nobile

由圖1中可知，在模擬唾液消化液中，石斛堿溶出率的大小依次是D＜CP＜SP＜AE＜WE；在模擬胃消化液中，石斛堿溶出率的大小依次是D＜CP＜AE＜SP＜WE；在模擬腸道消化液中石斛堿溶出率大小依次是D＜A E＜W E＜C P＜S P；各組之間均有顯著性差異（P＜0.05）。由此可推測(cè)，粗石斛堿在模擬消化中溶出效果較差，與醇提物相比，水提物中的石斛堿更易溶出。最終，在模擬腸道消化液中金釵石斛全粉和提取物（水提物/醇提物）的石斛堿溶出率較粗石斛堿高，且超微粉中石斛堿溶出率（（21.46±0.52）%）顯著高于普通粉（（19.20±0.95）%）（P＜0.05）。由此可以得出，金釵石斛超微粉由于粉碎顆粒粒徑小，能減少有效成分的溶出阻力，提高有效組分的溶出率，同時(shí)表面積增加使金釵石斛粉顆粒分散均勻，能更好地溶解在胃腸液中，同時(shí)可以增大顆粒與胃腸黏膜的接觸面積，從而有利于藥物的吸收，增大藥物的生物利用率[29]。

2.2 金釵石斛多糖在口腔、胃和腸道模擬消化過(guò)程中溶出率的變化

經(jīng)人工模擬口腔、胃液和小腸消化后，由于金釵石斛醇提物中多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低，為0.19%，故本實(shí)驗(yàn)未考慮醇提物中多糖溶出率的變化。各個(gè)實(shí)驗(yàn)組（除AE與D外）中多糖溶出率變化如圖2所示。

圖2 金釵石斛多糖溶出率Fig.2 Dissolution rate of polysaccharide from D. nobile

由圖2可知，金釵石斛超微粉在口腔和胃中的多糖溶出率分別為（4.29±0.22）%和（5.43±0.22）%，均高于金釵石斛普通粉（（1.9 9±0.0 8）%和（3.25±0.16）%），并且具有顯著性差異（P＜0.05）；說(shuō)明超微粉中細(xì)胞破碎程度更大，粒徑較小，使多糖溶出速率加快[30]。而腸道中超微粉的多糖溶出率反而比普通粉較低，可能是因?yàn)榕c普通粉相比，超微粉在模擬消化過(guò)程中多糖溶出更早地達(dá)到平衡狀態(tài)且多糖鏈部分?jǐn)嗔训木壒仕耓17]。金釵石斛水提物在口腔、胃和腸道模擬消化過(guò)程中多糖溶出率無(wú)明顯差別，可以得出金釵石斛水提物易釋放出多糖組分，在口腔中多糖溶出已達(dá)到平衡狀態(tài)。

2.3 體外模擬口腔、胃和腸道對(duì)金釵石斛多糖的消化結(jié)果

2.3.1 模擬消化物多糖分子質(zhì)量和還原糖質(zhì)量濃度的變化

由表4可知，金釵石斛多糖經(jīng)模擬唾液、模擬胃液消化的過(guò)程中分子質(zhì)量逐漸減小，即從2 737 Da降低為1 425 Da和386 Da，還原糖質(zhì)量濃度整體隨消化時(shí)間的延長(zhǎng)而增加（P＜0.05），說(shuō)明多糖分子支鏈產(chǎn)生變化，糖苷鍵斷裂而導(dǎo)致分子質(zhì)量降低。消化前多糖溶液中還原糖質(zhì)量濃度與多糖溶液經(jīng)模擬唾液消化后產(chǎn)物中還原糖的質(zhì)量濃度無(wú)顯著性差異。

表4 金釵石斛多糖在模擬口腔、胃和腸道消化后多糖分子質(zhì)量和還原糖質(zhì)量濃度的變化Table4 Changes in the molecular weight of polysaccharide and reducing sugar content in D. nobile in in vitro digestion model

2.3.2 模擬消化后單糖產(chǎn)生情況

表5 單糖混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中單糖組成及質(zhì)量濃度Table5 Monosaccharide composition and concentrations of mixed standard solution

圖3 金釵石斛多糖消化后的離子色譜圖Fig.3 Ion exchange chromatogram of polysaccharide in in vitro digestion products of D. nobile

多糖經(jīng)模擬消化后糖苷鍵發(fā)生斷裂，可能生成了寡糖或者單糖[31]，從而暴露出更多的還原末端，使得還原糖的含量增加。將消化液裝入只有小分子多糖、寡糖或者單糖可以自由進(jìn)出的透析袋（3 500 Da）中進(jìn)行檢測(cè)。由圖3可知，模擬口腔、胃、腸道消化液中均沒有檢測(cè)到表5中11種單糖，表明消化后沒有游離單糖的釋放。這與張冠亞等[17]對(duì)鐵皮石斛多糖體外模擬消化實(shí)驗(yàn)的結(jié)果是一致的。由此可知，金釵石斛多糖的空間結(jié)構(gòu)復(fù)雜，主鏈和支鏈都是由糖苷鍵連接而成，糖苷鍵的斷裂使多糖分子質(zhì)量減小，所以其性質(zhì)也可能隨之發(fā)生改變[32]。

