翁惠芬， ，，， ，，，安風(fēng)

(1.福建省綠麒食品膠體有限公司，福建 漳州 363100；2.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021；3.福建省海藻多糖企業(yè)工程技術(shù)研究中心，福建 漳州 363100；4.福建省海洋功能食品工程技術(shù)研究中心，福建 廈門 361021)

0 引言

瓊脂又名瓊膠，是從石花菜(Gelidiumamansii)、江蘺(Gracilariaverrucosa)、雞毛菜(Pterocladiaetenuis)等紅藻中提取出來的一種天然多糖，是由瓊脂糖和瓊脂膠兩部分組成[1]，其中瓊脂糖是由1,3-β-D-半乳糖和1,4-3,6內(nèi)醚-ɑ-L-半乳糖結(jié)合成的鏈狀中性多糖。瓊脂具有凝膠、增稠和穩(wěn)定性能，含有豐富的礦物質(zhì)元素、多糖和膳食纖維，廣泛應(yīng)用于食品、輕工、日化、醫(yī)藥等領(lǐng)域中。目前，全世界瓊脂的生產(chǎn)原料約60%來源于江蘺菜屬，而在我國約80%來自江蘺菜屬[2]。

瓊脂的提取主要采用堿提法，常見的有低溫高堿、中溫高堿和高溫稀堿3種。前2種堿提法溫度適中，對瓊脂造成的損失較少，但是因堿處理時間較長，堿用量大，清洗用水較多，在能耗和環(huán)保方面，企業(yè)負(fù)擔(dān)較重。高溫稀堿提取法堿用量較少，處理時間較短，清洗用水較少，相對其他兩種方法，對環(huán)境壓力較小，且產(chǎn)品品質(zhì)較高，但因處理溫度較高，容易造成膠質(zhì)流失，影響產(chǎn)品得率，因此對工藝的控制要求較高。

目前企業(yè)多采用高溫稀堿法提取瓊脂，但隨著瓊脂需求量的日漸增長，高溫稀堿工藝的能耗大、污水處理負(fù)擔(dān)重等成本劣勢日益凸顯。因此，尋求一種高效、節(jié)能的綠色生產(chǎn)工藝，對瓊脂產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義。王維香等[3]通過復(fù)合酶解法從裙帶菜(Undariapinnatifida)中提取了硫酸多糖，確定了最佳工藝條件，硫酸多糖提取率為7.76%。趙謀明等[4]利用復(fù)合纖維素酶處理沙菜(Hypneaspinella)，很大程度提高了卡拉膠的產(chǎn)率，雖然對卡拉膠的硬度和脆性影響不大，但對其凝膠強度略有影響。

酶法提取海藻多糖已經(jīng)顯示出其巨大的優(yōu)勢，可有效減少提取工藝過程中堿的用量，是一種綠色環(huán)保的生產(chǎn)工藝。但是，酶法提取海藻多糖工藝十分復(fù)雜，提取過程中需要對酶的種類及配比、酶加入量、提取溫度、料水比、酶反應(yīng)pH值、酶反應(yīng)時間等多個因素進(jìn)行深入研究。因此，到目前為止，酶法提取海藻多糖尚處在實驗室研究階段，無法實現(xiàn)工業(yè)化推廣應(yīng)用。本實驗室分別采用纖維素酶輔助堿法工藝和完全酶法工藝提取江蘺瓊脂，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，纖維素酶促進(jìn)細(xì)胞壁纖維素的分解，有利于瓊脂膠質(zhì)溶出，提高了產(chǎn)品得率；瓊脂硫酸酯酶可有效脫除瓊脂的硫酸基團，提高瓊脂的凝膠強度[5-6]。在此基礎(chǔ)上，本文擬以瓊脂凝膠強度為考察指標(biāo)，通過單因素試驗優(yōu)化及中試放大試驗，優(yōu)化生物酶法提取瓊脂的工藝。該工藝替代堿法提取瓊脂生產(chǎn)工藝，可有效減少工業(yè)用堿和清洗用水的使用量，是一種前景可期的提膠工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

