阮琳琳,林 輝,馬軍偉,孫萬春,俞巧鋼,符建榮

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土壤中單一及復(fù)合抗生素的降解及微生物響應(yīng)

阮琳琳1,2,林 輝2*,馬軍偉2,孫萬春2,俞巧鋼2,符建榮2*

(1.浙江師范大學(xué)生命與化學(xué)科學(xué)學(xué)院, 浙江 金華 321004；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境資源與土壤肥料研究所, 浙江 杭州 310021)

基于LC-MS/MS、MicroRESPTM等技術(shù),對比了磺胺二甲嘧啶(SM2)和強力霉素(DOX)在單一和共存條件下,在青紫泥和小粉土中的短期降解及土壤微生物代謝特征.結(jié)果表明,單一條件下,小粉土中SM2和DOX的3d和7d降解率總體高于青紫泥,SM2和DOX共存條件下可對土壤中二者的短期降解產(chǎn)生一定抑制,這種抑制作用在小粉土中更為明顯.抗生素對土壤微生物代謝的影響與其賦存時間及土壤類型有關(guān).在供試濃度10~20mg/kg 下,SM2和DOX在單一和復(fù)合條件下總體是促進土壤微生物代謝,但影響隨賦存時間增加而減弱.青紫泥中,SM2和DOX共存下的土壤微生物代謝多樣性高于二者單一存在,且青紫泥中DOX濃度與土壤代謝活性和微生物群落代謝多樣性呈顯著正相關(guān),而小粉土中無類似的現(xiàn)象,但SM2與DOX復(fù)合污染對土壤微生物代謝的影響總體源于DOX的作用.

青紫泥；小粉土；磺胺二甲嘧啶；強力霉素；降解；土壤微生物；MicroRESPTM

我國一些農(nóng)田土壤遭受抗生素污染已是一個不爭的事實.在我國珠江三角洲地區(qū)、天津等地的蔬菜基地土壤中均檢出了高濃度的抗生素,其中同時檢出四環(huán)素類、氟喹諾酮類和磺胺類抗生素的現(xiàn)象十分普遍[1-3].畜禽養(yǎng)殖廢棄物農(nóng)用是抗生素進入土壤的重要途徑.通過對浙江省及其周邊地區(qū)畜禽糞便源有機肥料中殘留抗生素的研究發(fā)現(xiàn),受檢的300多個樣品中,45.2%檢出氟喹諾酮類抗生素,30.1%檢出磺胺類抗生素,25.1%檢出四環(huán)素類抗生素,其中部分樣品強力霉素殘留濃度在70mg/kg以上[4].大多數(shù)抗生素具有較高的生物活性,其必然存在一定的潛在生態(tài)環(huán)境風險.因此,關(guān)注畜禽糞便施用土壤中的抗生素污染問題必不可少.

抗生素進入土壤后會發(fā)生光解、水解、生物降解等一系列降解轉(zhuǎn)化作用.土壤類型會影響抗生素的降解.部分研究指出[5],土壤有機質(zhì)、氧化鐵、陽離子交換總量、黏粒含量越高,抗生素在土壤中的降解速率越小,在土壤中就越穩(wěn)定.同時,土壤微生物在抗生素的降解轉(zhuǎn)化中也扮演重要角色.研究[6]發(fā)現(xiàn),磺胺二甲嘧啶在未滅菌土中的半衰期僅是滅菌土中的一半.土壤濕度、pH值等也是影響抗生素在土壤中降解的重要因素[7],其通過改變土壤孔隙度、氧化還原電位、抗生素溶解性以及抗生素和土壤的吸附作用等對抗生素降解產(chǎn)生影響.總體上看,國內(nèi)外針對抗生素在土壤中的遷移轉(zhuǎn)化研究較多,但多針對單一抗生素.事實上,多種抗生素共存下的土壤微生態(tài)效應(yīng)有異于單一抗生素污染[8-9],這兩種不同條件下抗生素的遷移轉(zhuǎn)化行為也很可能完全不同.因此,單一和復(fù)合條件下各類抗生素在土壤中的遷移轉(zhuǎn)化行為和土壤微生物效應(yīng)差異值得探討,其對于評估實際生產(chǎn)中有機肥料殘留抗生素的生態(tài)風險具有很強的指導(dǎo)意義.

