楊夢莉，賴泳紅，郭鳳根，崔曉龍，王永霞，肖 煒，李治瀅

(1.云南大學生命科學學院/云南省微生物研究所，云南 昆明 650091；2.中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所，云南 昆明 650118；3.云南大學省部共建云南生物資源保護與利用國家重點實驗室，云南 昆明 650091；4.云南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學與生物技術學院，云南 昆明 650201)

【研究意義】燈盞花又名燈盞細辛[Erigeronbreviscapus(Vant.)Hand.-Mazz.]，屬菊科紫菀族飛蓬屬多年生草本植物[1]，主要分布于云南、貴州、廣西、湖南、西藏等地。作為一種藥用植物，它具有散寒解表、止痛舒絡、除濕祛風等功效[2]。黃酮是燈盞花重要的藥效成分之一[3]，目前，臨床上燈盞花主要用于治療中風、治療腦梗塞、心絞痛及冠心病等[4]。燈盞花是一種需求量大的重要藥用植物，值得深入研究?！厩叭搜芯窟M展】內(nèi)生菌能促進植物的生長、增加植株的抗逆性、產(chǎn)生多種代謝活性產(chǎn)物、增加宿主植物的他感作用等[5]。研究發(fā)現(xiàn)植物內(nèi)生菌的代謝產(chǎn)物與植物的藥用物質(zhì)表現(xiàn)出一致性[6]，因此，若能篩選出產(chǎn)活性物質(zhì)的內(nèi)生真菌，就能利用發(fā)酵技術生產(chǎn)有效的代謝物質(zhì)。【本研究切入點】目前，關于燈盞花的研究大量集中在燈盞花的藥理作用、HPLC測定及其生物學特性調(diào)查研究等方面，而對于燈盞花內(nèi)生真菌多樣性及其產(chǎn)黃酮真菌的篩選，只有國內(nèi)李治瀅[7]和何永美[8]等人曾做過相關研究?！緮M解決的關鍵問題】本研究對燈盞花內(nèi)生真菌進行分離、鑒定，以揭示其內(nèi)生真菌的多樣性，并對分離得到的內(nèi)生真菌進行產(chǎn)黃酮內(nèi)生真菌篩選，為探索燈盞花藥效成分新的生產(chǎn)途徑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試植物

燈盞花為一年生苗，由尋甸縣燈盞花栽培基地提供。

1.2 分離培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基，查氏培養(yǎng)基[9]。待倒平板時于培養(yǎng)基中加青霉素(80 U/mL)抑制細菌生長。

1.3 內(nèi)生真菌的分離

取燈盞花新鮮健康植株，分別對根、莖、花、葉用自來水沖洗干凈，用濾紙吸干水分，再用無菌水沖洗3遍，放入75 %酒精浸泡1～2 min，無菌水沖洗3遍，再用0.1 %升汞消毒，無菌水清洗3次。在無菌條件下，用滅過菌的手術剪將植株各器官剪成長寬0.5 cm×0.5 cm的小片，接種到真菌固體培養(yǎng)基上，置于28 ℃溫箱培養(yǎng)4～10 d。待各植物組織切面長出菌落后挑取邊緣部分，經(jīng)純化后即為燈盞花內(nèi)生真菌?？瞻讓φ眨簩⒆詈笠淮蜗礈斓臏缇坎加诳瞻灼桨逯校?8 ℃培養(yǎng)，結果材料周圍未見任何菌長出，證明所得菌株為內(nèi)生菌[8,10]。

1.4 分類鑒定

對分離獲得的燈盞花內(nèi)生真菌進行插片法培養(yǎng)，根據(jù)顯微形態(tài)特征的觀察并分類鑒定[9-11]。

1.5 菌株液體發(fā)酵培養(yǎng)

采用PDA液體培養(yǎng)基進行發(fā)酵，將在平板上活化后的菌株接種于裝有100 mL液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶內(nèi)。發(fā)酵條件為28 ℃，150 r/min培養(yǎng)10 d。

