王 曉,鄒立津,曾元臨 綜述,張友來 審校

(南昌大學第一附屬醫(yī)院燒傷中心，南昌 330006)

誘導性多能干細胞(induced pluripotent stem cells，iPS)是通過基因轉染技術將某些轉錄因子導入已分化體細胞，使已分化細胞“原始化”并具備干細胞特性。2006年日本京都大學首次成功創(chuàng)建iPS細胞[1]，該研究利用攜帶 Oct3/4、Sox2、C-Myc和Klf4轉錄因子的4種逆轉錄病毒載體感染成纖維細胞后經(jīng)篩選獲得iPS。2007年TAKAHASHI等[2]研究顯示，利用此技術同樣可以誘導人皮膚纖維母細胞成為幾乎與胚胎干細胞完全一樣的多能干細胞。與此同時，YU等[3]也報道了利用Oct3/4、Sox2、Nanog 和 Lin28的基因組合成功使人類新生兒成纖維細胞重編程為iPS細胞。隨后國內(nèi)外多家實驗室利用基因?qū)氲姆椒ㄍ瓿闪硕喾N類型成體細胞向iPS細胞的重編程。iPS細胞在細胞形態(tài)、生長特性、干細胞標志物表達、DNA甲基化方式、基因表達譜、染色質(zhì)狀態(tài)、形成嵌合體動物等方面與胚胎干(ES)細胞幾乎完全一致。iPS細胞具有多向分化潛能，在體內(nèi)可以分化為3個胚層來源的所有細胞，使其成為疾病治療種子細胞的良好選擇。經(jīng)特定條件誘導iPS細胞向上皮干細胞分化有望解決臨床皮膚缺損所面臨的皮源不足的問題。本文就iPS細胞向表皮細胞分化及其在皮損修復領域的研究做一綜述。

1 iPS細胞向表皮分化的誘導方法的研究

1.1細胞培養(yǎng)基 iPS細胞由體細胞經(jīng)導入外源基因重編程而來，與ESCs在功能和表型上相似，具有無限擴增和保持正常核型及生成3個胚層細胞的能力，在細胞治療中具有良好的應用前景。常規(guī)細胞培養(yǎng)中多依賴動物血清及滋養(yǎng)層細胞，限制了干細胞的大規(guī)模培養(yǎng)獲取，且血清中含有的多種成分對培養(yǎng)細胞的影響也難以控制，探索無血清培養(yǎng)體系勢在必行。李向東等[4]使用無血清培養(yǎng)基mTeSRTM1培養(yǎng)復蘇的ESCs，能夠在體外進行長期擴增,同時維持其未分化的干細胞潛能。目前iPS細胞培養(yǎng)基仍然沿用ESC等細胞培養(yǎng)基做為基礎，而適宜培養(yǎng)iPS細胞的特定培養(yǎng)基尚需要進一步探索研制。

1.2細胞分化影響因子

1.2.1傳統(tǒng)細胞分化影響因子 生長因子的種類及數(shù)量常影響干細胞分化效率。研究常用的有EGF、bFGF、TGF-β等，這些因子都可一定程度上促進iPS細胞分化。近年在iPS細胞向表皮干細胞分化的研究中，李勇鐵等[5]將iPS細胞置于人羊膜上培養(yǎng)后部分細胞出現(xiàn)整合素β1和CK19的表達，表明人iPS細胞可在羊膜誘導下定向分化為表皮樣干細胞，但其機制尚不清楚。ITOH等[6]通過調(diào)整培養(yǎng)基成分，在誘導iPS細胞分化為擬胚體后，經(jīng)調(diào)整后的培養(yǎng)基(去除bFGF，添加抗壞血酸、TGF-β2及ITS-A)培養(yǎng)10 d后得到成纖維細胞及表皮樣干細胞。有研究表明CDX2和LGR5的表達經(jīng)FGF2作用明顯上調(diào)，當細胞在含EGF和低濃度的FBS培養(yǎng)基中培養(yǎng),腸上皮細胞的特定標記物的mRNA均得以表達,同時也檢測到蔗糖酶異麥芽糖酶蛋白的表達及β-Ala-Lys-Amca的吸收[7]，這為iPS細胞向類腸上皮細胞分化提供一簡單直接的方法。有研究通過細胞中脂質(zhì)沉積以及C3補體蛋白的高表達從而證實iPS細胞具有分化為Ⅱ型肺泡上皮細胞的潛能，他們在誘導上皮間質(zhì)轉化時發(fā)現(xiàn)細胞暴露在博來霉素或TGFB1/EGF混合物中時會經(jīng)歷表型改變包括獲得間質(zhì)/成纖維細胞形態(tài)、間充質(zhì)標記物上調(diào)及表面蛋白和鈣黏蛋白的下調(diào)[8]。KODAMA等[9]也證實了促分裂原活化蛋白激酶激酶(MEK)、DNA甲基化酶(DNMT)及TGF-β抑制劑可促進iPS細胞向腸上皮分化。由此可以看出，iPS細胞分化中各種因子均會影響分化過程及效率，而在特定分化中何種因子起作用及其權重至今仍是未知。