江蘺菜(Gracilarialemaneiformis)由綠新(福建)食品有限公司提供；纖維素酶(酶活力23 500 U/g)購自江蘇銳陽生物科技有限公司；瓊脂硫酸酯酶(酶活力251.9 U/mL)由本實驗室發(fā)酵制備，來自假交替單胞菌Pseudoalteromonascarrageenovora，該菌株保藏于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，編號23819。

實驗所用試劑均為分析純，其中濃硫酸、草酸、無水亞硫酸鈉、乙二胺四乙酸二鈉、酒石酸鉀鈉、濃鹽酸、硫酸鉀、一水合檸檬酸、氫氧化鈉、十二水合磷酸氫二鈉購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司，三羥甲基氨基甲烷(Tris)購自北京索萊寶科技有限公司，次氯酸鈉、草酸、羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)、3，5-二硝基水楊酸(DNS)、苯酚購自西隴化工股份有限公司。

1.2 高溫稀堿法提取瓊脂工藝

稱取清洗烘干至恒重江蘺50 g，加入800 mL水，在90 ℃的條件下，于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7%堿溶液中處理3 h，用自來水沖洗至中性。再依次加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%硫酸、0.015% EDTA-Na2、0.015%草酸浸泡1 h，清洗至中性。用有效氯質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.04%的次氯酸鈉溶液漂白1 h，水洗至中性。加入原料15～20倍水進(jìn)行煮膠，壓榨得到膠液，凝固，切塊，凍融，干燥。

1.3 酶法輔助提取江蘺瓊脂工藝流程

酶法輔助提取江蘺瓊脂工藝的具體流程如下：

1.4 復(fù)合酶法提取江蘺瓊脂工藝流程

復(fù)合酶法提取江蘺瓊脂工藝的具體流程如下：

1.5 實驗方法

1.5.1 纖維素酶活力測定

參照文獻(xiàn)[7]，取4支25 mL具塞試管，分別加入2.0 mL CMC-Na溶液，其中3支加入已稀釋的待測酶液0.5 mL，另一支作空白。將試管放置于50 ℃水浴中反應(yīng)30 min后，分別加入3.0 mL DNS溶液，在空白管加入0.5 mL已稀釋的待測酶液，沸水浴中處理10 min后定容至25 mL，以空白管調(diào)零，在540 nm處測定吸光度值。在以上條件下，1 min水解底物產(chǎn)生1 μg葡萄糖的酶量為1個酶活力單位。計算公式為：酶活力(U·g-1)=A×(1/0.5)×n×(1/30)×1000，其中，A為吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上的還原糖量(mg)；1/0.5為換算成1 mL的酶液；n為酶液稀釋倍數(shù)；1/30為換算成1 min；1000為單位換算系數(shù)。

1.5.2 瓊脂硫酸酯酶粗酶液酶活力測定

參照文獻(xiàn)[8]并進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，反應(yīng)體系包括80 μL 20 mmol/L對硝基苯硫酸鉀(p-NPS)(以50 mmol/L pH值7.0的Tris-HCl緩沖液配制)，20 μL酶液(稀釋20倍)，50 ℃下反應(yīng)10 min后，加入25 μL 1 mol/L NaOH終止反應(yīng)，加入預(yù)冷蒸餾水875 μL，在410 nm下測定吸光度值，以滅活酶的反應(yīng)體系作對照。瓊脂硫酸酯酶的活力(U)定義為：在上述條件下，每分鐘催化生成1 μg對硝基苯酚(p-NP)所需的酶量。

1.5.3 凝膠強度的測定

參照GB 1975—2010方法測定凝膠強度，配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%的瓊膠溶液，等量倒入2個100 mL燒杯中，冷卻，待凝膠形成后，蓋上表面皿，室溫放置15 h后，在凝膠強度測定儀上測定凝膠強度[9]。凝膠強度以質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%瓊膠(干基計)凝膠在15 ～20 s內(nèi)抗破法碼的質(zhì)量(g)與裝置桿下端的表面積(cm2)比值表示，單位為g·cm-2。