1.6 標準曲線的繪制

稱取10.0 mg干燥的無水蘆丁，置于50 mL容量瓶中，加入70 %乙醇定容搖勻；量取25 mL于50 mL容量瓶中，利用蒸餾水定容到刻度，制成標準曲線。吸取0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 mL。分別于25 mL容量瓶中加入30 %乙醇至12.5 mL；加入0.75 mL 5 %的NaNO2溶液，放置6 min；再加入0.75 mL 10 %Al(NO)3溶液，混勻放置6 min；最后加入1.0 mol/L的NaOH溶液10.0 mL，以30 %乙醇定容至刻度，放置15 min。在510 nm波長下測定吸光度，并以吸光度為橫坐標，濃度為縱坐標繪制標準曲線[8,12]?；貧w得到方程：Y=23.229x+0.558(R2=0.9924)。

1.7 檢測樣品的制備

液體發(fā)酵培養(yǎng)物5000 r/min離心10 min，取沉淀，按固液比1︰20加入70 % 乙醇于水浴鍋中進行超聲破碎，并加入70 %乙醇定容至25 mL，制得檢測樣品。

1.8 產(chǎn)物鑒定

1.8.1 黃酮的顯色反應檢測 鹽酸-鎂粉反應：取待測樣品，加入少量鎂粉，加入濃鹽酸4～5滴，置于沸水浴中加熱2～4 min，若待測樣品呈現(xiàn)紅色到紫紅色，表明此樣品中含有黃酮類化合物。

1.8.2 分光光度計測定 將制備的樣品取上清液用分光光度計在510 nm波長下測定吸光度值并計算出黃酮含量。

2 結果與分析

2.1 燈盞花內(nèi)生真菌分離

由表1可知，40株內(nèi)生真菌在燈盞花的分布部位的種群及數(shù)量有差異。根部位分布的內(nèi)生真菌的種群及數(shù)量都占優(yōu)勢，為18株(占總數(shù)的45 %)，葉10株(占總數(shù)25 %)，其次是莖8株(占總數(shù)20 %)，花4株(占總數(shù)10 %)。交鏈孢屬(Alternariasp.)和鐮孢霉屬(Fusariumsp.)為燈盞花內(nèi)生真菌優(yōu)勢種屬，分別占總數(shù)的25 %、20 %。交鏈孢屬(Alternariasp.)在燈盞花各個部位均有分布，而鐮孢霉屬(Fusariumsp.)只在根、莖、花中分布。此外鐮孢霉屬(Fusariumsp.)為根部和花部優(yōu)勢種群，分別占根部和花部內(nèi)生真菌總數(shù)的27 %、50 %。毛霉屬(Mucorsp.)為莖中優(yōu)勢菌群，占莖內(nèi)生真菌總數(shù)的37 %。交鏈孢屬(Alternariasp.)則是葉中優(yōu)勢菌群，占葉部內(nèi)生真菌總數(shù)的40 %。

從表1還可看出，交鏈孢屬(Alternariasp.)在燈盞花各部位均有分布，毛霉屬(Mucorsp.)在根部和莖部分布。而頭珠霉屬(Syncephalissp.)、腐質(zhì)霉屬(Humicolasp.)、毛殼菌屬(Chaetomiumsp.)、地霉屬(Geotrichumsp.)、根霉屬(Rhizopussp.)、毛霉屬(Mucorsp.)只在根部分布。單格孢屬(Monodictyssp.)只在莖部分離得到。無梗孢霉屬(Trichocladiumsp.)、串珠霉屬(Thielaviopsissp.)、痕格孢屬(Sirosporiumsp.)、青霉屬(Penlcilliumsp.)、單格孢屬(Ulacladiumsp.)在葉部分布。梨孢屬(Pyriculariasp.)僅僅分布在花上。

表1 燈盞花內(nèi)生真菌種群數(shù)量分布Table 1 Distribution in number and species of endophytic fungi in Erigeron breviscapus

2.2 產(chǎn)黃酮類內(nèi)生真菌篩選

從燈盞花植株中分離得到的40株內(nèi)生真菌，用顯色反應對分離得到的內(nèi)生真菌進行產(chǎn)黃酮類化合物的初步篩選，檢測發(fā)現(xiàn)7株能產(chǎn)黃酮類化合物。分別屬于交鏈孢屬(Alternariasp.)、鐮孢霉屬(Fusariumsp.)、痕格孢屬(Sirosporiumsp.)。根據(jù)線性回歸方程Y=23.229x+0.558(R2=0.9924)，計算得到黃酮類化合物質(zhì)量濃度 (表2)。

