潘婉蓮，楊佳娣，葉國棟，趙苗，余海忠

（湖北文理學(xué)院化學(xué)工程與食品科學(xué)學(xué)院，湖北襄陽441053）

襄麥冬（Liriope spicata var.prolifera），即湖北麥冬，又叫麥門冬，味甘、微苦，性微寒，常用于治療肺燥干咳、虛勞咳嗽、津傷口渴、心煩失眠、內(nèi)熱消渴、腸燥便秘、咽白喉等癥[1]。襄陽歐廟被譽(yù)為中國麥冬之鄉(xiāng)，位居中國三大麥冬產(chǎn)地之首，單產(chǎn)高于川、杭麥冬，品質(zhì)優(yōu)，具有“白、干、凈、勻、大”的特點(diǎn)。麥冬多糖是動(dòng)物體中降血糖最主要的有效成分，可降低正常小鼠的血糖，同時(shí)對(duì)葡萄糖、腎上腺素、四氧嘧啶所導(dǎo)致的小鼠高血糖有明顯的抑制作用[2]。已有學(xué)者完成了川麥冬、杭麥冬多糖的抗氧化性測(cè)試[3-5]，但是鮮見關(guān)于襄麥冬多糖提取物抗氧化能力的報(bào)道。本研究采用α-脫氧核糖法、鄰苯三酚自氧化法、DPPH法、ABTS法、亞油酸體系法及鐵氰化鉀還原法等方法，利用紫外-可見分光光度計(jì)對(duì)襄麥冬多糖提取物的體外抗氧化活性及還原能力進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期能為新的天然抗氧化劑的開發(fā)提供理論支持，也為襄麥冬多糖的綜合利用提供一種新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

襄麥冬塊根：采自湖北襄陽歐廟襄麥冬GAP基地。

1.2 儀器

UV-2500紫外-可見光分光光度計(jì)：日本島津公司；JA5003B型電子分析天平：上海越平科學(xué)儀器有限公司；3K15型小型冷凍高速離心機(jī)：德國Sigma公司；Finnpipette移液槍：美國熱電公司；FZ-102微型植物粉碎機(jī)：天津泰斯特公司；KH3200DB超聲波清洗器：昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；DKB-501A超級(jí)恒溫水槽：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；G-1磁力攪拌器：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；GZX-9030-MBE電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 試劑

DPPH：美國 Sigma公司；乙醚、FeSO4、EDTA、α-脫氧核糖、磷酸、H2O2、三氯乙酸、硫代巴比妥酸、Tris-HCl、鄰苯三酚、HCl、亞油酸、鎢酸鈉、甲醇、Tween-20、鐵氰化鉀：上海國藥（集團(tuán)）公司；生育酚：購自中國食品藥品檢定研究院。

1.4 襄麥冬多糖提取物的制備

將新鮮襄麥冬塊根洗凈瀝干后60℃烘干至恒重，粉碎。稱取100 g樣品于燒杯中，加入4倍體積95%乙醇，攪拌，過濾，如此重復(fù)操作3次，使其充分脫脂，濾渣放入烘箱中烘干。然后，稱取脫脂烘干后的樣品80 g，按料液比1∶10（g/mL）加蒸餾水，80℃恒溫水浴磁力攪拌2 h，提取2次，合并兩次提取液進(jìn)行離心，取上清液置透析袋中透析48 h后減壓濃縮得浸膏，再用4倍體積95%乙醇對(duì)浸膏進(jìn)行醇沉，產(chǎn)物依次經(jīng)過無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌后，真空干燥，獲得襄麥冬多糖提取物[6]。制備的提取物分別用甲醇或乙醇梯度稀釋成 6.25、12.5、25、50、100、150、200 mg/mL 樣品溶液，備用。

1.5 襄麥冬多糖提取物體外抗氧化活性測(cè)定

1.5.1 對(duì)·OH清除活性的測(cè)定

采用α-脫氧核糖法[7]，準(zhǔn)確移取0.20 mL的FeSO4-EDTA混合液（10 mmol/L）于具塞試管中，加入 0.20 mL α-脫氧核糖溶液（10 mmol/L），然后各管再依次加入1 mL不同濃度的樣品溶液、0.4 mL磷酸緩沖液（pH7.4，0.1mol/L）以及0.2mLH2O2（10mmol/L），混勻后將具塞試管置于37℃水浴恒溫保持1 h；然后再加入1mL2.8%（質(zhì)量比）三氯乙酸溶液和1.0mL 1.0%（質(zhì)量比）硫代巴比妥酸溶液，迅速搖勻置沸水浴中加熱10 min，冷水冷卻后在532 nm處測(cè)定吸光值A(chǔ)S。不加襄麥冬多糖提取物，同上操作處理，測(cè)定其對(duì)比吸光值A(chǔ)C。不加襄麥冬多糖提取物且不在37℃水浴中反應(yīng)，其它處理同上，測(cè)定空白吸光值A(chǔ)0，每個(gè)樣品重復(fù)3次，按下式計(jì)算清除率：

