劉正端，劉麗娜，劉 源，王延朋，尹先哲，趙智偉

(1. 河南南陽(yáng)市第二人民醫(yī)院，河南 南陽(yáng) 473012； 2. 河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院,河南 南陽(yáng) 473000)

食管癌在我國(guó)發(fā)病率和死亡率居高不下，腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是其生存率低下的主要原因?，F(xiàn)有研究表明[1]，MMP-2、MMP-9和N-cadherin在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，TIMP-1、E-cadherin低表達(dá)，這些細(xì)胞因子和蛋白參與細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程。通幽湯是治療食管癌的傳統(tǒng)名方，臨床應(yīng)用能明顯改善患者癥狀和預(yù)后，但對(duì)該方的作用機(jī)制尚無(wú)研究。本研究運(yùn)用細(xì)胞藥理學(xué)方法觀(guān)察通幽湯對(duì)食管鱗癌細(xì)胞MMP-2、MMP-9、TIMP-1、 鈣黏聯(lián)蛋白的含量影響。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

《脾胃論》所載通幽湯組成：紅花 0.3 g，桃仁泥 0.3 g，生熟地各 1.5 g，當(dāng)歸 3 g，炙甘草 3 g，升麻 3 g，檳榔1.5 g，由河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中藥房配制。食管鱗癌細(xì)胞株KYSE150(上海細(xì)胞生物研究所)；DMEM培養(yǎng)基(GIBCO 公司)；胎牛血清(Hyclone 公司)；胰蛋白酶(華美公司)； 1640培養(yǎng)基(BI，美國(guó))；FBS(BI，美國(guó))；CCK-8試劑盒(同仁化學(xué)，日本)； ELISA 試劑盒(Santa Cruz 公司)；MMP-2、MMP-9、N-cadherin單克隆抗體(Sigma公司)；TIMP-1、E-cadherin單克隆抗體(Sigma 公司)；GAPDH單克隆抗體(Abcam公司)；BB-94 (Oxford, 英國(guó))；transwell試劑盒(Corning公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 使用10%胎牛血清(FBS) DMEM培養(yǎng)液(含青鏈霉素 100U/mL)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃5%CO2。

1.2.2 中藥配制 使用《脾胃論》所載通幽湯原方加入 25倍體積去離子水，浸泡 30 min大火煮沸，小火繼續(xù)煎煮約 45 min收集藥液，燒杯中濃縮至 200 mL，6000 r/min×30 min 高速離心取上清， 計(jì)算方藥提取物濃度，培養(yǎng)液配制濃度至 500μg/μL，超凈工作臺(tái)過(guò)濾分裝，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的KYSE150細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液， 1×104/孔接種于96 孔板中， 37 ℃ 5%CO2條件下培養(yǎng)， 24 h 后棄上清，加入含方藥提取物的培養(yǎng)液 100 μL，終濃度分為6400～100μg/mL范圍內(nèi)，倍比稀釋7個(gè)濃度梯度，每組5個(gè)復(fù)孔，以常規(guī)培養(yǎng)的細(xì)胞作為陰性對(duì)照，并留取空白孔調(diào)零，分別于24 h、 48 h、72 h后加入 10 μL /孔的 CCK-8溶液， 4 h后在450 nm處檢測(cè)OD值。橫坐標(biāo)為藥物濃度，縱坐標(biāo)為抑制率，繪制抑制曲線(xiàn)，并得出半數(shù)抑制濃度 (IC50)。按下列公式計(jì)算抑制率： 腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組 OD 值/對(duì)照組 OD 值)×100%。

1.2.4 通幽湯全方對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響 在腔室培養(yǎng)瓶中接種處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的KYSE-150細(xì)胞，每瓶約1×104個(gè)細(xì)胞，24 h后按0和812μg/mL濃度加入通幽湯方藥提取物，再培養(yǎng)24 h取下細(xì)胞爬片，PBS漂洗2遍，加入配好的凋亡染液，室溫避光孵育15 min，熒光顯微鏡下觀(guān)察。Annexin V-FITC熒光信號(hào)呈綠色，Propidium iodide (PI) 熒光信號(hào)呈紅色。

1.2.5 劃痕愈合實(shí)驗(yàn) 在6孔板的每孔背后，約每隔0.5～1 cm劃一道橫線(xiàn)，每孔5條橫線(xiàn)。 每孔中加入約5×105個(gè)細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，12 h后垂直于橫線(xiàn)劃痕。PBS洗3次，無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)組加入終濃度812μg/mL的提取物。陽(yáng)性對(duì)照組為40 ng/mL的BB-94，放入37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)?？砂?、6、12、24 h時(shí)間點(diǎn)取樣、拍照。