2.3 產(chǎn)黃酮內(nèi)生真菌發(fā)酵

由表2可知，在根部中分離得到的內(nèi)生真菌交鏈孢屬(Alternariasp.)、鐮孢霉屬(Fusariumsp.)產(chǎn)黃酮類化合物，占總菌數(shù)比例的57 %，黃酮類化合物的質(zhì)量濃度分別為2.625、2.231 mg/L。而葉部中交鏈孢屬(Alternariasp.)、痕格孢屬(Sirosporiumsp.)產(chǎn)黃酮，占總菌數(shù)比例的28 %，質(zhì)量濃度分別為1.928、2.012 mg/L。花部中只有鐮孢霉屬(Fusariumsp.)產(chǎn)黃酮，占總菌數(shù)比例的14 %，而質(zhì)量濃度僅為1.788 mg/L。根中黃酮類化合物質(zhì)量濃度最高。

3 討 論

本試驗中，共分離得到燈盞花內(nèi)生真菌40株，交鏈孢屬(Alternariasp.)、鐮孢霉屬(Fusariumsp.)為優(yōu)勢菌群，與李治瑩[7]早先的研究結果相似。其次，燈盞花各個部位內(nèi)生真菌的種群數(shù)量均有差異。根中內(nèi)生真菌的多樣性最高，其次是葉。本研究的結果與何永美等人[8]的結果相似，植株內(nèi)生真菌存在差異性可能原因是內(nèi)生真菌的多樣性與外界環(huán)境有關，包括土壤、氣候、水、光照等，多樣的環(huán)境更利于各種微生物的生存，根直接與土壤接觸，根受到土壤菌群的影響更大，創(chuàng)造多樣的環(huán)境，內(nèi)生菌類群更豐富。

近年來，國內(nèi)的研究已從多種藥用植物中分離獲得產(chǎn)生活性物質(zhì)的內(nèi)生真菌。表明內(nèi)生真菌對藥用植物的活性物質(zhì)合成具有積極的作用，其產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物與宿主的藥用成分相一致性[13]，因此，內(nèi)生真菌的代謝物具有較高研究價值。目前，相繼從銀杏[14]、杜仲[15]等藥用植物中發(fā)現(xiàn)可以產(chǎn)黃酮類化合物的內(nèi)生真菌。本試驗中，從40株內(nèi)生真菌中篩選到了7株能產(chǎn)黃酮的菌株，根部中分離到的產(chǎn)黃酮的內(nèi)生真菌較多且含量最高，其次是葉部和花部，在莖中未篩選到產(chǎn)黃酮的菌株，篩選出產(chǎn)黃酮類的內(nèi)生真菌為醫(yī)療用藥、生物防治、田間應用奠定了很好的基礎。本實驗中，采用常用方法進行內(nèi)生真菌的分離，進行發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)生代謝物質(zhì)，然后利用分光光度計進行活性物質(zhì)的測定。此方法只是進行產(chǎn)活性物質(zhì)內(nèi)生真菌的初步篩選，若進行精準篩選理想的活性菌株，方法技術還需進一步改進。

表2 產(chǎn)黃酮的燈盞花內(nèi)生真菌分離結果Table 2 Results of flavones-forming endophytic fungi in Erigeron breviscapus

4 結 論

純培養(yǎng)方法分離燈盞花根、莖、葉及花的內(nèi)生真菌，共獲得 14個屬40株內(nèi)生真菌，不同部位內(nèi)生真菌的數(shù)量、分布和種群存有差異性，根中內(nèi)生真菌的多樣性最高，其次是葉。共篩選到7株內(nèi)生真菌產(chǎn)黃酮類物質(zhì)，初步鑒定結果為交鏈孢屬(Alternariasp.)、鐮孢霉屬(Fusariumsp.)、痕格孢屬(Sirosporiumsp.)，根部中分離到的產(chǎn)黃酮的內(nèi)生真菌較多且含量最高，其次是葉部和花部，在莖部中未篩選到產(chǎn)黃酮的菌株。

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