1.5.2 對(duì)·O2-清除活性的測(cè)定

采用鄰苯三酚自氧化法[8]，移取pH8.2的Tris-HCl緩沖液4.5 mL于具塞試管中，放入25℃水浴20 min，然后在各管分別加入0.4 mL不同濃度的樣品溶液和0.1 mL 25℃保溫的鄰苯三酚溶液，混勻，25℃下準(zhǔn)確反應(yīng)4min，立即用10 mol/L HCl溶液2滴終止反應(yīng)，在325 nm處測(cè)定吸光值。對(duì)照品以蒸餾水代替糖液，緩沖液加蒸餾水作為空白，每個(gè)樣品重復(fù)3次，按下式計(jì)算清除率：

1.5.3 對(duì)DPPH自由基清除活性的測(cè)定

采用DPPH法[9]，移取3.9 mL DPPH甲醇溶液（25 mg/mL）于不同的具塞試管中，分別加入0.1 mL不同濃度的樣品溶液，混勻后，將試管放入暗處反應(yīng)0.5 h后立刻取出，在515 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光值A(chǔ)，空白用甲醇代替樣品測(cè)得空白吸光值為A0，其它方法都一樣。每個(gè)樣品重復(fù)3次，按下式計(jì)算清除率：清除率/%=[（A0-A）/A0]×100。

1.5.4 對(duì)ABTS自由基清除活性的測(cè)定

采用ABTS法[10]，移取7.4 mmol/L的ABTS溶液0.2 mL，加入2.6 mmol/L K2S2O8溶液 0.2 mL，混勻，在室溫條件下放入黑暗區(qū)域12 h，再用95%的乙醇稀釋40倍，此時(shí)在734 nm處測(cè)得吸光度值為0.7±0.02即可。取不同的具塞試管，分別加入0.8 mL上述溶液和0.2 mL不同濃度的樣品溶液，劇烈振搖10s，靜置6min后，立刻在734nm處測(cè)得其吸光值A(chǔ)S?？瞻子靡掖即鏈y(cè)得吸光值為A0，每個(gè)樣品重復(fù)3次，按下式計(jì)算清除率：清除率/%=（1-AS/A0）×100。

1.5.5 抗脂質(zhì)過氧化活性的測(cè)定

采用亞油酸體系法[11]，稱取0.29 g亞油酸和0.29 g Tween-20，再加50 mL 0.2 mol/L pH=7.5的KH2PO4-NaOH緩沖溶液。吸取不同濃度的樣品溶液，移入試管中，加2 mL樣油，37℃恒溫水浴15 h，加6 mL 60%（體積比）甲醇溶液終止反應(yīng)，在234 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以空白作參比，每個(gè)樣品重復(fù)3次，按下式計(jì)算其抗氧化活性：抗氧化活性/%=[（A空白-A樣品）/A空白]×100。

1.5.6 還原能力的測(cè)定

采用鐵氰化鉀還原法[12]，取不同濃度樣品溶液于具塞試管中，加入2.5 mL pH 6.6的磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L）及2.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液混合，將混合好的溶液置50℃水浴保溫20 min，再加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液，混勻，靜置10 min后，用分光光度計(jì)于700 nm處測(cè)其吸光值。以吸光值大小表示還原能力大小，每個(gè)樣品重復(fù)3次，求其平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)·OH清除能力的測(cè)定結(jié)果

Fenton反應(yīng)體系在催化劑作用下，過氧化物能產(chǎn)生兩種活潑的氫氧自由基，從而引發(fā)和傳播自由基鏈反應(yīng)，加快有機(jī)物和還原性物質(zhì)的氧化，從而產(chǎn)生·OH。本研究考察在襄麥冬多糖提取物存在時(shí)，·OH對(duì)α-脫氧核糖分子的氧化、破壞情況，從而來確定麥冬多糖對(duì)·OH的清除活性，結(jié)果見圖1。

