劉 睿，陳啟賀，任金威，徐 騰，李 林，杜 倩，烏 蘭，劉欣然，李 勇

(北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)系，北京 100191)

急性酒精中毒(acute alcoholism，AAI)俗稱醉酒，是指因短時(shí)間內(nèi)攝入過量酒精或酒類飲料引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)由興奮轉(zhuǎn)為抑制的狀態(tài)，按程度可分為興奮期、共濟(jì)失調(diào)期和昏睡期，又可稱為急性乙醇中毒。急性酒精中毒可能造成肝臟、心腦血管等多系統(tǒng)損傷，嚴(yán)重者甚至可危及生命。據(jù)統(tǒng)計(jì)，急性酒精中毒已成為節(jié)假日里發(fā)病率最高的3種疾病之一，且發(fā)病年齡段多集中在25～45歲，因此尋找方便有效的防治措施有著重要的意義[1-2]。在所有因飲酒導(dǎo)致的疾病中，酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)最為常見，ALD指因酒精損傷肝細(xì)胞而引起的一系列疾病，臨床常見的有酒精性脂肪肝、酒精性肝炎和酒精性肝硬化。在我國(guó)酒精性肝病已成為僅次于病毒性肝炎的第二大肝病病因，發(fā)病率也呈逐年上升趨勢(shì)。但目前除控制酒精攝入外尚無ALD特異治療方法，臨床上使用糖皮質(zhì)激素或丙基硫氧嘧啶治療ALD，但是這些藥物在應(yīng)用中仍有爭(zhēng)議。急性肝損傷是許多肝臟疾病的初始環(huán)節(jié)和共同途徑，因此通過功能性食品在急性肝損傷早期避免或緩解對(duì)肝臟的損害，防治ALD的發(fā)生，成為當(dāng)今研究的新趨勢(shì)[3-6]。

人參在我國(guó)已有四千多年的藥用歷史，我國(guó)的人參屬五加科、人參屬的多年生草本植物，主要產(chǎn)于吉林省，是聞名遐邇的“東北三寶”之一。研究發(fā)現(xiàn)，人參具有抗氧化、抗疲勞、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力、改善記憶力等作用[7]，其中人參的抗氧化作用已經(jīng)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和人體研究中得到證實(shí)，而關(guān)于人參的抗炎作用則報(bào)道較少[8-10]。人參低聚肽(ginseng oligopeptides，GOP)是利用生物酶解技術(shù)從人參中得到的小分子生物活性肽，主要是由分子量很小但活性很高的短肽分子組成。研究發(fā)現(xiàn)，低聚肽可以有效提高蛋白質(zhì)的吸收利用率，要比單個(gè)氨基酸的吸收更為有效，但現(xiàn)有研究多集中于體外研究，且大部分針對(duì)人參蛋白，對(duì)其功能研究較少報(bào)道[7，11]。

本研究擬采用大鼠急性酒精中毒模型，探討人參低聚肽對(duì)急性酒精中毒和早期肝損傷的保護(hù)作用，并對(duì)其可能的作用機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步的探索，為人參低聚肽在作為保護(hù)機(jī)體免受酒精傷害和抗酒精性肝損傷的功能性因子的保健食品及藥品的開發(fā)方面提供實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 樣品

人參低聚肽(GOP)，淡黃色固體粉末，由吉林肽谷生物工程有限責(zé)任公司提供。GOP是利用生物酶解技術(shù)從吉林人參中得到的小分子生物活性肽的混合物，相對(duì)分子質(zhì)量分布為：<180(占71.36%)、180～500(占20.16%)、500～1 000(占5.87%)、1 000～2 000(占1.97%)、>2 000(占0.64%)。質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95.42%，氨基酸總量占3.94%。乳清蛋白，由北京中柏公司提供，其蛋白含量為78%。

1.2 主要試劑和儀器

主要試劑：無水乙醇(分析純)；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)檢測(cè)試劑盒，英科新創(chuàng)(廈門)科技有限公司；乙醇脫氫酶(ADH)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、白介素-1β(IL-1β)試劑盒，北京安迪華泰科技有限公司。

