鄭樹城，王 慶，李瑩瑩，王英英，曾偉偉，任 燕，石存斌

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部漁藥創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省水產(chǎn)動(dòng)物免疫技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510380；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306)

鯉皰疹病毒3型，又稱為錦鯉皰疹病毒(Koi herpesvirus，KHV)，是引起鯉(CyprinuscarpioLinnaeus )、錦鯉及其變種錦鯉皰疹病毒病(Koi herpesvirus disease，KHVD)的病原，死亡率高達(dá)80%以上，對(duì)全世界多個(gè)國(guó)家地區(qū)的鯉魚及錦鯉養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。CyHV-3隸屬于皰疹病毒目異皰疹病毒科鯉皰疹病毒屬，是具有囊膜的雙鏈DNA病毒[2]，病毒顆粒直徑為167～200 nm，基因組全長(zhǎng)295 kbp，共編碼164個(gè)開放閱讀框(Open reading frame,ORF)，是已知基因組最大的皰疹病毒[3-5]。生物質(zhì)譜技術(shù)鑒定結(jié)果表明，CyHV-3含有46個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，包括16個(gè)囊膜蛋白、3個(gè)衣殼蛋白、2個(gè)皮層蛋白和25個(gè)未知蛋白[6-7]。

雖然質(zhì)譜鑒定發(fā)現(xiàn)CyHV-3可能含有46個(gè)蛋白，但對(duì)于CyHV-3的免疫原性蛋白的研究卻非常有限。其中，ORF81編碼的囊膜蛋白是研究較早也是被多數(shù)學(xué)者廣泛認(rèn)可的主要免疫原性蛋白之一[8]，以O(shè)RF81為靶基因設(shè)計(jì)的DNA疫苗在試驗(yàn)中顯示具有較高的免疫保護(hù)率[9]。Fuchs等[10]對(duì)部分潛在的CyHV-3結(jié)構(gòu)蛋白進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示囊膜蛋白ORF25、ORF65、ORF148和ORF149具有良好的免疫原性，Zhou等[11]設(shè)計(jì)的ORF25 DNA疫苗在魚體試驗(yàn)上也證明了其具有良好的免疫保護(hù)效果。最近，Monaghan等[12]利用CyHV-3核衣殼制備的單克隆抗體和質(zhì)譜基質(zhì)輔助激光解析離子化-飛行時(shí)間質(zhì)譜(Matrix assisted laser desorption ionization-time of flight，MALDI-TOF/TOF)鑒定到一個(gè)具有良好免疫原性的新蛋白ORF84。另外，有研究表明非結(jié)構(gòu)蛋白ORF12可能也具有免疫原性[13]。

本試驗(yàn)采用20%～66%蔗糖密度梯度超速離心方法對(duì)CyHV-3病毒懸液進(jìn)行純化，經(jīng)SDS-PAGE和考馬斯亮藍(lán)染色后進(jìn)行Western blotting分析，結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)篩選免疫原性蛋白，為CyHV-3血清學(xué)診斷方法的建立、亞單位疫苗或DNA疫苗的研制提供更多候選抗原。

1 材料與方法

1.1 材料

鯉魚CCB細(xì)胞系[14]和鯉皰疹病毒3型T分離株由德國(guó)動(dòng)物健康研究院(FLI)病原學(xué)研究所Sven.M Bergmann教授贈(zèng)送；抗CyHV-3血清采自感染CyHV-3的病魚；鼠源抗錦鯉IgM單克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)室制備。

蔗糖Sucrose購(gòu)自Sigma公司；SDS-PAGE預(yù)制膠、蛋白Marker、凝膠電泳緩沖液和轉(zhuǎn)膜緩沖液購(gòu)自Thermo Scientific公司；HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；增強(qiáng)型HRP-DAB底物顯色試劑盒(PA110)購(gòu)自天根生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病毒增殖與純化

細(xì)胞培養(yǎng)、病毒感染和增殖參考文獻(xiàn)[15]描述的方法。將出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變的細(xì)胞進(jìn)行凍融處理，于10 ℃下5 000 r/min離心30 min，收集上清液于10 ℃下32 000 r/min離心1.5 h，棄上清，用TNE緩沖液重懸沉淀；將病毒懸液加入由質(zhì)量體積比分別為20%、40%、50%和66%的蔗糖密度梯度離心管上層，于10 ℃下25 000 r/min離心1 h；收集每一層的病毒樣品，加入TN緩沖液后于10 ℃下25 000 r/min離心30 min，收集沉淀，用TN緩沖液重懸，將純化的病毒顆粒吸附于碳膜鎳網(wǎng)上，3%的磷鎢酸(pH7.2～7.4)負(fù)染1 min后在透射電子顯微鏡下觀察。