1.2.2維甲酸與骨形成蛋白4 維甲酸(RA)是與胚胎外胚層發(fā)育相關的誘導因素，近年來發(fā)現(xiàn)在皮膚組織中大量表達一種RA特定受體，表明RA也可能參與皮膚的分化過程。骨形成蛋白4(BMP4)和RA均可促進外胚層向神經(jīng)分化，并已有研究證實了BMP4在皮膚修復中具有促愈合作用。近年的此類研究中SALIMI等[10]對比3個轉化誘導媒介(bFGF+EGF、RA和毛猴素+IBMX)促進iPS細胞神經(jīng)分化的潛力，經(jīng)免疫熒光染色及定量實時PCR(qPCR)分析表明,毛猴素+IBMX處理的已分化hiPS細胞的神經(jīng)基因的表達明顯高于未分化細胞及其他處理組，證明經(jīng)毛猴素+IBMX處理的hiPS細胞轉化為神經(jīng)系細胞的效率更高。另外在眼科研究中，LI等[11]通過4種特定因子(Noggin、BMP4/7、BFGF、EGF)的組合,分3步影響iPS細胞分化，高效地生成晶狀體上皮細胞LECs，從而為解決LECs傳代不能保持原代特性的問題提供新途徑。雖然較多研究證實RA和BMP4可促進iPS細胞的分化，但其具體機制尚需進一步研究。

1.2.3其他影響因素 很多學者在分化體系中添加其他特殊分子或改變細胞培養(yǎng)環(huán)境，明顯改變了干細胞的分化效率及分化結果。KUSUMA等[12]發(fā)現(xiàn)低氧分壓可促進iPS細胞分化為血管內(nèi)皮細胞：在5%O2無飼養(yǎng)層二維分化系統(tǒng)中，iPS細胞分化的內(nèi)皮細胞群中帶有內(nèi)皮細胞鈣粘蛋白和CD31的細胞數(shù)增加、動脈內(nèi)皮細胞標記物及條索狀結構形成，提示氧分壓在iPS細胞分化為內(nèi)皮細胞過程中的重要性。OFFEN等[13]利用小鼠iPS細胞來源的泛神經(jīng)祖細胞研究神經(jīng)營養(yǎng)生長因子促紅細胞生成素(EPO)對細胞的生存、增殖和神經(jīng)分化的影響。在增殖培養(yǎng)中EPO(0.1～3.0 U/mL)輕度改善細胞生存但減少細胞增殖和神經(jīng)球的形成，在分化培養(yǎng)中通過β-Ⅲ-微管蛋白陽性神經(jīng)元數(shù)量的增加評估EPO促進神經(jīng)分化，證實EPO抑制iPS細胞來源的神經(jīng)祖細胞的自我更新，促進其向神經(jīng)分化。

2 iPS細胞向表皮分化的基因研究

iPS細胞向表皮分化的實質(zhì)是誘導多能性細胞內(nèi)表皮基因的表達。有文獻[14]查詢了聯(lián)合微陣列數(shù)據(jù)庫487種生長因子及受體的表達，表明hES/iPS細胞表現(xiàn)出晝夜節(jié)律性的抑制、早期分化標記物的非表達及標準多能性基因的穩(wěn)定表達，為iPS細胞的多能性提供了理論支持。BORNACHEAD等[15]在研究小鼠表皮腫瘤細胞時發(fā)現(xiàn)，TP63基因編碼兩個主要類型(TAp63和δNp63)之一的δNp63可促進iPS細胞重編輯相關因子的表達,表明它具有可以調(diào)節(jié)小鼠表皮腫瘤細胞的特殊干細胞特征。CHEN等[16]在研究iPS細胞向血管內(nèi)皮細胞分化時發(fā)現(xiàn)，miR199b在內(nèi)皮細胞分化中表達呈漸進性增加，以JAG1作為靶點，經(jīng)過STAT3途徑引起VEGF的轉錄激活和分泌。利用shRNA-mediated敲除JAG1則其在內(nèi)皮細胞分化中的調(diào)控效應消失，表明miR199b在iPS細胞分化為血管細胞過程中，經(jīng)過調(diào)節(jié)臨界的血管生成信號的應答，扮演著一個表型轉換調(diào)節(jié)器的角色。