主要儀器：Adventurer TM通用型分析天平，美國(guó)奧豪斯國(guó)際貿(mào)易有限公司；Eppendorf高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)艾本德股份公司；電熱恒溫水浴鍋，北京天林恒泰科技有限公司；FSH-2A可調(diào)高速電動(dòng)勻漿機(jī)，金壇市金南儀器廠；日本奧林巴斯株式會(huì)社全自動(dòng)生化儀AU400，英科新創(chuàng)(廈門)科技有限公司；352型酶標(biāo)儀，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；GNP-9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海創(chuàng)奕科教設(shè)備有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠，適應(yīng)期結(jié)束時(shí)，體重200±20g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。飼養(yǎng)地點(diǎn)為北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部，動(dòng)物實(shí)行分籠飼養(yǎng)，每籠3只，實(shí)驗(yàn)期間自由飲水、進(jìn)食。動(dòng)物飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室符合國(guó)標(biāo)SPF級(jí)，溫度范圍為22±2℃，相對(duì)濕度為50%～60%，晝∶夜明暗交替時(shí)間為12 h∶12 h。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1動(dòng)物分組及用藥 按體重將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為7組，1組為正常對(duì)照組，其余6組為模型組：即1個(gè)模型對(duì)照組、1個(gè)乳清蛋白對(duì)照組(0.25g/kg BW)和4個(gè)人參低聚肽組(0.062 5、0.125 0、0.250 0、0.500 0g/kg BW，分別對(duì)應(yīng)GOP 1、GOP 2、GOP 3和GOP 4組)。每日經(jīng)口灌胃給予受試樣品，受試樣品給予時(shí)間30d?？瞻讓?duì)照組和模型對(duì)照組給予蒸餾水，乳清蛋白組和人參低聚肽組給予相應(yīng)濃度受試物，灌胃量為1mL/100g，人參低聚肽和乳清蛋白溶液均用蒸餾水配制。動(dòng)物每周稱重2次，按體重調(diào)整受試樣品劑量。給予受試樣品結(jié)束后將模型對(duì)照組及各樣品組一次性灌胃給予50%乙醇17.5mL/kg BW(7g/kg BW)，空白對(duì)照組給予蒸餾水。實(shí)驗(yàn)期間觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的一般情況，包括毛色、精神狀態(tài)、日常活動(dòng)情況等。

1.4.2翻正反射 模型組以翻正反射是否消失或恢復(fù)為指標(biāo)觀察大鼠的醉酒與醒酒情況。將大鼠背向下輕置于動(dòng)物籠內(nèi)，如果大鼠保持背向下的姿勢(shì)30s以上，則認(rèn)為翻正反射消失，即為醉酒；當(dāng)翻轉(zhuǎn)反射消失的大鼠能夠自主從背向下的姿勢(shì)翻轉(zhuǎn)過來時(shí)，為翻正反射恢復(fù)，即為醒酒。實(shí)驗(yàn)過程中記錄灌酒后翻轉(zhuǎn)反射消失的動(dòng)物只數(shù)、翻轉(zhuǎn)反射消失時(shí)間及翻轉(zhuǎn)反射恢復(fù)時(shí)間，從翻轉(zhuǎn)反射消失到翻正反射恢復(fù)的這段時(shí)間則為翻轉(zhuǎn)消失持續(xù)時(shí)間[12]。

1.4.3乙醇代謝酶檢測(cè) 大鼠灌酒后，禁食16h經(jīng)股動(dòng)脈采血后處死，分離血清及血漿并留取肝臟，進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)。在冰浴剝離肝臟，除去脂肪組織，用預(yù)冷的生理鹽水漂洗組織至無血色，稱取相同部位組織適量，制成勻漿，3 000r/min低溫離心10min，取上清，檢測(cè)肝組織乙醇脫氫酶(ADH)的活性。

1.4.4血生化指標(biāo)檢測(cè) 血液3 000r/min離心10min后，分離血清，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)的含量。

1.4.5炎癥因子水平檢測(cè) 血液3 000r/min離心10min后，分離血清，用 ELISA 法檢測(cè)血清中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、白介素-1β(IL-1β)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果與分析