基于以上現(xiàn)狀及問題,本文以在浙江省有機肥料中檢出頻率和檢出濃度均較高的磺胺二甲嘧啶和強力霉素[4]為研究對象,結(jié)合LC-MS/ MS、MicroRESPTM等技術(shù),利用室內(nèi)土壤培養(yǎng)試驗,分析伴隨有機肥料施用進入兩種不同類型土壤中的抗生素的遷移轉(zhuǎn)化行為和土壤微生物代謝響應(yīng),以期為評價有機肥料中殘留抗生素的土壤生態(tài)風險和環(huán)境歸趨提供參考.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試有機肥料取自浙江常山堆肥廠,以豬糞為主要原料,經(jīng)過堆肥發(fā)酵、后熟和烘干等流程,其基本理化性質(zhì)為:含水率13.52%,pH =8.48,電導(dǎo)率(EC)5800μs/cm,總氮3.88%,有機質(zhì)61.80%,全磷4.86%,全鉀2.42%.抗生素殘留檢測結(jié)果指出,有機肥料中含磺胺二甲嘧啶(SM2) 1.40μg/kg、強力霉素(DOX)351.10μg/kg、金霉素109.38μg/kg、磺胺氯噠嗪 5.44μg/kg, 磺胺-6-甲氧嘧啶3.49μg/kg,殘留濃度均以干基計.供試土壤有兩種,分別為水稻土(青紫泥)和潮土(小粉土),土壤采集后,經(jīng)風干和去除石子、植物根等雜質(zhì),并過10目篩后備用.小粉土取自慈溪掌起鎮(zhèn),為旱作土壤,常年種植蔬菜,pH(土:水=1:2.5)7.3,田間最大飽和持水率50%,有機質(zhì)0.36%,全氮0.15%,有效磷78.88mg/kg,速效鉀102mg/kg.水稻土(青紫泥)取自紹興孫端鎮(zhèn),為水稻土,常年種植蔬菜,pH(土:水=1:2.5)6.0,田間最大飽和持水率55%,有機質(zhì)0.76%,全氮0.13%,有效磷17.32mg/kg,速效鉀167mg/kg.兩種供試土壤中均無強力霉素和磺胺二甲嘧啶檢出.供試抗生素為磺胺二甲嘧啶(SM2)、強力霉素(DOX),購買自sigma公司,純度>99%.這兩種抗生素均為本課題組在2013年浙江省有機肥抗生素殘留調(diào)查中檢出頻率最高的磺胺類和四環(huán)素類抗生素[4].

1.2 室內(nèi)土壤培養(yǎng)試驗

取100mL的滅菌圓形窄口玻璃瓶,裝風干土30g,隨后添加1.5%不同抗生素處理的有機肥料,上下反復(fù)顛倒混勻,形成不同的抗生素處理土壤;用無菌水調(diào)節(jié)土壤水分含量至田間最大飽和持水率的50%,接著用透氣不透水的Parafilm膜封口,置于溫度25°C,濕度50% 的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng),定期稱重并補充無菌水以保持土壤濕度.本試驗涉及的兩種土壤類型,每種土壤類型有6個抗生素處理,分別為:(CK)不添加外源抗生素;(SM2-10)添加磺胺二甲嘧啶,10mg/kg; (DOX-10)添加強力霉素,10mg/kg;(SM2-DOX), 10mg/kg磺胺二甲嘧啶+10mg/kg強力霉素; (SM2-20)磺胺二甲嘧啶,20mg/kg;(DOX-20)強力霉素,20mg/kg.每個處理重復(fù)3次.在培養(yǎng)的第3d和第7d進行破壞性采樣,土壤樣品采集后分成兩份,一份采集后立即用于MicroRESPTM實驗,另一份-20℃保存用于抗生素檢測.將抗生素添加到有機肥的方法如下:精確稱取目標抗生素0.1g,溶解于100mL甲醇溶液中,配制成1mg/mL的抗生素甲醇母液,按每組抗生素的添加水平,加一定量抗生素甲醇溶液到0.45g有機肥中,在通風櫥中過夜揮發(fā),去除甲醇,形成抗生素殘留有機肥料.其中空白對照有機肥料為無抗生素的甲醇溶液,制備方法同抗生素處理有機肥.