多能干細胞由已分化細胞重編程而來，其表觀遺傳背景可以影響其轉錄和功能性行為，PETROVA等[17]比較分析iPS細胞系iKCL004和iKCL011，培養(yǎng)后miRNA數(shù)組大約7%的CpG位點出現(xiàn)不同的甲基化，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)在細胞系iKCL004克隆中,與皮膚屏障作用成熟相關的毛透明蛋白(TCHH)保留了一種原始體細胞DNA甲基化特點,而iKCL011的TCHH甲基化特點與人類胚胎干細胞系KCL034相匹配。SHAO等[18]經(jīng)過比較初始MSC、ESC-MSC、iPS-MSC的DNA甲基化修飾得出，iPS-MSC在DNA甲基化修飾中保留了供者來源的差異性，即供體表觀遺傳差異的組織記憶，iPS-MSC存在一些CpG位點顯示顯著差異，證明iPS-MSC克隆了較少的個體變化但他們保持供體來源的表觀遺傳差異。

3 病體來源iPS細胞上皮分化及在疾病治療中的研究

iPS細胞技術的最終目的是應用于臨床疾病治療、疾病模型制作及藥物篩選等方面。在未來臨床應用中，iPS細胞的來源也必然是取自于患者自體細胞，如成纖維細胞、外周血細胞等較為容易獲取的細胞。核重編程使患者特異性iPS細胞成為可能，因此誘導病體來源iPS細胞分化為上皮細胞的研究尤為重要。目前病體來源iPS細胞上皮分化仍處于實驗階段，此技術應用于臨床還為時過早，但分化獲得的上皮細胞為表皮修復提供了良好的前景。

3.1糖尿病 糖尿病患者常發(fā)皮膚感染導致皮膚受損，且創(chuàng)面恢復困難，尤以糖尿病足多見。CHAN等[19]將1型糖尿病患者來源的iPS細胞誘導形成的內(nèi)皮細胞系，具有典型的內(nèi)皮細胞標記物，帶有結合凝集素、乙酰化低密度脂蛋白攝取、基底膜管腔形成、對TNF-α應答的能力，在工程透明質(zhì)酸或體內(nèi)缺氧條件下，可經(jīng)受形態(tài)變化形成3D結構，且能合并至轉基因脈管系統(tǒng)中。ORLOVA等[20]也得出了相同結果，證實體細胞來源iPS細胞在體內(nèi)外能分化成所有類型內(nèi)皮細胞和周皮細胞且擁有其全部功能。有研究[21]以2型糖尿病患者的表皮細胞為來源獲得多能干細胞，誘導的iPS細胞獲得了以延長端粒和抑制衰老相關基因p15(INK4b)/ p16(INK4a)基因表達以及氧化應激信號為特征的重生的狀態(tài)，為創(chuàng)面修復提供了良好的種子細胞，同時以遺傳特異性因子逐步引導(包括IV和GLP-1)，再分化iPS細胞成為可生產(chǎn)胰島素的細胞子代，為糖尿病病因治療提供可能。

3.2斑禿 斑禿被認為是一種具有遺傳性質(zhì)及環(huán)境激發(fā)因素的自身免疫性疾病，是由炎性細胞介導的器官特異性疾病，與免疫失調(diào)相關[22]，毛囊再生是斑禿治療中需解決的首要問題。2013年VERAITCH等[23]利用人類iPS細胞在實驗鼠身上成功再生了部分毛囊，此外實驗中還指出，在201B7 iPSc系、WD39 iPSc系和WDT2 iPSc系中，201B7 iPSc系能使毛囊角質(zhì)形成細胞的表面標記(角蛋白18、角蛋白14 及人腫瘤蛋白TP63等)的表達明顯高于其他兩系。有學者利用H9系人類胚胎干細胞/iPS細胞生成神經(jīng)嵴細胞，然后將其誘導為可刺激毛發(fā)生成的類毛乳頭細胞(類毛乳頭細胞可表達有成熟毛乳頭細胞的特征性標志)，研究人員將這些細胞移植到免疫缺陷的裸鼠中成功誘導了毛囊形成[24]，證實人類胚胎干細胞誘導形成的真皮乳頭與人類iPS細胞誘導形成的真皮乳頭兩者誘導毛囊形成的能力相當。2014年，YANG等[25]先將Oct3/4、Sox-2和Klf4轉入人類皮膚成纖維細胞中獲得iPS細胞，然后將其誘導分化為毛囊隆突部上皮干細胞，繼而將誘導分化的上皮干細胞植入免疫功能缺陷的小鼠體內(nèi)再生出功能性的人類表皮和毛囊，甚至生成了結構可識別的毛干。