1.5.4 透明度的測定

配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的瓊膠溶液，趁熱(高于95 ℃)倒入比色皿中，室溫放置24 h，用紫外分光光度計在400～800 nm 間掃描，確定最大吸收波長700 nm，在最大吸收波長處測定樣品的透光率(T)[10]。

1.5.5 融化溫度和凝固溫度的測定

參照文獻(xiàn)[11]，配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%瓊脂溶液，取10.0 mL裝入試管中，室溫下冷卻過夜，在凝膠上放一個小玻璃珠，將試管置于30 ℃水浴中水浴10 min后，再以1 ℃/min的速度升溫，當(dāng)小球珠下落時，此時的溫度即為融化溫度。

配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%瓊脂溶液，室溫下凝固，測定裝置同融化溫度測定裝置，待試管內(nèi)凝膠凝固即傾斜試管時，凝膠能保持形體不變，抽出溫度計，凝膠表面不變形，此時的溫度即為凝固溫度。

1.5.6 硫酸根含量的測定

參照文獻(xiàn)[12]，稱取0.05 g干燥至恒重的瓊膠于錐形瓶中，加入25 mL 1 mol/L的鹽酸，在105 ℃的條件下消化4～5 h。待樣品冷卻后，加蒸餾水定容至25 mL，活性炭脫色后過濾并取1 mL上清液于試管中，然后加入3 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的吐溫-BaCl2溶液，振蕩混勻，靜置10 min，在360 nm下測定吸光度值，根據(jù)所作硫酸根標(biāo)準(zhǔn)曲線方程(y= 3.338 1x-0.006 3，R2= 0.999 1)換算出硫酸根含量。

1.5.7 瓊膠得率的測定

瓊膠得率/%=m瓊脂×(1-水分含量)×100/[m江蘺×(1-水分含量)]，式中：m江蘺為沒有經(jīng)過預(yù)處理的江蘺質(zhì)量；m瓊脂為瓊脂質(zhì)量。其中水分含量測定參考GB 5009.3—2016[13]進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶法輔助提取瓊脂工藝

2.1.1 酶解反應(yīng)單因素結(jié)果與分析

堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)是影響瓊脂提取率和凝膠強度的主要因素。江蘺通過堿處理后能減少影響凝膠強度的硫酸基團含量。不同堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)對瓊脂產(chǎn)品凝膠強度的影響效果如圖1a所示，可見，對酶降解后的江蘺進(jìn)行堿處理，隨著堿用量的增加，瓊脂的凝膠強度明顯升高，在堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%處達(dá)到最大值，繼續(xù)增加堿用量將使凝膠強度降低。因為江蘺經(jīng)過酶處理之后，纖維素酶作用于藻體，使藻體致密的細(xì)胞壁破裂，原來與纖維素結(jié)合的膠質(zhì)溶出，較高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的堿處理加劇了對瓊脂的裂解。

在固定堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)和堿處理溫度條件下，江蘺經(jīng)酶處理后瓊脂凝膠強度隨堿處理時間的變化情況如圖1b所示，可見，隨著堿處理時間的延長，瓊脂凝膠強度不斷增大，處理時間為2.5 h時達(dá)到最大。這可能是由于江蘺堿處理時間越長，硫酸基去除越徹底，瓊脂凝膠強度隨堿處理時間的延長而增強；而隨著江蘺進(jìn)行堿處理時間的再延長，所提取瓊脂的凝膠強度卻逐漸下降，可能是因為經(jīng)過酶處理后的江蘺，其部分膠質(zhì)已溶出。當(dāng)經(jīng)過長時間的堿處理，藻體再次發(fā)生膠溶現(xiàn)象，導(dǎo)致膠體大量流入堿液而造成損失，并且在試驗中也發(fā)現(xiàn)，堿處理時間越長，膠體自溶、流失也越嚴(yán)重，瓊脂的產(chǎn)率越低。