1.3 土壤中抗生素提取和測定

取-20℃保存的土壤樣品,采用固相萃取-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法進行抗生素定量檢測,具體方法參照Wang等[10]的報道.大致步驟如下:稱取1.00g樣品(精確至0.01g)至50mL聚丙烯離心管中,加入內(nèi)標溶液,放置10min;加入25mL提取劑,渦旋30s,超聲30min,5000r/min離心10min,將上清液轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中;殘渣用25mL提取液再提取一次;將兩次上清液于圓底燒瓶中混合;將圓底燒瓶放于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上干燥,水浴溫度為40℃;用5mL的磷酸鹽緩沖液充分超聲重懸,此步驟重復(fù)3次;將所有重懸液過6cc/200mg OasisòHLB固相萃取小柱(Waters);收集洗脫液于玻璃刻度管中,45℃氮氣吹干,用體積比為1:1的甲醇-水溶液定容至1mL,過0.22μm有機濾膜,液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/ MS)測定,內(nèi)標法定量.其中土壤中的強力霉素提取采用EDTA溶液(pH 12),磺胺二甲嘧啶的提取采用磷酸鹽緩沖液(pH 4.0).

色譜條件:DOX的色譜柱為Endeaorsill C18柱(1.8μm, 2.1mm×50mm),SM2色譜柱為Phenomenex C18柱(3μm, 2.0mm′150mm); Thermo Finnigan Surveyor HPLC系統(tǒng)(Thermo Scientific, USA);流速:0.25mL/min;柱溫:30℃;進樣量:5μL.流動相A:甲醇,B:甲酸-水(1:1000,體積比),等度洗脫:0min(40%A)→5.0min(40%A).質(zhì)譜分析采用TSQ Quantum Discovery三級四極桿質(zhì)譜儀(美國,Thermo Fisher Scientific公司)配ESI離子源.磺胺二甲嘧啶和強力霉素的回收率和檢測范圍如表1所示.

表1 DOX和SM2的回收率和檢測靈敏度

注:*2μg/g、20μg/kg和200μg/kg 3個不同標準物濃度添加下的回收實驗結(jié)果.±表示標準差.

1.4 MicroRESPTM分析

MicroRESPTM技術(shù)是一種較為靈敏、快捷的用于研究原位土壤微生物群落水平生理特征(CLPP)的方法[11],其不破壞土壤中微生物生活環(huán)境,測定的微生物信息較為全面.MicroRespTM操作方法參見Campbell等的研究報告[12].大致流程:將待測土壤樣品均勻添加到深孔板中,隨后加入水和15種碳源底物,將配制好的檢測板倒扣在深孔板上,25℃培養(yǎng)6h后,利用酶標儀讀取570nm波長下檢測板的吸光值;測定檢測板在樣品培養(yǎng)前和培養(yǎng)6h后的吸光值,通過吸光值差異計算CO2產(chǎn)生率.15種碳源底物依次為丙氨酸、L-阿拉伯糖、L-精氨酸、L-鹽酸半胱氨酸、檸檬酸、D-果糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、α-氨基丁酸、L-賴氨酸鹽酸鹽、L-蘋果酸、N-乙酰葡萄糖胺、草酸、原兒茶酸、D-海藻糖.檢測板制備方法如下:將甲酚紅(12.5mg/L)、氯化鉀(150mmol/L)和碳酸氫鈉(2.5mmol/L)混合制成指示劑;同時配制3%的純化瓊脂,加入2倍膠體積的指示劑;然后將指示瓊脂添加到檢測板的微孔中,每孔150μL,最后配制好的檢測微孔板存放于含堿石灰(70%CaO, 20%水,3%NaOH,1%KOH)的干燥器中待用.

1.5 數(shù)據(jù)處理

不同處理中土壤抗生素降解率計算方法如下:

式中:C0為培養(yǎng)前土壤中抗生素的初始濃度,C為采集土壤樣品中抗生素的殘留濃度.

利用Shannon-Winner香農(nóng)多樣性指數(shù)(H)分析不同處理對土壤微生物群落代謝多樣性的影響.利用香農(nóng)多樣性指數(shù)(H)可以了解土壤微生物群落利用碳源類型的多與少,即功能多樣性,一般來說土壤微生物群落中物種越多,香農(nóng)多樣性指數(shù)越高,群落多樣性越好.計算公式:

式中:表示16種底物的土壤CO2呼吸速率,P為每個底物呼吸速率占所有底物呼吸速率的比值.

