陳俞　范宇琴

[摘要]目的分析耳聾高危人群檢測(cè)中耳聾基因芯片的臨床應(yīng)用價(jià)值。方法方便選擇該院2015年8月-2016年12月接收的耳聾患者120例，均應(yīng)用耳聾基因芯片實(shí)施突變檢測(cè)，觀察檢測(cè)結(jié)果。結(jié)果120例患者中，63例檢出基因突變，檢出率39.1%；63例檢出基因突變患者中，重度耳聾38例，極重度耳聾25例；57例未檢出基因突變患者中，重度耳聾50例，極重度耳聾7例。結(jié)論耳聾高危人群檢測(cè)中，耳聾基因芯片的應(yīng)用可提升檢出率，降低耳聾發(fā)生率。

[關(guān)鍵詞]耳聾基因芯片；耳聾高危人群；檢測(cè)；臨床意義

[中圖分類(lèi)號(hào)]R764 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1674-0742（2017）10（a）-0055-03

耳聾在臨床中比較常見(jiàn)，發(fā)病后不僅交流受到影響，而且生活質(zhì)量會(huì)嚴(yán)重降低。在耳聾患者中，0.1%～0.3%為新生兒。從致病原因看，由遺傳因素導(dǎo)致的耳聾患者占據(jù)總數(shù)的50%以上。因耳聾存在高度的基因及位點(diǎn)遺傳異質(zhì)性，且相關(guān)于多個(gè)基因的突變，因而如采取傳統(tǒng)檢測(cè)4方法，僅能將同一基因同一位點(diǎn)檢測(cè)出來(lái)，達(dá)不到篩查診斷要求。研究指出，耳聾高危人群檢測(cè)中，耳聾基因芯片技術(shù)具有較高的應(yīng)用價(jià)值，可與篩查診斷要求相符合。因此，該院以2015年8月-2016年12月接收的漢族耳聾患者120例為研究對(duì)象，探討耳聾基因芯片的應(yīng)用價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

方便選擇新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院接收的漢族耳聾患者120例，男68例，女52例；年齡3個(gè)月～59歲，平均（32.7±6.4）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：均符合耳聾診斷標(biāo)準(zhǔn)，患者及（或）家屬均對(duì)該研究知情，且自愿參與研究。

1.2方法

研究人員調(diào)查記錄患者發(fā)病年齡、家族史、疾病史等；所有患者均接受耳聾基因芯片（北京博奧生物有限公司）檢測(cè)，檢測(cè)步驟如下。

1.2.1標(biāo)本采集與處理于患者肘靜脈處采集血液標(biāo)本5mL，置入采血管（EDTANa2抗凝）中，全血基因組DNA提取時(shí)，利用全血核酸提取試劑盒（天根生化公司），完成后在20℃冰箱中保存。

1.2.2PCR反應(yīng)引物共8組，針對(duì)8個(gè)突變位點(diǎn)[GJB2基因（突變位點(diǎn)：35delG、176dell6/235delc、299-300de1AT），SLC26A4基因（突變位點(diǎn)：2168A>G、IVS7-2A>G），線粒體12rRNA基因（突變位點(diǎn)：1494C>T、1555A>G）]，將其分為兩個(gè)反應(yīng)體系，分別標(biāo)記為A、B，實(shí)施多重PCR，A、B反應(yīng)體系各20μL，將100～200ng/μL濃度的待測(cè)全血基因組DNA加入其中，擴(kuò)增引物混合物12.5μL，擴(kuò)增試劑混合物4.5μL。PCR反應(yīng)時(shí)，程序如下：37℃下，反應(yīng)10min；溫度提高至95℃，反應(yīng)15min；溫度再提高至96℃，進(jìn)行1min預(yù)變性；之后溫度降低至94℃，反應(yīng)30s；繼續(xù)降低至55℃，反應(yīng)30s；提高到72℃，反應(yīng)45s，循環(huán)共進(jìn)行32個(gè)；降低至70℃，反應(yīng)45s，最終降低至60℃，反應(yīng)10min。反應(yīng)期間，溫度由94℃降低至55℃時(shí)，降低速度控制在0.4℃/s，而由55℃提高至70℃時(shí)，提升速度控制在0.2℃/s。