2.1 人參低聚肽對(duì)SD大鼠翻正反射的影響

給予受試樣品的30d內(nèi)，各組大鼠的毛色、精神狀態(tài)和糞便等均正常，無明顯的差異。酒精灌胃后模型對(duì)照組大鼠出現(xiàn)了明顯的酒精中毒現(xiàn)象，如反應(yīng)遲鈍、嗜睡、活動(dòng)減少、精神萎靡，有些大鼠表現(xiàn)極度活躍、狂躁，隨后轉(zhuǎn)為安靜狀態(tài)、嗜睡、精神萎靡等；人參低聚肽干預(yù)組大鼠精神狀態(tài)明顯較模型對(duì)照組好，在高劑量組表現(xiàn)得尤為明顯。由表1可知，實(shí)驗(yàn)各組體重?zé)o明顯差異(P>0.05)。與模型對(duì)照組相比，人參低聚肽干預(yù)組大鼠翻正反射消失只數(shù)減少，翻正反射消失的比率明顯降低，GOP 4組與模型對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。人參低聚肽干預(yù)組翻正反射消失的時(shí)間明顯長(zhǎng)于模型對(duì)照組，恢復(fù)時(shí)間明顯短于模型對(duì)照組。

表1 人參低聚肽對(duì)SD大鼠翻正反射的影響(n=10)

注：**與模型對(duì)照組相比，P<0.01

2.2 人參低聚肽對(duì)SD大鼠血清生化指標(biāo)的影響

血清ALT、AST水平是評(píng)價(jià)早期肝損傷的常用指標(biāo)。由表2可知，模型對(duì)照組大鼠血清ALT、AST較空白對(duì)照組明顯升高(P<0.05)，人參低聚肽各組血清ALT、AST含量較模型對(duì)照組則顯著降低(P<0.05)，人參低聚肽各組與乳清蛋白組相比無明顯差異(P>0.05)。

與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組大鼠血清TC、HDL-C、LDL-C含量顯著降低(P<0.05)，血清TG含量明顯升高(P<0.05)；與模型對(duì)照組相比，人參低聚肽各組大鼠血清TC、TG、HDL-C和LDL-C含量與模型對(duì)照組均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；與乳清蛋白組相比，人參低聚肽各組TG含量顯著降低(P<0.05)，其余指標(biāo)與乳清蛋白組相比無明顯差異(P>0.05)。

2.3 人參低聚肽對(duì)SD大鼠肝組織乙醇代謝酶的影響

如附圖所示，與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組大鼠肝臟ADH含量明顯降低，人參低聚肽組除GOP1組外，其他3組大鼠ADH含量均較空白對(duì)照組高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型對(duì)照組相比，人參低聚肽各組ADH含量平均值均高于模型對(duì)照組，其中GOP2、GOP3和GOP4組與模型對(duì)照組相比，差異具有顯著性(P<0.05)；與乳清蛋白對(duì)照組相比，除GOP1組ADH含量降低外，其他3組ADH含量均明顯升高(P<0.05)。在人參低聚肽各劑量組，GOP1、GOP2、GOP3組隨著劑量的增加，大鼠ADH含量也明顯增加，在GOP3組(劑量為0.25g/kgBW時(shí))達(dá)到最高值，GOP4組ADH含量較GOP3組降低，但仍高于GOP1和GOP2組。

表2 人參低聚肽對(duì)SD大鼠血清生化指標(biāo)的影響

注：a與空白對(duì)照組相比，P<0.05；a*與空白對(duì)照組相比，P<0.001；b與模型對(duì)照組相比，P<0.05；b*與模型對(duì)照組相比，P<0.001；c與乳清蛋白組相比，P<0.05；c*與乳清蛋白組相比，P<0.001

附圖 人參低聚肽對(duì)SD大鼠肝臟ADH含量的影響注：a與空白對(duì)照組相比，P<0.05；a*與空白對(duì)照組相比，P<0.001；b與模型對(duì)照組相比，P<0.05；b*與模型對(duì)照組相比，P<0.001；c與乳清蛋白對(duì)照組相比，P<0.05；c*與乳清蛋白對(duì)照組相比，P<0.001