3.3其他 在其他病體研究中，ITOH等[26]成功將大皰性表皮松解癥患者來源的iPS細胞誘導分化為角質(zhì)形成細胞并制備了3D皮膚結構，證實了所獲得iPS細胞具有高度的多能性并能應用于皮損修復?？谇话┲委煶е轮車M織大量的永久性的丟失，PATEL等[27]探討了重編程技術在口腔癌后期康復中的應用，他們以口腔癌患者口腔上皮細胞為來源，誘導其重編程為iPS細胞，為口腔鱗癌患者組織缺損的再生提供了希望。KAJIWARA等[28]采用來自于唐氏綜合征和雙胎輸血綜合征個體的羊水細胞重編程為iPS細胞并誘導分化為表皮細胞，聯(lián)合人的I型膠原及成纖維細胞建立三維皮膚，于孕期作用于小鼠模型，可在孕期成功覆蓋胎兒脊膜膨出癥(MMC)缺損部位，為產(chǎn)前治療MMC提供了一種可能。

4 展 望

利用iPS細胞技術獲取表皮干細胞并應用于皮損修復，首先要解決iPS細胞的來源問題。iPS細胞為再生醫(yī)學提供無限的細胞來源，雖然關于iPS細胞技術的研究眾多，研究者們通過采取多種措施影響誘導過程，但其誘導效率仍然很低，且向分化體系中加入各類因子均會不同程度的影響分化結果，目前各分化體系中影響因子的種類仍然在繼續(xù)探索中。其次，iPS細胞向表皮細胞分化的效率是制約其應用于皮損修復的一大阻礙。SAKURAI等[29]將小鼠iPS細胞經(jīng)RA和BMP4預培養(yǎng)后鋪于Ⅳ型膠原上，誘導分化成表達p63和K14的上皮細胞，然而K14陽性細胞不到60%，且并未在體內(nèi)外證實這種細胞能否形成上皮組織。有研究將此類細胞與真皮成纖維細胞混合植入裸鼠皮下形成含包囊及皮脂腺的皮膚組織[30]，但此種誘導需形成胚胎小體，此過程中會產(chǎn)生大量其他類型的細胞，必須在分化過程中進行細胞的提純和再次接種，很難產(chǎn)生臨床所需的大量皮膚干細胞。另外，iPS細胞經(jīng)病毒轉染外源基因?qū)?，導入基因多為癌相關基因，理論上獲得的細胞仍存在癌性和干性的爭議。病體來源細胞的細胞質(zhì)內(nèi)核酸在分化過程中積累的變異是否會影響形成的iPS細胞的細胞核內(nèi)外的核酸，并進而影響其分化為表皮干細胞的效率及表觀遺傳特性，此方面的研究尚未報道，因此如何去除供體細胞基因組外的影響因素將是后續(xù)iPS細胞技術研究的新方向。

有學者使用單個轉錄因子OCT4暫時性轉染人皮膚角化細胞，經(jīng)功能鑒定證實新分化的間充質(zhì)細胞膠原凝膠的收縮和真正的肌成纖維細胞一樣有效，因此獲得特定的細胞可能不需要完全重新編程體細胞成為iPS細胞，OCT4的瞬時表達足以改變?nèi)私琴|(zhì)細胞的分化途徑[32]。日本厚生勞動省2013年正式批準利用iPS細胞開展視網(wǎng)膜再生研究，在全球范圍內(nèi)首獲政府批準并用于臨床試驗。近日來日本數(shù)家制藥及化工企業(yè)首次利用iPS細胞量產(chǎn)血小板，這是iPS細胞走向臨床的重要一步。iPS細胞技術將不止局限在簡單分化，誘導獲得上皮細胞并形成皮片組織是否能夠具有正常皮膚的功能將是急需解決的一大問題，通過誘導在不久的將來或許可以看到iPS細胞來源的含血管的多層皮片組織產(chǎn)品，以用于大面積深度皮瓣缺損的修復。自體和同種異體干細胞包括ESCs和iPS細胞組織工程再生醫(yī)學具有良好前景,預計不久越來越多的產(chǎn)品將出現(xiàn)在市場上。