采用SPSS 15.0對MicroRESPTM底物誘導(dǎo)呼吸數(shù)據(jù)進行聚類分析,同時采用SPSS開展單因素方差分析(One-way ANOVA,最小顯著差法LSD)和多因素方差分析.利用SigmaPlot 10.0作圖及CANOCO 4.5開展典范對應(yīng)分析(CCA).

2 結(jié)果與分析

2.1 磺胺二甲嘧啶和強力霉素單一及復(fù)合條件下在不同類型土壤中的降解轉(zhuǎn)化

圖1 不同處理下SM2和DOX在青紫泥和小粉土中的降解率

由圖1(a)、圖1(b)可知,青紫泥中,單一及復(fù)合抗生素處理SM2和DOX 3d和7d降解率均無顯著(<0.05)差異,因此SM2與DOX共存并沒有對青紫泥中SM2和DOX的短期降解產(chǎn)生顯著影響.此外,單一污染下,青紫泥中SM2增加會顯著(<0.05)抑制其降解,但DOX濃度變化對其的短期降解無顯著(>0.05)影響.與青紫泥有所不同,SM2與DOX共存強烈抑制了小粉土中SM2和DOX的降解[圖1(c),圖1(d)].小粉土中SM2 3d降解率在單一及復(fù)合抗生素處理之間無顯著差異,但SM2-DOX處理的平均降解率總體低于SM2-10處理,特別是復(fù)合抗生素處理的SM2 7d降解率顯著低于所有單一SM2處理(SM2-10、SM2-20);而SM2-DOX處理小粉土中DOX 3d和7d降解率均顯著低于所有單一DOX處理.總體上看,小粉土中SM2和DOX的早期降解更易被復(fù)合抗生素污染所抑制.在供試濃度下,單一污染下小粉土中SM2和DOX的早期降解均不受其濃度增加的顯著影響.對比圖1(a)、(b)和圖1(c)、(d)發(fā)現(xiàn),單一污染下SM2和DOX在小粉土中的降解率總體高于青紫泥.表2對比了20mg/kg抗生素添加下,不同類型土壤中總抗生素的殘留情況,可知單一污染下,小粉土中總抗生素殘留基本低于青紫泥,這一結(jié)果進一步證實抗生素在小粉土的降解高于青紫泥.抗生素在土壤中的降解與其化學(xué)結(jié)構(gòu)、土壤pH值、溫度、水分、土壤微生物組成和活性有關(guān)[13].

表2不同處理下青紫泥和小粉土中抗生素總殘留濃度

Table 2 Total residual concentrations of antibiotics within the purple clay and silt soil in different antibiotic treatments

注:對相同采樣時間的不同抗生素處理進行單因素方差分析,同一列上標記不同字母表示各抗生素處理間差異顯著(<0.05,=3);*抗生素殘留=磺胺二甲嘧啶殘留+強力霉素殘留.

2.2 磺胺二甲嘧啶和強力霉素單一及復(fù)合處理對不同類型土壤微生物群落代謝結(jié)構(gòu)的影響

圖2 不同處理下3d和7d采集土壤中微生物群落代謝結(jié)構(gòu)差異聚類分析

x:小粉土;q:青紫泥;1_3d、1_7d:CK;2_3d、2_7d:SM2-10;3_3d、3_7d:DOX-10;4_3d、4_7d:SM2+DOX;5_3d、5_7d:SM2-20;6_3d、6_7d:DOX-20

為了探討不同處理土壤微生物群落代謝結(jié)構(gòu)變化,對不同碳源底物誘導(dǎo)呼吸(SIR)數(shù)據(jù)進行聚類分析(圖2).由圖2a可知,3d的土壤樣品中,青紫泥DOX-10和青紫泥DOX-20聚為一類,青紫泥SM2-DOX聚為一類,其余處理聚為一類,表明抗生素進入土壤3d后對青紫泥微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生明顯影響,DOX產(chǎn)生的影響大于SM2.有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),含磺胺嘧啶的有機肥施入兩種不同的耕作土壤后,1d內(nèi)土壤CO2釋放量有所減少[14].試驗結(jié)果與此類似,3d后青紫泥中DOX的影響比SM2大.且復(fù)合處理青紫泥微生物群落代謝結(jié)構(gòu)不同于單一處理,而相同條件下,抗生素對小粉土微生物群落代謝結(jié)構(gòu)的影響較小.在7d的土壤樣品中,青紫泥和小粉土的微生物群落代謝結(jié)構(gòu)各單獨聚為一類(圖2b).由上,可推測抗生素殘留有機肥料進入土壤3d內(nèi)對土壤微生物群落的影響大于土壤類型對微生物群落的影響,而7d后抗生素的影響與土壤類型的相關(guān)性不明顯,但相關(guān)結(jié)論需要進一步驗證.