1.2.6 transwell實(shí)驗(yàn) 用50 mg/L Matrigel 1∶8稀釋液包被Transwell小室上室面的底部膜。24孔培養(yǎng)板中實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞每孔加入含方藥提取物終濃度812μg/mL的500 μl無(wú)血清培養(yǎng)基，陰性對(duì)照組為500 μl的無(wú)血清培養(yǎng)基，陽(yáng)性對(duì)照組為含有40 ng/mL BB-94的培養(yǎng)基，37 ℃ 24 h。消化細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度至1×105/mL。將小室放入另外一個(gè)加有10%FBS培養(yǎng)基的24孔培養(yǎng)板中，在上室加入300 μL細(xì)胞懸液，常規(guī)培養(yǎng)48 h。結(jié)晶紫染色，顯微鏡下拍照，隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)并計(jì)算遷移率，各組實(shí)驗(yàn)均重復(fù) 5 次。

1.2.7 蛋白提取 將各組細(xì)胞冰上收集、離心、裂解，15000 r/min離心20 min取上清，Bradford法測(cè)蛋白濃度，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.8 培養(yǎng)上清液中MMP-9、MMP-2和TIMP-1含量 收集各組食管鱗癌細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用ELISA法檢測(cè)MMP-2、MMP-9、TIMP-1含量，將一抗用包被稀釋液(0.05 mol/L PH9.6的碳酸鹽緩沖液)稀釋后加入96孔板中，37 ℃ 4 h棄去孔中液體。 封閉(5% BSA)酶標(biāo)反應(yīng)孔，加入待檢測(cè)各組樣品，放入37℃40 min洗滌3遍， 加入酶標(biāo)抗體和底物液，37 ℃避光5 min。加入終止液終止反應(yīng)，450 nm波長(zhǎng)吸光度(OD值)。將樣品OD值代入用標(biāo)準(zhǔn)物濃度與OD值計(jì)算出的直線(xiàn)回歸方程式中，計(jì)算出樣品濃度再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。

1.2.9 Western blot 分析方法 灌膠、上樣、電泳、轉(zhuǎn)移、染色，封閉1 h，4℃條件下一抗孵育過(guò)夜、洗膜，抗兔二抗孵育， ECL 顯影，GAPDH為內(nèi)參。

2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 通幽湯對(duì) KYSE150 細(xì)胞增殖的影響

圖1顯示， 不同濃度的通幽湯全方對(duì) KYSE150細(xì)胞增殖的抑制程度不同，抑制率與藥物濃度呈量效依賴(lài)性關(guān)系， 6400 μg/mL的藥物濃度作用24 h、48 h和72 h后藥物抑制率都大于 93.6%。 3個(gè)時(shí)間段的 IC50值分別是24 h組 IC50=1540 μg/mL，48 h組 IC50=1290 μg/mL，72 h組 IC50=1108 μg/mL。

3.2 通幽湯顯著增加

圖2顯示，KYSE-150細(xì)胞凋亡敏感性812μg/mL濃度的藥物處理KYSE-150細(xì)胞24 h，先后用Annexin V-FITC和PI染色，10×倍鏡下取3個(gè)不同視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)通幽湯能夠同時(shí)增加早期和晚期凋亡的敏感性(P<0.05)。

3.3 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖3表1顯示，與陰性對(duì)照組食管鱗癌細(xì)胞比較，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的體外遷移能力受到明顯的抑制，48 h后實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞劃痕的愈合程度明顯小于陰性對(duì)照組，該結(jié)果說(shuō)明通幽湯可以抑制KYSE150細(xì)胞的體外遷移能力(P<0.05)。

表1 各組KYSE150細(xì)胞劃痕后愈合程度比較

注：與陰性對(duì)照組比較:*P<0.05

3.4

圖4顯示，Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果與陰性對(duì)照組食管鱗癌細(xì)胞比較，通幽湯處理后KYSE150細(xì)胞的侵襲能力下降。陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組各組跨膜的細(xì)胞數(shù)分別為(171±13.4)、 (66.2±7.35)、 (76.8±9.19)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3.5 各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液水平比較

表2顯示，各組食管鱗癌細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MMP-9、MMP-2和TIMP-1含量比較，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組比較MMP-9和MMP-2表達(dá)水平下降(P<0.05，P<0.05)，TIMP-1水平升高(P<0.05)。

表2 各組KYSE150細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MMP-9、MMP-2和TIMP-1水平比較

注：與陰性對(duì)照組比較：*P<0.05

3.6 通幽湯對(duì)轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖5顯示，Western-blot 法結(jié)果表明，通幽湯作用KYSE150 細(xì)胞48 h后， MMP-9、MMP-2和N-cadherin等促轉(zhuǎn)移蛋白與對(duì)照組比較明顯減少(P<0.05)， TIMP-1蛋白和E-cadherin蛋白明顯增加(P<0.05)，說(shuō)明通幽湯能夠抑制食管癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的表達(dá)。