酶量的添加對體系的酶活力和江蘺菜的作用程度具有直接影響，結(jié)果如圖1c所示，可見，隨著酶用量的增加，瓊膠凝膠強度明顯增加，這是由于結(jié)構(gòu)致密的細(xì)胞壁逐漸被纖維素酶水解，利于瓊膠的溶出。再經(jīng)過一段時間的堿處理后，溶出的膠脫除了硫酸基使得凝膠強度增高。隨著酶用量的增加，溶出的膠也隨之增多，增大了堿對膠結(jié)構(gòu)破壞的機會。另外，由于纖維素酶作用底物專一性不強，可能切斷瓊膠1～4鍵，使凝膠強度下降。而且，纖維素酶作用后，纖維素類物質(zhì)溶解度大大增加，這些雜質(zhì)的溶入會影響多糖高分子結(jié)構(gòu)的形成。

酶水解過程中酶及底物均易受到體系pH值的影響。不同酶處理pH值對瓊脂提取效果的影響如圖1d所示?？梢?，在較高酸度條件下，瓊脂的凝膠強度較低，可能是由于江蘺藻體致密的細(xì)胞壁被破壞從而達(dá)到軟化，再經(jīng)過高溫堿處理后，膠質(zhì)大量溶出而被堿破壞，且在這一階段溶出的膠也將隨水洗而流失。因此，江蘺酶處理時應(yīng)盡量選擇在中性條件下進(jìn)行，這樣對瓊脂分子結(jié)構(gòu)不會造成破壞，對凝膠強度影響小。

酶處理時間的長短直接影響到底物的降解程度及水解產(chǎn)物的種類，酶的穩(wěn)定性及酶活力隨反應(yīng)時間的變化情況如圖1e所示。可見，瓊脂的凝膠強度隨著酶處理時間的延長呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，因為超過一定的作用時間后，纖維素酶開始作用于膠質(zhì)分子從而引起凝膠強度的下降。另外，江蘺經(jīng)過長時間酶處理，細(xì)胞壁破壞過大，在堿處理時容易對膠進(jìn)行降解從而影響瓊脂的凝膠強度。因此，必須控制適宜的酶處理時間。

酶處理溫度與酶水解速度密切相關(guān)。由圖1f可知，酶處理溫度對瓊脂凝膠強度有顯著影響，隨著溫度的升高，酶分子熱運動加快，增加了酶與江蘺細(xì)胞壁纖維素的碰撞，使江蘺細(xì)胞壁受到破壞，在進(jìn)行堿處理時，有利于堿的溶入進(jìn)而易于硫酸基的脫除。但考慮到酶處理溫度過高會使酶蛋白變性，影響酶活力，不僅影響產(chǎn)品得率和品質(zhì)，而且會使酶無法重復(fù)利用，造成酶的浪費。因此，選擇合適的酶處理溫度對酶法輔助提取有重要的意義，根據(jù)單因素試驗結(jié)果將酶解溫度設(shè)定為45 ℃。

2.1.2 堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)降至3%對小試優(yōu)化工藝的影響

通過上述對酶法輔助提取瓊脂的小試工藝進(jìn)行優(yōu)化可以發(fā)現(xiàn)，江蘺經(jīng)酶處理后再進(jìn)行堿處理可顯著減少堿的用量。但對于瓊脂生產(chǎn)企業(yè)來說，如果能夠利用酶法進(jìn)一步減少堿的用量甚至利用酶法完全取代堿法工藝，將為企業(yè)的可持續(xù)發(fā)展創(chuàng)造更為優(yōu)良的條件。在上述優(yōu)化工藝的基礎(chǔ)上，對堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)一步降低，固定堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%，酶處理溫度為45 ℃，對工藝條件中的加酶量、酶處理時間、堿處理時間再進(jìn)一步優(yōu)化。

在堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)降至3%后再對江蘺進(jìn)行酶處理，隨著酶用量的增加，瓊脂的凝膠強度呈現(xiàn)上升的趨勢，在加酶量達(dá)到4 U/mL時，凝膠強度達(dá)到最大895.5 g/cm2。隨著酶用量的進(jìn)一步增加，凝膠強度開始下降，在加酶量為6～8 U/mL這一階段變化趨勢較小，可能是因為纖維素降解后生成的還原糖對酶的作用產(chǎn)生了抑制。因此，選擇最適加酶量為4 U/mL(見圖2a)。

在酶處理時間為1 h時，提取的瓊脂凝膠強度達(dá)到最大值1017.0 g/cm2。由于瓊脂生產(chǎn)企業(yè)對瓊膠提取的規(guī)模較大，在各個工藝排水的階段耗時比較長，如果酶處理反應(yīng)的時間太短，將不利于生產(chǎn)上的實際操作。因此，選擇最適酶處理時間為1 h(見圖2b)。

隨著堿處理時間的延長，瓊脂凝膠強度不斷增大，在處理時間為3 h時達(dá)到最大，這可能是由于江蘺堿處理時間越長，硫酸基去除越徹底。而隨著江蘺進(jìn)行堿處理時間的延長，瓊脂的凝膠強度逐漸下降，但下降趨勢較為緩慢，可能是因為經(jīng)過長時間的堿處理，瓊脂的結(jié)構(gòu)被慢慢破壞，藻體也隨之發(fā)生了膠溶的現(xiàn)象。因此，選擇最適堿處理時間為3 h(見圖2c)。

2.1.3 酶法輔助提取瓊脂小試工藝驗證

在上述優(yōu)化條件下，即：堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%、堿處理時間2.5 h、加酶量4 U/mL、酶處理時間2.5 h、酶處理溫度45 ℃、酶處理pH 值7.0的條件下進(jìn)行小試驗證試驗，以確認(rèn)小試工藝的穩(wěn)定性，試驗結(jié)果見表1。表1中，堿法為采用堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7%的處理工藝提取，酶法輔助對照為沒有經(jīng)過酶預(yù)處理直接采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的堿處理工藝提取。

表1 酶法輔助提取工藝瓊脂指標(biāo)測定結(jié)果

由表1可知，經(jīng)酶處理后，堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)降至3%，在此工藝條件下，酶法的產(chǎn)率要略高于堿法，而且凝膠強度要高于堿法。影響凝膠強度的因素有很多，包括硫酸基及羰基含量、單糖組成、相對分子質(zhì)量大小、分子的立體結(jié)構(gòu)等[14]。從測得的硫酸基含量可知，酶法所提瓊膠的硫酸基含量要低于堿法，可解釋酶法凝膠強度要高于堿法。此外，二者在凝固溫度、融化溫度及透明度間區(qū)別不明顯，凝固溫度和融化溫度的變化與瓊膠化學(xué)性質(zhì)相關(guān)，也受到相對分子質(zhì)量大小及分布的影響[15]。其中，融化溫度主要受相對分子質(zhì)量大小的影響，隨著相對分子質(zhì)量的增加而升高[16]。

2.2 復(fù)合酶處理江蘺海藻的條件優(yōu)化

酶法輔助提取瓊脂工藝經(jīng)過優(yōu)化，堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)由原來的7%減少到3%。但提取過程中還是會排放含有較高質(zhì)量分?jǐn)?shù)堿的廢水，對環(huán)境保護也會造成一定的壓力。江蘺瓊脂提取過程中，堿的作用一方面是破壞細(xì)胞壁，有利于膠質(zhì)溶出，另一方面是脫除瓊脂分子上的硫酸基團，使其凝膠強度提高。因此，試驗采取復(fù)合酶的方法，加入纖維素酶破壞江蘺的細(xì)胞壁，并加入本實驗室發(fā)酵得到的瓊脂硫酸酯酶脫除瓊脂分子的硫酸基團，提高瓊脂分子的凝膠強度，從而達(dá)到完全替代堿的目的。酶法工藝提取瓊脂過程復(fù)雜，影響因素較多，如酶解溫度、時間、pH值、用量等都會影響酶解程度，間接影響了所提取到的瓊脂的品質(zhì)和產(chǎn)率。因此，本試驗采用單因素試驗的方法，對復(fù)合酶法提取瓊脂生產(chǎn)工藝進(jìn)行了優(yōu)化。