1.2.2 SDS-PAGE和考馬斯亮藍(lán)染色

聚丙烯酰胺凝膠由12%的分離膠和4%的濃縮膠組成，將純化的病毒與5×蛋白上樣緩沖液按比例混合后在沸水中水浴10 min，冷卻后點(diǎn)樣進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后，其中一塊凝膠用考馬斯亮藍(lán)染色和脫色，并用凝膠成像系統(tǒng)掃描。

1.2.3 Western blotting

將上述SDS-PAGE分離后的另一塊凝膠用濕轉(zhuǎn)的方法轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素(NC)膜，5%的脫脂奶粉室溫封閉3 h，然后用含有0.05%吐溫的PBS (PBST )清洗3次，每次10 min；用1∶200稀釋的錦鯉抗CyHV-3的陽性血清4 ℃下孵育過夜，然后用0.05%的PBST清洗3次，每次10 min；加入1∶1 000稀釋的鼠抗錦鯉IgM單抗室溫孵育1.5 h，接著用0.05%的PBST清洗3次，每次10 min；最后加入1∶5 000稀釋的HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG室溫孵育1 h，用0.05%的PBST清洗3次后進(jìn)行DAB顯色。

1.2.4 質(zhì)譜分析

仔細(xì)比對(duì)考馬斯亮藍(lán)脫色凝膠和DAB顯色的NC膜，將與NC膜顯色明顯條帶相應(yīng)位置的考馬斯亮藍(lán)脫色凝膠切出，進(jìn)行膠內(nèi)酶解，運(yùn)用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(Liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)進(jìn)行分析，質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)用MASCOT在uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索。

2 結(jié)果

2.1 病毒純化

病毒純化后在電鏡下觀察到許多典型的呈圓形狀完整囊膜包裹或只有裸露核衣殼的CyHV-3病毒顆粒，顆粒直徑為150～200 nm(圖1)，與之前的報(bào)道一致。

圖1 透射電鏡下純化的CyHV-3顆粒Fig.1 Purified particles of CyHV-3 under transmission electron microscope(a)黑色細(xì)箭頭為完整的CyHV-3病毒顆粒，黑色粗箭頭為囊膜破損的CyHV-3病毒顆粒，白色細(xì)箭頭為裸露的核衣殼；(b)圖(a)中方框放大部分，圖中標(biāo)尺為200 nm.

2.2 SDS-PAGE和Western blotting結(jié)果

將純化的病毒進(jìn)行SDS-PAGE分析，考馬斯亮藍(lán)染色和脫色后可見到許多豐度不一的蛋白條帶[圖2(a)]。以抗CyHV-3錦鯉陽性血清作為一抗進(jìn)行Western blotting，結(jié)果顯示多條蛋白可以被陽性血清識(shí)別，具有特異性免疫反應(yīng)[圖2(b)]。

2.3 質(zhì)譜分析

剪切其中4條具有明顯特異性免疫反應(yīng)的蛋白膠條進(jìn)行LC-MS/MS分析，4個(gè)蛋白鑒定結(jié)果分別為ORF92、ORF66、ORF72和ORF81[圖2(b)和表1]。

圖2 純化的CyHV-3病毒SDS-PAGE電泳結(jié)果(a)和Western blotting結(jié)果(b)Fig.2 Results of SDS-PAGE of purified CyHV-3 virions (a) and Western blotting analysis (b)1:純化的CyHV-3病毒顆粒，M:蛋白標(biāo)準(zhǔn).

表1 CyHV-3主要免疫原性蛋白LC-MS/MS鑒定Tab.1 Identification of major immunogenic proteins from CyHV-3 by LC-MS/MS

3 討論

錦鯉皰疹病毒病自從上世紀(jì)90年代在歐洲暴發(fā)以來，已傳播至世界多個(gè)國(guó)家地區(qū)[16-17]，最近的文獻(xiàn)報(bào)道顯示，該病已波及越南和伊朗等國(guó)家[18-19]。我國(guó)是2002年在深圳進(jìn)口的錦鯉中首次檢測(cè)到[20]，之后在廣州、海南和東北等地區(qū)均有KHVD暴發(fā)的報(bào)道[21-22]。遺憾的是，目前仍沒有針對(duì)KHVD的有效疫苗，雖然之前的研究表明CyHV-3減毒疫苗和改良的活疫苗在魚體試驗(yàn)中顯示具有顯著的保護(hù)作用[23-25]，但減毒疫苗存在毒力返強(qiáng)和潛伏感染的風(fēng)險(xiǎn)，安全隱患不可忽視。