2.4 人參低聚肽對(duì)SD大鼠血清炎癥因子水平的影響

SD大鼠血清中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平如表3所示，與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著升高(P<0.001)，人參低聚肽各組除血清TNF-α水平較空白對(duì)照組高外，血清IL-1β和IL-6水平均低于空白對(duì)照組，差異具有顯著性(P<0.001)；與模型對(duì)照組和乳清蛋白對(duì)照組相比，人參低聚肽4個(gè)干預(yù)組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平均明顯降低(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)是目前研究急性酒精中毒最常用的方法，但尚無統(tǒng)一的動(dòng)物醉酒模型。結(jié)合國(guó)內(nèi)外以往報(bào)道，應(yīng)保證在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物可以承受的范圍內(nèi)，盡量加大灌胃酒精劑量，以觀察動(dòng)物急性酒精中毒的表現(xiàn)。本研究在總結(jié)以往研究經(jīng)驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過預(yù)實(shí)驗(yàn)的觀察探討，實(shí)驗(yàn)時(shí)按照50%乙醇17.5mL/kg BW(7g/kg BW)的劑量灌胃，造成SD大鼠急性酒精中毒模型。單純的蛋白質(zhì)攝入增加可能會(huì)對(duì)脂代謝指標(biāo)有一定的影響，因此本研究設(shè)置了乳清蛋白組作為對(duì)照來排除因單純提高蛋白質(zhì)的攝入量而引起的假陽性結(jié)果。乳清蛋白在消化過程中可產(chǎn)生多種生物活性多肽，研究證實(shí)其具有提高免疫力、抗疲勞、抗氧化、降血脂等多種功效[13-14]。

表3 人參低聚肽對(duì)SD大鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6含量的影響

注：a與空白對(duì)照組相比，P<0.05；a*與空白對(duì)照組相比，P<0.001；b與模型對(duì)照組相比，P<0.05；b*與模型對(duì)照組相比，P<0.001；c與乳清蛋白組相比，P<0.05；c*與乳清蛋白組相比，P<0.001

急性酒精中毒分為興奮期、共濟(jì)失調(diào)期和昏睡期三個(gè)階段，其中昏睡期最容易發(fā)生危險(xiǎn)，也是最能檢驗(yàn)解酒藥物是否有效的時(shí)期。翻正反射消失表明大鼠開始進(jìn)入昏睡期，因此國(guó)內(nèi)外研究均把翻正反射消失作為評(píng)價(jià)醉酒的首要方法[15-16]。在本研究中，給予動(dòng)物酒精灌胃后，模型對(duì)照組有70%的動(dòng)物都陷入了昏睡期，人參低聚肽干預(yù)后組陷入昏睡期的老鼠明顯減少，GOP4組僅有1只陷入昏睡期，且較模型對(duì)照組明顯延遲了醉酒時(shí)間，提前了醒酒時(shí)間，表明長(zhǎng)期服用吉林人參低聚肽能減少醉酒的機(jī)率，縮短醉酒時(shí)間。

當(dāng)肝細(xì)胞受損時(shí)，血清中ALT和AST含量將明顯升高[17]。由結(jié)果可知，與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組大鼠血清ALT、AST水平顯著升高(P<0.05)，說明模型對(duì)照組出現(xiàn)了急性肝損傷；而GOP干預(yù)能夠顯著降低大鼠血清 ALT、AST水平((P<0.05或P<0.01)，說明人參低聚肽對(duì)酒精誘導(dǎo)的大鼠急性肝損傷有保護(hù)作用。酒精性肝病患者中脂類代謝異常十分常見，大量乙醇在體內(nèi)的脫氫氧化會(huì)導(dǎo)致三羧酸循環(huán)障礙和脂肪酸氧化減弱，并降低肝臟運(yùn)出脂肪的能力，從而影響脂肪代謝，致使脂肪在肝細(xì)胞內(nèi)沉積[4，18-19]。本研究中模型對(duì)照組大鼠血清TG含量較空白對(duì)照組顯著升高(P<0.05)，說明酒精攝入造成了大鼠甘油三酯水平的增高，但人參低聚肽各組大鼠血清TC、TG、HDL-C和LDL-C含量與模型對(duì)照組相比均無明顯變化(P>0.05)，因此尚不能認(rèn)為人參低聚肽可以有效地預(yù)防酒精引起的體內(nèi)血脂水平的升高，還需進(jìn)一步研究證實(shí)。