2.2.1 酶法提取瓊脂單因素試驗優(yōu)化

溫度是影響酶催化反應(yīng)的重要因素，復(fù)合酶法提取瓊脂工藝隨酶處理溫度的變化情況如圖3a所示，可見，復(fù)合酶的酶解溫度在50 ℃時，瓊脂的凝膠強度達(dá)到最大值373 g·cm-2。應(yīng)該是纖維素酶在最適溫度下達(dá)到最佳酶活力，充分破壞江蘺藻細(xì)胞壁，使瓊脂硫酸酯酶充分進(jìn)入藻體細(xì)胞與硫酸基團作用，從而脫除硫酸基，提高凝膠強度。在60 ℃時，由于溫度較高，直接影響了復(fù)合酶的活力，因此凝膠強度較低?；谏鲜鼋Y(jié)果，選取50 ℃為復(fù)合酶處理江蘺海藻的溫度。

在一定的原料基礎(chǔ)上，適量的纖維素酶用量不僅保證了纖維素的分解效率，同時也避免了對瓊脂分子的破壞。由圖3b可知，當(dāng)體系中纖維素酶單位活力在8～14 U/mL時，隨著纖維素酶含量的增加，瓊脂的凝膠強度逐漸增加，并在單位活力為14 U/mL時，達(dá)到最大值375 g·cm-2。這是因為在合適的纖維素酶活力下，江蘺藻細(xì)胞壁的纖維素被充分水解，膠質(zhì)溶出，在硫酸酯酶的作用下，硫酸基被脫除，從而提高了凝膠強度。隨著纖維素酶單位活力的提高，膠質(zhì)大量溶出，在后續(xù)的酸化和漂白作用下，瓊脂分子部分被破壞，導(dǎo)致凝膠強度的下降?；谏鲜鼋Y(jié)果，選擇纖維素酶的單位活力為14 U/mL。

料水比影響酶和江籬藻的接觸面積，從而影響反應(yīng)的速率。稱取洗凈并烘干至恒重的江蘺50.0 g，在纖維素酶和瓊脂硫酸酯酶的用量不變的情況下，研究體系料水比對瓊脂品質(zhì)的影響(見圖3c)?？梢姡?dāng)料水比(m/V)在1∶14～1∶18之間時，瓊脂的凝膠強度呈現(xiàn)逐漸上升趨勢，并在1∶18時達(dá)到最大值。因為當(dāng)體系水量足夠時，可以增大纖維素酶與江籬藻的接觸面積，加快反應(yīng)速率，利于膠質(zhì)溶出，與瓊脂硫酸酯酶充分作用。當(dāng)料水比繼續(xù)增加時，由于體系水量增大，纖維素酶的單位活力下降，影響了反應(yīng)速率。因此，當(dāng)料水比大于1∶18時，瓊脂的凝膠強度略微降低?；谏鲜鼋Y(jié)果，選擇1∶18作為復(fù)合酶處理江蘺藻的體系料水比。

處理時間直接影響到酶解程度，進(jìn)而影響到瓊脂的品質(zhì)。由圖3d可知，隨著處理時間的延長，瓊脂的凝膠強度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在處理2 h時，達(dá)到最大凝膠強度。因為適宜的酶解時間可以充分分解江蘺藻細(xì)胞壁的纖維素，使膠質(zhì)溶出，與硫酸酯酶充分作用，脫除硫酸基。如果酶解時間過長，江蘺藻細(xì)胞壁破壞過大，容易導(dǎo)致膠質(zhì)溶出，造成流失，而且在后續(xù)工序處理中，瓊脂分子可能受到化學(xué)試劑的破壞，進(jìn)而影響了瓊脂的凝膠強度。綜合考慮，選擇2 h為復(fù)合酶處理江蘺藻的時間。