2.3 SM2和DOX單一及復(fù)合處理對不同類型土壤微生物群落代謝多樣性的影響

抗生素對土壤微生物群落代謝多樣性的影響與土壤類型有關(guān)(表3).青紫泥中,SM2-DOX處理微生物群落代謝多樣性與DOX-10無顯著差異,但顯著高于CK和SM2-10,暗示SM2-DOX處理對青紫泥代謝多樣性的促進主要與DOX有關(guān).青紫泥土壤微生物群落代謝多樣性的多因素方差分析結(jié)果也表明,僅有DOX對土壤微生物群落代謝多樣性呈顯著(<0.01)影響,而SM2以及二者的交互作用均無顯著(>0.05)影響.抗生素對小粉土微生物群落代謝的影響與其在土壤中的暴露時間有關(guān),但無論是3d還是7d的土壤多樣性數(shù)據(jù)均表明SM2-DOX處理對土壤代謝多樣性的影響類似于DOX-10.從3d和7d的小粉土微生物群落代謝多樣性的多因素分析結(jié)果可知,僅有DOX的影響是顯著(<0.01)的,而2種抗生素的交互作用只對3d的土壤樣品有顯著(<0.01)影響,SM2的影響均是不顯著(>0.05)的.因此可初步推測,SM2與DOX共存對土壤微生物代謝多樣性的影響主要歸功于DOX的作用.

表3 皮爾遜相關(guān)分析研究抗生素殘留濃度與土壤微生物代謝的關(guān)系

注 :對相同采樣時間的不同抗生素處理進行單因素方差分析,同一列上標記不同字母表示不同處理間差異顯著(<0.05,=3).

2.4 抗生素濃度與土壤微生物群落代謝的關(guān)聯(lián)分析

采用典范對應(yīng)分析(CCA)研究抗生素總殘留濃度、磺胺二甲嘧啶濃度和強力霉素濃度與土壤微生物群落代謝結(jié)構(gòu)的相關(guān)性,通過蒙特卡羅檢驗對3個因子的影響程度進行顯著性分析.結(jié)果表明,抗生素進入土壤3d后,各因子對土壤微生物群落代謝的影響程度大小為抗生素總殘留濃度(=3.02,=0.03)>強力霉素濃度(=1.57,=0.19)>磺胺二甲嘧啶濃度(=0.16,=0.19).抗生素進入土壤7d后,各因子對土壤微生物群落代謝的影響程度大小為抗生素總殘留濃度(=0.36,=0.74)>強力霉素濃度(=0.29,=0.75)>磺胺二甲嘧啶濃度(=0.11,=0.97).因此,抗生素總殘留濃度和強力霉素濃度對土壤微生物群落代謝結(jié)構(gòu)的影響大于磺胺二甲嘧啶濃度,且抗生素進入土壤3d對土壤微生物群落代謝結(jié)構(gòu)的影響大于其進入土壤7d的影響,這與抗生素前期快速降解,后期緩慢降解有關(guān)[15],這一結(jié)論與圖2和表3中所得的推測相一致.

表4 不同抗生素處理下青紫泥和小粉土中的微生物群落代謝多樣性

注:*不同處理間差異顯著(<0.05,=3)**不同處理間差異極顯著(<0.01,=3).

表4進一步對抗生素總殘留濃度與土壤代謝活性(基礎(chǔ)呼吸)和土壤微生物群落代謝多樣性(香農(nóng)指數(shù))開展皮爾遜相關(guān)分析,結(jié)果表明青紫泥中土壤基礎(chǔ)呼吸和香農(nóng)指數(shù)與抗生素殘留總濃度和強力霉素濃度呈顯著正相關(guān),而與磺胺二甲嘧啶濃度無明顯相關(guān)性,而小粉土中土壤代謝活性和多樣性與抗生素殘留濃度無類似的相關(guān)關(guān)系.因此,青紫泥中強力霉素濃度的上升增加了土壤代謝活性和微生物群落代謝多樣性,而小粉土中強力霉素對微生物代謝無類似促進作用.表4結(jié)果從一定程度上反映抗生素降解率的升高可以誘導(dǎo)土壤微生物群落代謝活性和多樣性的下降,緩解抗生素對土壤微生物代謝的刺激效應(yīng).同時,土壤總抗生素降解率與基礎(chǔ)呼吸(Pearson相關(guān)系數(shù)=-0.73,<0.05)和香農(nóng)指數(shù)(Pearson相關(guān)系數(shù)=-0.63,<0.05)均呈顯著負相關(guān)關(guān)系.