4 討論

過(guò)去癌癥的研究主要集中在癌細(xì)胞突變方面的研究，因?yàn)橥蛔兛梢宰尲?xì)胞增殖或永生。腫瘤微環(huán)境是影響癌癥惡化的關(guān)鍵因素。細(xì)胞外基質(zhì) (extracellular matrix, ECM) 成分的降解是腫瘤的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵，基質(zhì)金屬蛋白酶 (matrix metalloproteinases, MMPs) 能降解 ECM，而 MMPs的活性與金屬蛋白酶組織抑制劑 (tissueinhibitor of metalloproteinase, TIMPs) 有關(guān)[3]。MMP-2、MMP-9、N-cadherin在癌細(xì)胞中高表達(dá)，TIMP-1、E-cadherin在癌細(xì)胞中低表達(dá)，它們與細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)?；|(zhì)金屬蛋白酶幾乎存在于所有的人類(lèi)癌癥中，它們可以在健康的成纖維細(xì)胞中表達(dá)，在與癌癥相關(guān)的成纖維細(xì)胞或著癌細(xì)胞中表達(dá)，這個(gè)現(xiàn)象意義重大。因?yàn)榛|(zhì)金屬蛋白酶可以影響腫瘤微環(huán)境，包括血管生成、腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[4-5]， 因此MMP的表達(dá)與腫瘤侵犯、腫瘤分期和預(yù)后相關(guān)[6-7]。MMP的轉(zhuǎn)錄表達(dá)被十分嚴(yán)格的控制，其表達(dá)量通常很低。進(jìn)一步的調(diào)控發(fā)生在翻譯后修飾，修飾需要酶的參與，但是修飾酶的表達(dá)與組織金屬蛋白酶抑制劑(TIMPs) 存在共表達(dá)的關(guān)系[8]。許多研究表明，TIMP-1可以抑制MMPs的表達(dá)，發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移[9-10]，從而達(dá)到調(diào)控MMP表達(dá)的監(jiān)管作用。病理?xiàng)l件下這些監(jiān)管機(jī)制的失調(diào)可能會(huì)導(dǎo)致疾病的惡化。

中醫(yī)學(xué)將食管癌歸為噎膈范疇辨證論治。病機(jī)早期氣機(jī)不暢、津液凝結(jié)成痰，繼續(xù)發(fā)展為氣滯血瘀、痰郁生火，晚期氣微陽(yáng)虛、津虧血燥；治療以早期治標(biāo)為主，理氣化痰降火；晚期治本為要，滋陰潤(rùn)燥或補(bǔ)氣溫陽(yáng)。臨床上，該病確診時(shí)大部分已到中晚期，因此幾乎所有的患者都存在程度不一的血行瘀滯內(nèi)停的病理變化，主要臨床表現(xiàn)有腫塊、疼痛、舌質(zhì)暗紫等。許多臨床實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，惡性腫瘤患者普遍存在血液高凝狀態(tài)[2]，而且隨著腫瘤的發(fā)展高凝狀態(tài)有逐漸加重的趨勢(shì)，因此血液的高凝狀態(tài)與腫瘤的發(fā)展有著密切的聯(lián)系。血液高凝也往往伴隨MMPs表達(dá)水平的升高[11]。雖然中醫(yī)所說(shuō)的血瘀與目前臨床所講的血液高凝狀態(tài)概念和使用范圍有所不同，但血液的高凝狀態(tài)是中醫(yī)所講血瘀的一種。通幽湯是中醫(yī)治療食管癌的傳統(tǒng)名方，現(xiàn)代臨床運(yùn)用能明顯改善患者的癥狀和預(yù)后。原方的桃仁、紅花對(duì)于改善血液高凝狀態(tài)療效明顯[12]，再加上通幽湯臨床應(yīng)用能明顯改善患者癥狀和預(yù)后，由此可推斷通幽湯有可能通過(guò)破結(jié)行瘀的作用，發(fā)揮抑制食管癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移、緩解食管癌癥狀的作用。

本研究以《脾胃論》所載通幽湯原方為研究對(duì)象，用生地、熟地、當(dāng)歸滋陰養(yǎng)血固其本；桃仁、紅花破結(jié)行瘀；升麻升清降濁，升降相因；檳榔末破積降氣；甘草調(diào)和諸藥，全方具有養(yǎng)血理血、調(diào)理氣機(jī)之功效。臨床上通幽湯配合西藥化療，一方面加強(qiáng)療效，另一方面也可以治療緩解化療造成的吐逆等消化道反應(yīng)。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)是藥物實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)證明，通幽湯能夠抑制食管癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。分子機(jī)制研究表明，通幽湯能夠下調(diào)MMP-2、MMP-9、N-cadherin表達(dá)，上調(diào)TIMP、E-cadherin的表達(dá)，從而抑制癌細(xì)胞的侵襲和遷移，為通幽湯的臨床應(yīng)用提供客觀(guān)的分子基礎(chǔ)依據(jù)。BB-94(batimastat，BB-94)是人工合成的金屬蛋白酶抑制劑，能夠抑制MMPs的酶活性，進(jìn)而抑制癌細(xì)胞的侵襲和遷移。本研究用BB-94作為陽(yáng)性對(duì)照組的處理藥物。

本研究是在通幽湯原方的基礎(chǔ)上進(jìn)行的，臨床應(yīng)用宜根據(jù)辨證論治的結(jié)果，方藥加減變化靈活，從不同的臨床需要出發(fā)，發(fā)揮更大更全面的臨床治療效果。

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