機(jī)體攝入的酒精90%在肝臟代謝，首先由肝細(xì)胞內(nèi)的乙醇脫氫酶(ADH)氧化為乙醛，再由乙醛氧化為乙酸，乙酸進(jìn)一步分解為水和二氧化碳排出體外。乙醛不但可直接損失肝細(xì)胞、抑制三羧酸循環(huán)、引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，還可抑制細(xì)胞的分化及損傷組織的再生與修復(fù)，促進(jìn)肝纖維化的形成[4，20]。本研究結(jié)果表明，人參低聚肽干預(yù)組ADH活性顯著高于模型對(duì)照組(P<0.05)，GOP2、GOP3和GOP4 三組大鼠ADH含量均高于空白對(duì)照組和乳清蛋白對(duì)照組(P<0.05)，此外，在4個(gè)人參低聚肽劑量組中，GOP3組(即0.25g/kg BW劑量組)ADH含量明顯干預(yù)其他3組。這表明人參低聚肽干預(yù)加快了乙醇的氧化，從而減輕了酒精代謝產(chǎn)物乙醛對(duì)機(jī)體的急性損害，且0.25g/kgBW劑量的人參低聚肽可能更有利于提高肝臟乙醇代謝酶的活性，但還需進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證。

炎癥反應(yīng)是酒精性肝炎的主要特征之一。酒精攝入可引起調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)相關(guān)的許多基因表達(dá)，導(dǎo)致炎性因子合成、釋放，使炎癥細(xì)胞對(duì)炎癥刺激過度反應(yīng)產(chǎn)生大量的炎癥介質(zhì)如TNF-α、IL-1β和IL-6等，其中TNF-α是ALD發(fā)生發(fā)展過程中重要的促炎因子，與炎癥反應(yīng)、脂質(zhì)代謝和細(xì)胞死亡都密切相關(guān)[21-23]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，人參低聚肽能夠明顯降低血清中TNF-α、IL-1β、IL-6的水平(P<0.05)，因此可以推斷人參低聚肽可在一定程度上改善酒精引起的血清炎癥反應(yīng)。

綜上所述，本研究通過建立大鼠急性酒精中毒模型，設(shè)立空白對(duì)照組、模型對(duì)照組和乳清蛋白組作為對(duì)照組，探討人參低聚肽對(duì)急性酒精中毒的保護(hù)作用及其可能機(jī)制。研究表明，人參低聚肽可有效降低醉酒大鼠翻正反射消失的比率，降低酒精引起的血清ALT、AST的升高，提高肝臟乙醇脫氫酶活性，抑制酒精導(dǎo)致的血清炎癥因子水平的升高，從而起到保護(hù)肝細(xì)胞與改善肝功能的作用，這對(duì)早期防治酒精性肝病和保護(hù)機(jī)體免受急性酒精中毒的傷害有重要意義。

但是仍有許多問題有待進(jìn)一步探討。其一，動(dòng)物模型目前并沒有統(tǒng)一定論，干預(yù)方式各不相同，最終模型可能涉及酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、肝硬化等，動(dòng)物模型并不穩(wěn)定，因此需要尋找適宜的動(dòng)物模型來研究功能性食品對(duì)急性酒精中毒的防治作用有著重要的意義；其二，目前關(guān)于人參低聚肽的研究相對(duì)較少，本研究表明，人參低聚肽具有提高性功能、抗疲勞、增強(qiáng)機(jī)體免疫力[7]等作用。根據(jù)目前的研究結(jié)果，筆者會(huì)繼續(xù)優(yōu)化劑量設(shè)置，進(jìn)行更深入的研究，如在體外實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步驗(yàn)證人參低聚肽對(duì)酒精性肝損傷的保護(hù)作用機(jī)制。此外，也需要人群研究進(jìn)一步證實(shí)其對(duì)酒精性肝損傷的改善效果及適宜劑量?！?/p>

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