3 討論

3.1 土壤中抗生素降解轉(zhuǎn)化行為

抗生素在土壤中的降解行為受到眾多因素的影響.例如,不同土壤的有機質(zhì)、氧化鐵含量、陽離子交換總量、黏粒含量、最大飽和持水率等均會影響抗生素降解轉(zhuǎn)化.有研究表明[16],砂質(zhì)土壤中抗生素的早期降解明顯快于黏壤土,但到了后期,兩者的最終下降量逐漸接近.王娜的研究指出[17],抗生素在土壤中的吸附性也會影響抗生素在土壤中的降解轉(zhuǎn)化,其中吸附性強的土壤中磺胺類抗生素不容易轉(zhuǎn)化,而吸附性與土壤pH值及有機質(zhì)含量有一定的關(guān)系.一般認為,土壤有機質(zhì)、氧化鐵含量、陽離子交換總量、黏粒含量越高,抗生素在土壤中的降解速率越小,在土壤中就越穩(wěn)定[5].在本研究中,無論是磺胺二甲嘧啶還是強力霉素,其在小粉土中的早期降解均高于其在青紫泥中,這可能與小粉土的有機質(zhì)含量、黏粒含量以及陽離子交換總量均低于青紫泥有關(guān)[18].

此外,本文重點考察了磺胺二甲嘧啶和強力霉素復(fù)合污染下二者短期降解行為與單一污染下的差異,結(jié)果發(fā)現(xiàn)強力霉素和磺胺二甲嘧啶共存輕微抑制了土壤中磺胺二甲嘧啶和強力霉素的降解,表現(xiàn)出協(xié)同抑制作用,且復(fù)合污染對抗生素短期降解的這種協(xié)同抑制在小粉土中非常明顯.顯然,相比青紫泥,小粉土中強力霉素和磺胺二甲嘧啶的早期降解更容易被復(fù)合污染所抑制,這可能與不同土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)尤其是抗生素降解微生物對復(fù)合污染的響應(yīng)差異有關(guān).復(fù)合與單一抗生素污染條件下不同的抗生素降解行為在少數(shù)報道中亦有提及,但是結(jié)論不盡相同.例如,Ma等[19]研究發(fā)現(xiàn)磺胺間甲氧嘧啶(SMM)、環(huán)丙沙星(CIP)和四環(huán)素(TC)復(fù)合污染顯著促進了SMM、CIP和TC在土壤中的降解;Fang等[20]研究發(fā)現(xiàn)磺胺嘧啶(SDZ)和金霉素(CTC)共存對二者在土壤中的降解行為無顯著影響.因此,復(fù)合和單一抗生素污染對土壤抗生素降解行為的影響差異與其所在的環(huán)境條件密切相關(guān).本文證實,在相同條件下,復(fù)合和單一抗生素污染對土壤抗生素降解行為的影響在小粉土和青紫泥中就存在差異,因此土壤類型是影響因素之一.其次,開展試驗的條件不同也可能影響結(jié)論.Ma等[19]在實地青菜盆栽條件下開展研究工作,在這一過程中,抗生素的轉(zhuǎn)化行為包括光解、水解和生物降解,其中光解的作用不容小覷,此外蔬菜栽培也會影響抗生素的降解行為[10].同時,本試驗中抗生素是伴隨有機肥料進入土壤的,有機肥料對土壤理化和微生物的影響也會從一定程度上影響抗生素的降解.本文和Fang等[20]則均采用室內(nèi)土壤暗培養(yǎng)試驗,光解的貢獻很小,且也不受蔬菜生長和自然溫濕度變化的影響,因此本文中青紫泥的結(jié)果與Fang等[20]的結(jié)果非常類似.當然,不同抗生素添加濃度可能是造成差異的原因,本文和Fang等[20]研究所添加的抗生素濃度僅是Ma等[19]報道的十分之一.