2.4 模擬消化后多酚化學(xué)成分變化情況

通過(guò)UPLC-TQD-MS分析發(fā)現(xiàn)，各組金釵石斛消化液中含有蕓香葉苷、綠原酸、阿魏酸、沒食子酸和槲皮素5 種化學(xué)物質(zhì)。金釵石斛全粉（超微粉/普通粉）和提取物（水提物/醇提物）中這5 種多酚類物質(zhì)的質(zhì)量濃度如圖4所示。

圖4 金釵石斛超微粉、普通粉、水提物和醇提物模擬消化液中5 種多酚類物質(zhì)的質(zhì)量濃度Fig.4 Polyphenol concentrations in in vitro digestion products of D. nobile

由圖4a可知，消化前水提物中蕓香葉苷的質(zhì)量濃度比醇提物中低，分別為0.026 5、0.036 2 μg/mL（P＜0.05）。蕓香葉苷在普通粉和水提物中釋放緩慢，在從模擬唾液到模擬胃液的消化過(guò)程中其質(zhì)量濃度不斷增加，經(jīng)模擬腸道消化后質(zhì)量濃度降低，可能是受消化液pH值和離子、蛋白質(zhì)等化學(xué)成分的影響[33]。超微粉和醇提物中蕓香葉苷釋放較快，且在模擬唾液、胃液和模擬腸液中質(zhì)量濃度逐漸降低。由圖4b可知，綠原酸在醇提物中的質(zhì)量濃度（0.009 6 μg/mL）高于水提物（0.005 0 μg/mL）（P＜0.05），且醇提物中綠原酸釋放不完全。由圖4c～e可知，醇提物中阿魏酸質(zhì)量濃度（2×10-6μg/mL）較低，而在水提物中的質(zhì)量濃度相對(duì)較高（0.051 μg/mL），但二者在模擬消化液中的質(zhì)量濃度均很低。沒食子酸和槲皮素均表現(xiàn)為水提物中的質(zhì)量濃度高于醇提物（P＜0.05）。隨著消化的進(jìn)行，沒食子酸在模擬胃液中的質(zhì)量濃度比消化前溶液中質(zhì)量濃度高，可能是由原料和消化液中化學(xué)成分的轉(zhuǎn)化和蛋白質(zhì)、碳水化合物或者糖殘基等大分子物質(zhì)的裂解導(dǎo)致[34]。由圖4還可知，金釵石斛超微粉比普通粉更易促使其中的化學(xué)成分溶出，主要因?yàn)槌⒎郾绕胀ǚ鄯鬯閺?qiáng)度大，細(xì)胞內(nèi)多糖、蛋白質(zhì)、纖維素等大分子物質(zhì)更易釋出，且大分子物質(zhì)之間彼此交聯(lián)形成空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，使溶液穩(wěn)定性好，利于人體消化吸收利用。

3 結(jié) 論

通過(guò)體外模擬人體消化系統(tǒng)（口腔、胃和小腸），分別模擬了唾液、胃液和腸液對(duì)金釵石斛超微粉、普通粉、水提物、醇提物、粗石斛堿和粗多糖的消化作用。通過(guò)模擬消化實(shí)驗(yàn)得出金釵石斛堿和多糖在消化過(guò)程中溶出的規(guī)律，以及石斛堿、多糖和多酚類物質(zhì)在模擬消化過(guò)程中的變化。金釵石斛全粉（超微粉/普通粉）和提取物（水提物/醇提物）石斛堿在模擬腸道消化液中溶出率大小依次為金釵石斛超微粉＞普通粉＞水提物＞醇提物＞粗石斛堿。且石斛堿溶出率在整個(gè)模擬消化過(guò)程中逐漸增大。金釵石斛多糖在水提物中更易溶出，且在唾液中基本達(dá)到溶出平衡的狀態(tài)，在胃和腸道中溶出率降低。金釵石斛多糖在模擬消化的過(guò)程中，在模擬胃部和腸道部分其分子質(zhì)量降低，還原糖的含量也升高，但經(jīng)透析后沒有檢測(cè)到單糖。故可以推測(cè)，金釵石斛多糖在模擬消化過(guò)程中，多糖的糖苷鍵部分?jǐn)嗔?，但是沒有釋放出游離的單糖。多酚類物質(zhì)的質(zhì)量濃度在模擬胃液消化物中最高，在模擬腸道消化物中降低。

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