2.2.2 復(fù)合酶法工藝瓊脂小試工藝驗證

根據(jù)上述優(yōu)化條件，即：酶處理溫度50 ℃、體系纖維素酶單位活力14 U/mL、料液比1∶18、酶處理時間2 h的條件下進(jìn)行小試驗證試驗，結(jié)果見表2。表2中，堿法為采用堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)7%的處理工藝提取，酶法對照為沒經(jīng)過酶預(yù)處理直接進(jìn)行酸處理提取得到。

由表2可知，采用復(fù)合酶法工藝提取江蘺瓊脂，產(chǎn)率略高于堿法工藝，但凝膠強度卻明顯較低。從硫酸基含量可以看出，酶法工藝瓊脂的硫酸基含量顯著高于堿法工藝，而硫酸基含量直接影響了瓊脂的凝膠強度。此外，酶法工藝瓊脂的融化溫度較堿法工藝低，可能是兩種工藝提取的瓊脂的相對分子質(zhì)量存在差異所致。在透明度方面，堿法工藝的瓊脂較高，但二者在凝固溫度方面差異不明顯。

表2 復(fù)合酶法提取工藝瓊脂指標(biāo)測定結(jié)果

2.3 酶法輔助與復(fù)合酶法提取瓊脂工藝200 L中試放大試驗

在酶法輔助和復(fù)合酶法提取瓊脂小試工藝驗證的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了200 L中試放大試驗，以進(jìn)一步確認(rèn)小試工藝的穩(wěn)定性及用于工廠中試的可行性，實驗結(jié)果見表3。

由于生物反應(yīng)器的規(guī)模不同，其流體與動量，熱量和質(zhì)量傳遞性能存在差異，在大小不同的反應(yīng)器中進(jìn)行同一試驗，有可能導(dǎo)致在中試反應(yīng)器上不能達(dá)到小試反應(yīng)器的最優(yōu)結(jié)果[17]。從表3可知，3種工藝提取得到的瓊脂，酶法輔助工藝的凝膠強度最大，堿法工藝次之，復(fù)合酶法工藝的最低，該結(jié)果與所測得的硫酸基團含量比較趨勢相呼應(yīng)。可見，中試提取所得的瓊脂與小試提取的瓊脂，所比較指標(biāo)的變化趨勢不變，試驗結(jié)果重復(fù)性較好。

表3 酶法輔助和復(fù)合酶法提取工藝瓊脂指標(biāo)測定結(jié)果

3 結(jié)論

為了減少瓊脂提取過程中堿的用量，建立瓊脂清潔生產(chǎn)工藝，通過單因素實驗對酶法輔助工藝和復(fù)合酶法工藝提取瓊脂進(jìn)行了優(yōu)化，確定了最優(yōu)工藝條件。其中，酶法輔助提取瓊脂工藝為：堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%，堿處理時間2.5 h，加酶量4 U/mL，處理溫度45 ℃，pH值7.0；復(fù)合酶法提取瓊脂工藝為：處理溫度50 ℃，處理時間2 h，體系中纖維素酶單位活力為14 U/mL，瓊脂硫酸酯酶單位活力為26.6 U/mL，料水比(m/V)為1∶18。對上述小試工藝進(jìn)行驗證試驗，其中酶法輔助工藝所提瓊膠的凝膠強度為831.9 g/cm2，產(chǎn)率為18.9%，兩指標(biāo)均優(yōu)于傳統(tǒng)工藝；復(fù)合酶法工藝提取得到的瓊脂凝膠強度為377.2 g/cm2，得率18.3%。同時，對兩種工藝分別進(jìn)行了200 L放大試驗，所獲得瓊脂產(chǎn)品的凝膠強度分別為1001.3 g/cm2和369.6 g/cm2，相關(guān)工藝指標(biāo)均呈現(xiàn)良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

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