3.2 抗生素對土壤微生物的影響

土壤微生物是土壤的重要組成部分,是評價土壤質(zhì)量的生物學(xué)指標之一.土壤微生物的代謝行為可以從一定程度上反映土壤活力和質(zhì)量,也與土壤生態(tài)系統(tǒng)平衡維系密切相關(guān)[21].抗生素是以微生物為作用靶標的,而土壤的功能(包括有機質(zhì)降解、養(yǎng)分和能量的轉(zhuǎn)化)都是以微生物活動為基礎(chǔ)的.事實上,相對于土壤動物和植物,土壤微生物對抗生素等外源污染的脅迫更加敏感[22].因此,了解抗生素的土壤微生物生態(tài)學(xué)效應(yīng)對于抗生素的生態(tài)環(huán)境風險評估以及預(yù)測抗生素在土壤中的分解命運均至關(guān)重要.

抗生素作為一種外源物質(zhì)進入土壤,其即可抑制也可促進土壤微生物代謝活動[20,23-24]受到土壤中抗生素賦存濃度的影響.在一定濃度范圍內(nèi),抗生素可以刺激土壤微生物,誘導(dǎo)呼吸作用增強,這種現(xiàn)象非常普遍[20,23].本文亦發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果,在供試濃度10~20mg/kg下,SM2和DOX的單一和復(fù)合污染總體是增加了土壤微生物代謝活力,提高微生物群落代謝多樣性,從一定程度上反映土壤微生物種群的增加和代謝底物譜的擴大.事實上,四環(huán)素類抗生素中的強力霉素常被發(fā)現(xiàn)可以促進土壤微生物代謝,低濃度的強力霉素甚至可以提高植物發(fā)芽率和生物量[10].有研究者認為,強力霉素的低生物毒性使其成為土壤微生物的潛在利用底物[25],從而擴大了土壤中可利用的底物譜,進而從一定程度上提高土壤微生物代謝活性和多樣性.不過,我們認為,這一現(xiàn)象更可能是土壤微生物生態(tài)系統(tǒng)應(yīng)對外界刺激的一種反應(yīng),是土壤啟動自我修復(fù)的一種反饋機制.此外,抗生素對土壤微生物的影響是一種動態(tài)的模式,隨其在土壤中的暴露時間的增加而改變.Lin等[8]報道發(fā)現(xiàn),抗生素對土壤微生物的影響會隨暴露時間的增加而減弱,而本研究的結(jié)果也暗示抗生素殘留有機肥料進入土壤3d對土壤微生物群落的影響大于土壤類型,而7d后抗生素的影響小于土壤類型,與前期報道結(jié)論有類似之處.事實上,抗生素在土壤中的降解會導(dǎo)致抗生素土壤微生物脅迫效應(yīng)的逐步減弱,本研究在抗生素濃度與土壤微生物群落代謝的關(guān)聯(lián)分析中同樣證實了這一情況.

另外,隨抗生素在土壤賦存時間的增加,土壤微生物對這種外源刺激的適應(yīng)以及自我調(diào)節(jié)也會改變土壤微生物對抗生素脅迫的應(yīng)答.

復(fù)合和單一抗生素污染下土壤微生態(tài)效應(yīng)差異仍是本研究探討的重點.在本文中,SM2和DOX共存對土壤微生物群落代謝的影響沒有表現(xiàn)出明顯的協(xié)同或相加效應(yīng).DOX對土壤微生物群落代謝的影響遠高于SM2的影響.DOX是復(fù)合污染土壤微生物群落代謝結(jié)構(gòu)和多樣性改變的主要污染因子.在青紫泥中,DOX濃度甚至與土壤代謝活性和微生物群落代謝多樣性呈顯著正相關(guān).我們注意到,四環(huán)素類抗生素對土壤微生物的這種強烈干擾在以往報道中亦有提及.Lin[8]等通過高通量測序研究了四環(huán)素、環(huán)丙沙星和磺胺間甲氧嘧啶單一及復(fù)合條件下的土壤細菌群落結(jié)構(gòu)響應(yīng),指出三種抗生素復(fù)合處理土壤的細菌群落結(jié)構(gòu)與四環(huán)素單一處理土壤的相似度遠高于環(huán)丙沙星和磺胺間甲氧嘧啶單一處理土壤.此外,復(fù)合和單一抗生素污染土壤的微生物群落代謝差異隨土壤類型的變化也發(fā)生了改變.青紫泥和小粉土具有完全不同的理化性質(zhì),因此可知二者的微生物群落結(jié)構(gòu)和代謝功能存在較大差異,這點可以從土壤微生物群落代謝結(jié)構(gòu)差異的聚類分析結(jié)果(圖2)中得到證實.不同土壤微生物群落的差異可能是二者應(yīng)答抗生素污染產(chǎn)生不同響應(yīng)的原因,但仍需進一步的深入研究.