1.2.3雜交 95℃條件下，于金屬浴中放置PCR產(chǎn)物，給予10min變性，完成后，迅速向冰水中放置PCR產(chǎn)物，冰浴3min。從A、B反應(yīng)體系管中將相同標(biāo)本取出，量均為25μL，向試管（內(nèi)置雜交緩沖液10μL）中混入，混合均勻會(huì)，于芯片微陣列區(qū)域中加入，用蓋玻片封閉雜交盒后，在預(yù)熱雜交箱（50℃）中放置，進(jìn)行1h保溫。

1.2.4洗片 完成雜交后，取出芯片，在洗滌液I（42℃）中放置，之后通過(guò)搖床，進(jìn)行2min洗滌，隨后取出，并于洗滌液Ⅱ（42℃）中快速放人，再經(jīng)搖床給予2min洗滌。結(jié)束后，在玻片架上放置芯片，利用離心機(jī)甩干液體，離心速度1200r/min，時(shí)間2min。

1.2.5芯片掃描 芯片掃描利用掃描儀進(jìn)行，掃描儀采用晶芯LuxScanTM 10K/B微陣列芯片.激光掃描強(qiáng)度設(shè)置為90，激光波長(zhǎng)選擇532nm。

1.3觀察指標(biāo)

觀察所有患者檢測(cè)結(jié)果，同位點(diǎn)中，探針W信號(hào)表現(xiàn)為陽(yáng)性時(shí)，位點(diǎn)屬于野生型；探針M信號(hào)表現(xiàn)為陽(yáng)性時(shí)，位點(diǎn)屬于純合突變型；探針W信號(hào)與探針M信號(hào)均表現(xiàn)為陽(yáng)性時(shí)，位點(diǎn)屬于雜合突變型。

2結(jié)果

120名患者中，63例檢出基因突變，檢出率39.1%，其中，48例GJB2基因突變攜帶者，15例SLC26A4基因突變攜帶者。48例GJB2基因突變攜帶者中，235delc純合突變28例，235delC雜合突變16例，235delC/299-300delAT復(fù)合突變4例；15例SLC26A4基因突變攜帶者中，IVS7-2A>G純合突變8例，IVS7-2A>G雜合突變7例。28例235delC純合突變患者中，23例患者父母均抽血檢測(cè)，3例患者僅有母親抽血檢測(cè)，2例患者父母均未抽血檢測(cè)，結(jié)果顯示：23例患者父母中，均為235delC雜合突變；3例患者母親均為235delc雜合突變。16例235delC雜合突變患者中，10例患者父母中，一方為235delC雜合突變，另一方為野生型；3例患者父母中，一方為235delC雜合突變，一方為235delC純合突變；3例患者母親檢測(cè)顯示為235delC雜合突變，父親未接受檢測(cè)。4例235delC/299-300delAT復(fù)合突變患者中，父母均接受檢測(cè)，結(jié)果顯示，235delC雜合突變出現(xiàn)在父親，299-300delAT雜合突變出現(xiàn)在母親。8例IVS7-2A>G純合突變患者中，均為親屬關(guān)系，父母檢測(cè)結(jié)果顯示，均攜帶IVS7-2A>G雜合突變。7例IVS7-2A>G雜合突變患者中，父母檢測(cè)結(jié)果顯示，一方攜帶IVS7-2A>G雜合突變，一方表現(xiàn)為野生型。聽(tīng)力檢測(cè)結(jié)果顯示：63例檢出基因突變患者中，重度耳聾38例，極重度耳聾25例；57例未檢出基因突變患者中，重度耳聾50例，極重度耳聾7例。

3討論

耳聾是一種最常見(jiàn)的疾病，依據(jù)具體的表型特點(diǎn)，耳聾可分為兩種，一種為綜合征性耳聾（SHL），另一種為非綜合征性耳聾（NSHL）；根據(jù)遺傳方式，耳聾可分為五種，分別為常染色體顯性遺傳（AD）耳聾、常染色體隱性遺傳（AR）耳聾、X連鎖遺傳耳聾、Y連鎖遺傳耳聾、線粒體遺傳耳聾，其中最為多見(jiàn)的即為AR耳聾。隨著不斷的實(shí)施與完成人類(lèi)基因組計(jì)劃，耳聾遺傳學(xué)研究取得的進(jìn)步是非常大的，可定位克隆多數(shù)的耳聾相關(guān)基因，由此也稱(chēng)產(chǎn)生耳聾基因診斷。