相較傳統(tǒng)的疫苗，基因工程疫苗如DNA疫苗和亞單位疫苗，因具有易制備、穩(wěn)定和高效等優(yōu)點(diǎn)，已成為許多水生動(dòng)物疾病疫苗的重要研究方向。其中，部分DNA疫苗和亞單位疫苗由于具有良好的免疫保護(hù)效果，已正式投入市場(chǎng)使用，進(jìn)入漁用疫苗商業(yè)化，如加拿大分別于2002年和2005年批準(zhǔn)生產(chǎn)的傳染性胰腺壞死病毒亞單位疫苗和傳染性造血器官壞死病毒DNA疫苗[26]。因此，在研制傳統(tǒng)的減毒疫苗或滅活疫苗的同時(shí)，基因工程疫苗的研制無疑為水生動(dòng)物疾病的防控策略提供了更多選擇。而選擇具有良好免疫原性的蛋白是研制這類疫苗的重要基礎(chǔ)，因此，本研究基于蛋白質(zhì)組學(xué)和免疫學(xué)的方法鑒定了幾個(gè)CyHV-3免疫原性蛋白，為KHVD基因工程疫苗的研制提供了重要的候選抗原。

基于蛋白質(zhì)組學(xué)和免疫學(xué)的交叉學(xué)科稱為免疫蛋白質(zhì)組學(xué)(Immunoproteomics)，它結(jié)合了蛋白質(zhì)組學(xué)高通量的優(yōu)勢(shì)和免疫學(xué)的技術(shù)方法，在病毒和細(xì)菌等病原微生物的免疫原性蛋白研究中廣泛應(yīng)用，有力地推動(dòng)了該研究領(lǐng)域的發(fā)展。Jang等[27]分別將自然感染淋巴囊腫病毒(Lymphocystis disease virus，LCDV)和LCDV滅活疫苗免疫的褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)抗血清通過一維凝膠電泳、免疫印跡分析和質(zhì)譜分析的方法對(duì)褐牙鲆抗原性蛋白進(jìn)行篩選，結(jié)果顯示LCDV滅活疫苗免疫后的褐牙鲆能產(chǎn)生識(shí)別LCDV主要衣殼蛋白的抗體，表明LCDV主要衣殼蛋白具有良好的免疫原性，可作為疫苗制備的候選抗原。Shin等[28]也通過同樣的技術(shù)方法對(duì)感染褐牙鲆的海豚鏈球菌(Streptococcusiniae)免疫原性蛋白進(jìn)行了篩選。免疫蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用為病原微生物免疫原性蛋白的篩選提供了便利的工具，也為相關(guān)疾病疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。

本次質(zhì)譜鑒定的4個(gè)蛋白中，有3個(gè)是衣殼蛋白(ORF66、ORF72和ORF92)，其中ORF66和ORF72為首次鑒定的具有免疫原性的衣殼蛋白。之前的研究發(fā)現(xiàn)CyHV-3免疫原性蛋白多數(shù)為囊膜蛋白[8,10,11]，但本研究的結(jié)果表明衣殼蛋白可能是激發(fā)宿主產(chǎn)生抗體的主要抗原，囊膜病毒入侵宿主后需要通過病毒囊膜與宿主細(xì)胞膜發(fā)生膜融合進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，因此病毒核衣殼可能在進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的過程中激發(fā)了宿主產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答，但具體的分子作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。另外，也有文獻(xiàn)報(bào)道用本文類似的方法只鑒定到一個(gè)免疫原性蛋白ORF12，該蛋白為腫瘤壞死因子受體的同源蛋白[13]。但ORF12是否真正具有免疫原性，作者并未對(duì)其進(jìn)行后續(xù)鑒定。本研究只對(duì)其中幾條明顯特異性免疫反應(yīng)的蛋白條帶進(jìn)行了質(zhì)譜分析，未對(duì)所有特異性免疫反應(yīng)的蛋白進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。因此，關(guān)于CyHV-3的免疫原性蛋白仍需要更多方法來確定。

本研究采用錦鯉抗CyHV-3陽性血清作為一抗對(duì)純化CyHV-3病毒顆粒進(jìn)行免疫印跡分析，對(duì)其中4條具有明顯特異性免疫反應(yīng)的蛋白膠條進(jìn)行LC-MS/MS鑒定，結(jié)果表明ORF92、ORF66、ORF72和ORF81為免疫原性蛋白，可作為血清學(xué)診斷方法的建立和亞單位疫苗、DNA疫苗研制的候選抗原。

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