4 結(jié)語

SM2和DOX共存會對二者在土壤中的短期降解及土壤微生物效應(yīng)產(chǎn)生一定影響,且與土壤類型相關(guān).在小粉土中二者復(fù)合污染對SM2和DOX的短期降解表現(xiàn)出強烈的協(xié)同抑制效應(yīng),這種抑制效應(yīng)在青紫泥不顯著.但SM2和DOX的單一和復(fù)合污染總體表現(xiàn)為促進土壤微生物代謝活力,提高微生物群落代謝多樣性.其中DOX對土壤微生物群落代謝的影響遠高于SM2的影響,是復(fù)合污染土壤微生物群落代謝結(jié)構(gòu)和多樣性改變的主要因子.

在單一污染條件下,小粉土中SM2和DOX的早期降解均高于青紫泥.DOX濃度與青紫泥微生物代謝活性和多樣性呈顯著正相關(guān),表現(xiàn)為土壤微生物代謝隨DOX濃度的增加而增加,但小粉土無類似現(xiàn)象.

綜上,建議未來在評價環(huán)境抗生素的歸趨和生態(tài)風險時多考慮區(qū)域土壤特點及多種抗生素之間的相互作用,從而有助于更加全面、系統(tǒng)和準確判斷有機肥料中抗生素污染可能帶來的潛在風險和環(huán)境問題.

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Behavior and ecotoxicity of single and mixed antibiotics in soils: Degradation and changes in microbial community.

RUAN Lin-lin1,2, LIN Hui2*, MA Jun-wei2, SUN Wan-chun2, YU Qiao-gang2, FU Jian-rong2*

(1.College of Life and Chemical Sciences, Zhejiang Normal University, Jinhua 321004, China；2.Institute of Environmental Resources and Soil Fertilizers, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021, China)., 2018,38(3)：1081~1089

This work studied the short-term degradation of antibiotics in a purple clay and a silt soil after individual and combined application of sulfadimidine (SM2) and doxycycline (DOX); the responses of soil microbial community metabolism to different antibiotics perturbation were also compared; Liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) and MicroRESPTMtechnology were used herein. Results indicated that the degradation rates of both SM2 and DOX on the 3rdand 7thday in the silt soil were higher than that in the purple clay. Compared with that in single antibiotic pollution systems, co-existence of DOX and SM2 in combined antibiotics pollution system inhibited the short-term degradation of both antibiotic types in the two soil types; this inhibition was stronger in the silt soil. Both the single and mixed antibiotics in this work enhanced the metabolisms of soil microbial community with antibiotic exposure concentration from 10mg/kg to 20mg/kg, whereas the impacts of antibiotics decreased as the exposure time of the antibiotic increased. In the purple clay, the mixed antibiotic treatment showed significantly higher metabolic diversity of soil microbial community than all the single antibiotic treatments; its metabolic activity and diversity of soil microbial community correlated positively and significantly with the DOX concentration. However, similar phenomena were not seen in the silt soil. Meanwhile, the effect of mixed antibiotic on soil microbial community metabolism was mainly due to the function of DOX herein.

purple clay；silt soil；sulfadimidine；doxycycline；degradation；soil microorganism；MicroRESPTM

X53

A

1000-6923(2018)03-1081-09

阮琳琳(1993-),女,浙江寧波人,碩士研究生,主要從事農(nóng)業(yè)環(huán)境微生物及有機肥安全使用研究.

2017-08-30

國家自然科學(xué)基金資助項目(31672234,41401542, 31670110);浙江省科公益技術(shù)應(yīng)用項目(2017C32005, LGN18D010005)

* 責任作者, 符建榮, 研究員, fujr@mail.zaas.ac.cn; 林 輝, 副研究員, lin82774872@163.com