對(duì)于遺傳性耳聾，患者種族不同時(shí)，會(huì)具有不同的致病基因，即使基因相同，突變位點(diǎn)也存在差異，甚至同一種族中，致病基因或同一基因突變位點(diǎn)也存在地區(qū)差異，種族特異性非常強(qiáng)。在我國(guó)，占據(jù)五項(xiàng)殘疾首位的即為聽(tīng)力語(yǔ)言殘疾。據(jù)耳聾病分子流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果，耳聾患者中，GJB2基因突變攜帶者約占據(jù)38%，SLC26A4基因突變攜帶者約占據(jù)14.5%，線粒體DNAA1555G突變攜帶者約占據(jù)3.8%，線粒體DNA C1494T突變攜帶者約占據(jù)0.6%E3J。該研究中，GJB2基因突變攜帶者占總患者40.0%、SLC26A4基因突變攜帶者占總患者12.5%，與上述調(diào)查結(jié)果基本一致。由上述調(diào)查結(jié)果可知，我國(guó)耳聾患者常見(jiàn)的致病基因?yàn)镚JB2、SLC26A4及線粒體，前兩個(gè)基因?qū)儆贏R，第3個(gè)基因?qū)儆谀赶颠z傳。此外，SLC26A4基因突變也為耳聾患者中比較常見(jiàn)的突變情況，應(yīng)用耳聾基因芯片后，同樣可以一次性檢出。該研究中選取的161例耳聾患者中，利用耳聾基因芯片檢測(cè)中基因突變攜帶者63例，其中48例為GJB2基因突變攜帶者，15例為SLC26A4基因突變攜帶者，與流行學(xué)調(diào)查將結(jié)果存在一定的差異，考慮與樣本量數(shù)量少、地區(qū)不同等因素相關(guān)，還需要做出進(jìn)一步的深入研究。

我國(guó)每年約有400萬(wàn)人的藥物敏感性突變攜帶者，35萬(wàn)人左右的藥物性耳聾患者，線粒體DAN 12Sr-RNA為與其對(duì)應(yīng)的基因，可母系遺傳，即攜帶者如為母音，懷孕后生育的子女會(huì)耳聾，而父親攜帶時(shí)，則生育的子女不會(huì)耳聾。GJB2基因?qū)儆贏R，先天性重度以上感音神經(jīng)性耳聾為相關(guān)癥狀，患者同胞中，發(fā)病25%，通常隔代遺傳，可發(fā)生于男性，也可發(fā)生于女性，治療時(shí)采用人工耳蝸具有較好的效果。聾啞人因具有特殊的自身情況，配偶為正常人的幾率比較小，再加上聾啞人與聾啞人之間使用相同的語(yǔ)言溝通，存在基本相同的文化背景，因此婚配形式多為“聾一聾”方式，此種方式會(huì)極大的增加擁有相同基因突變位點(diǎn)的可能，從而提高后代耳聾的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。因此，對(duì)于先天或后天耳聾患者，或新生兒未通過(guò)聽(tīng)力篩查，或家屬攜帶耳聾基因時(shí)，均屬于高危人群，耳聾基因芯片檢查應(yīng)盡早的開(kāi)展，并根據(jù)檢測(cè)結(jié)果給予適當(dāng)?shù)母深A(yù)，促進(jìn)致殘率的降低，提高患者的生活質(zhì)量，并提升我國(guó)的人口素質(zhì)水平。

綜上所述，耳聾高危患者篩查與診斷中，耳聾基因芯片檢測(cè)具有十分重要的應(yīng)用價(jià)值，能夠更為準(zhǔn)確、快速的檢測(cè)出患者的基因突變情況，假陽(yáng)性率低，且操作簡(jiǎn)單，適合推廣于臨床當(dāng)中，降低耳聾發(fā)生率，尤其適合產(chǎn)前診斷中，減少新生兒耳聾的發(fā)生，提高人口出生素質(zhì)。

（收稿日期：2017-07-04）