何軍蘭，王永斌，賈忠，同重湘，韓建軍

（蘭州市肺科醫(yī)院呼吸內(nèi)科，甘肅 蘭州 730046）

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）感染引起的傳染性疾病[1]。機(jī)體在抵抗MTB的免疫過(guò)程中，T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫發(fā)揮主要作用。T細(xì)胞亞群根據(jù)功能不同可分為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Regulatory T cells，Tregs）、輔助性T細(xì)胞細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞等，其中Tregs在MTB慢性感染及發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要作用[2-3]。本文旨在通過(guò)對(duì)健康人群與結(jié)核患者特異性免疫指標(biāo)的變化對(duì)比。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2017年3月始蘭州市肺科醫(yī)院患者150例。根據(jù)下列納入標(biāo)準(zhǔn)分為5組：①對(duì)照組：T-SPOT試驗(yàn)陰性的未感染MTB的健康人或患者，排除患有結(jié)核，無(wú)明顯結(jié)核暴露史。②MTB潛伏感染者：T-SPOT試驗(yàn)陽(yáng)性的無(wú)臨床癥狀的MTB感染者。③未治療的活動(dòng)性肺結(jié)核患者：根據(jù)臨床癥狀、胸片或痰涂陽(yáng)性確定為肺結(jié)核者，尚未進(jìn)行抗結(jié)核治療。④抗結(jié)核治療3個(gè)月的活動(dòng)性結(jié)核患者：持續(xù)抗結(jié)核治療3個(gè)月的活動(dòng)性肺結(jié)核患者。⑤治愈的結(jié)核患者：活動(dòng)性肺結(jié)核經(jīng)抗結(jié)核治療后臨床痊愈者。均為30例。

1.2 方法

1.2.1 靶標(biāo)選擇

Tregs群中，CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞對(duì)機(jī)體抵抗MTB感染中發(fā)揮了主要的免疫應(yīng)答作用。Tregs分泌的腫瘤生長(zhǎng)因子TGF-β可緩沖炎癥反應(yīng)，保護(hù)機(jī)體組織[4]。

1.2.2 試驗(yàn)方法

1.2.2.1 不同疾病階段Treg表型變化

采集外周血1 0 m L，計(jì)數(shù)、洗滌方法同上，用RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至所需濃度。將單個(gè)核細(xì)胞接種于96孔板，每孔5×106個(gè)細(xì)胞，加入2.5 μg/ml的抗原ESAT-6刺激48h，利用流式細(xì)胞術(shù)（Flow cytometry，F(xiàn)CM）檢測(cè)CD4、CD25、Foxp3、CTLA-4和GITR等分子[5]。

1.2.2.2 不同疾病階段Treg抑制效應(yīng)T細(xì)胞的能力

采集外周血10 mL，計(jì)數(shù)、洗滌方法同上，用結(jié)核抗原ESAT-6刺激的同時(shí)加入達(dá)利珠單抗注射液（抗人CD25抗體）以抑制Tregs，培養(yǎng)后對(duì)細(xì)胞表面分子（CD4、CD8）的染色，經(jīng)過(guò)固定、透膜后再染細(xì)胞內(nèi)的FoxP3分子，染色后樣品以FACS calibur流式 細(xì)胞儀檢測(cè)；收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，應(yīng)用ELISA測(cè)定反映Treg功能的細(xì)胞因子TGF-β、IL-10和反映效應(yīng)T細(xì)胞功能的免疫分子IFN-γ、TGF-β、IL-2、TNF-α、穿孔素。

2 結(jié) 果

2.1 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及FoxP3檢測(cè)

感染MTB的患者（無(wú)論是否治愈），CD4+T細(xì)胞明顯多于CD8+T細(xì)胞（P ＜ 0.05）。FoxP3+與CD4+T細(xì)胞陽(yáng)性率無(wú)顯著性差異（P＞0.05），與轉(zhuǎn)錄因子FoxP3主要表達(dá)于自然調(diào)節(jié)性CD4+T細(xì)胞說(shuō)法相符合。流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果組間陽(yáng)性率比較為：健康組＜未治療活動(dòng)性結(jié)核組＜治療中活動(dòng)性結(jié)核組＜潛伏感染組＜治愈組。如表1。

表1 流式細(xì)胞檢測(cè)陽(yáng)性率 [n（%）]

2.2 ELISA靶標(biāo)檢測(cè)

利用ELISA測(cè)定各組別中試驗(yàn)對(duì)象的血清中工IL-2、IFN-γ、TGF-β和穿孔素的水平。如表2。

表2 ELISA測(cè)定各靶標(biāo)平均值（±s，ng/mL）

表2 ELISA測(cè)定各靶標(biāo)平均值（±s，ng/mL）

組別IL-2IFN-γTGF-β穿孔素健康對(duì)照組35.99±20.6258.76±33.5284.22±13.07 0.08±0.03潛伏感染組66.20±17.2645.57±15.84103.75±14.33 0.14±0.35未治療活動(dòng)性結(jié)核組82.45±29.4552.66±4.48102.41±27.13 0.15±0.27治療中活動(dòng)性結(jié)核組100.01±38.97 59.96±22.44113.74±15.61 0.13±0.07治愈組52.29±21.5654.00±13.2885.75±26.50 0.09±0.14 P ＜ 0.05＞0.05 ＜ 0.05 ＜ 0.05

3 討 論

Tregs在MTB感染過(guò)程中發(fā)揮重大免疫作用，但同時(shí)MTB也可減弱CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力，可通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡延遲Tregs應(yīng)答以及降低Tregs釋放免疫因子的能力。這兩點(diǎn)在本實(shí)驗(yàn)中也得到了證實(shí)，表現(xiàn)在流式細(xì)胞檢測(cè)陽(yáng)性率結(jié)果中活動(dòng)期陽(yáng)性率低于潛伏期，以及ELISA測(cè)定結(jié)果值中各指標(biāo)相對(duì)值的變化。此外，本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)不同組別免疫指標(biāo)對(duì)比，可歸納出MTB感染者不同疾病階段或病理狀態(tài)下Tregs功能的變化，從而為臨床判斷結(jié)核病情處于發(fā)展、轉(zhuǎn)歸、治愈何種階段提供指導(dǎo)意義，進(jìn)而給予相應(yīng)免疫治療的干預(yù)；同時(shí)試驗(yàn)也可為今后結(jié)核感染免疫制劑的研發(fā)提供參考價(jià)值。

[1] 買月琴.結(jié)核患者DC亞群的變化和結(jié)核桿菌抗原對(duì)DC成熟及調(diào)節(jié)γδT細(xì)胞功能的影響[D].蚌埠醫(yī)學(xué)院,2012.

[2] 董 毅,吳利先.T細(xì)胞免疫在抗結(jié)核桿菌感染中的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2014,14(18):3593-3595.

[3] 焦志軍,尤海燕,陳 蕾,等.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表達(dá)FoxP3的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞[J].臨床檢驗(yàn)雜志,2008,(3):161-163.