由圖1可以看出，襄麥冬塊根多糖溶液對(duì)羥自由基的清除活性，隨著其質(zhì)量濃度的增加而逐漸增強(qiáng)，在濃度達(dá)到100 mg/mL之前，清除率保持較大的增幅，此后，盡管隨濃度的增大而清除率繼續(xù)增強(qiáng)，但是增幅明顯降低，清除活性維持在51%左右。而陽性對(duì)照生育酚的清除率，從50 mg/mL濃度開始，增幅顯著減小，總體上清除率維持在80%左右。

圖1 襄麥冬多糖提取物的體外清除羥基自由基的能力Fig.1 In vitro scavenging hydroxyl radical ability of L.spicata var prolifera polysaccharide

2.2 對(duì)·O2-清除能力的測(cè)定結(jié)果

在堿性條件下（pH8.2）鄰苯三酚發(fā)生自氧化反應(yīng)，生成超氧陰離子自由基（·O2-）和中間產(chǎn)物，該中間產(chǎn)物在325 nm處有一特征吸收峰。當(dāng)加入自由基清除劑時(shí)，·O2-的生成會(huì)受到抑制作用，自氧化過程也會(huì)受阻，中間產(chǎn)物生成減少，在325 nm處的吸收減弱。因此，可以通過測(cè)定A325的變化來評(píng)價(jià)襄麥冬多糖提取物對(duì)·O2-的清除能力，不同濃度的樣品溶液清除結(jié)果見圖2。

圖2 襄麥冬多糖提取物的體外清除·O2-的能力Fig.2 In vitro scavenging·O2-of L.spicata var prolifera polysaccharide

由圖2可知，不同濃度的襄麥冬多糖提取物與生育酚均對(duì)鄰苯三酚自氧化反應(yīng)有一定的抑制作用，即對(duì)·O2-有一定的清除能力，隨著多糖濃度的增加，二者清除自由基的能力也逐漸增加，且清除率保持著類似的上升趨勢(shì)。但是，總體上來看，襄麥冬多糖對(duì)·O2-的清除活性并不是太強(qiáng)，其清除率也僅維持在20%，遠(yuǎn)低于同濃度的生育酚的52%左右。

2.3 對(duì)DPPH自由基清除能力的測(cè)定結(jié)果

DPPH被甲醇溶解后形成一種穩(wěn)定以氮為中心的質(zhì)子的自由基（DPPH·），甲醇溶液呈紫紅色，在515 nm處有強(qiáng)吸收。當(dāng)自由基清除劑提供一個(gè)電子與DPPH·的孤對(duì)電子配對(duì)，而使其顏色消退，在最大吸收波長(zhǎng)處減弱，其中褪色程度與其接受的電子呈定量的一種關(guān)系。這種顏色變淺的狀況與配對(duì)電子數(shù)呈定量的關(guān)系可用于評(píng)價(jià)DPPH·的清除情況。不同濃度的襄麥冬多糖提取物清除DPPH·的活性測(cè)試結(jié)果見圖3。

圖3 襄麥冬多糖提取物的體外清除DPPH自由基能力Fig.3 In vitro scavenging DPPH radical ability of L.spicata var prolifera polysaccharide

從圖3可以看出，襄麥冬多糖提取物體外清除DPPH·的活性較強(qiáng)，隨著濃度的增加其清除DPPH自由基的能力也在逐漸增強(qiáng)，并呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，在濃度達(dá)到100 mg/mL之后，其清除率總體維持在59%左右，這表明襄麥冬多糖提取物對(duì)DPPH自由基有比較好的清除能力。同時(shí)，由圖3還可發(fā)現(xiàn)，在濃度達(dá)到25 mg/mL之前，低濃度的樣品溶液其清除DPPH自由基的活性，要高于同濃度的生育酚。

2.4 對(duì)ABTS自由基清除能力的測(cè)定結(jié)果

ABTS溶液在合適的氧化劑的作用下，會(huì)自動(dòng)氧化成綠色的ABTS溶液，在734 nm處可以測(cè)定其吸光度。但是在抗氧化劑存在的情況下，ABTS自由基的產(chǎn)生會(huì)被抑制，溶液的顏色會(huì)變淺。因此，通過測(cè)定ABTS自由基在734 nm處的吸光度變化，即可測(cè)定出樣品的總抗氧化活性大小。

襄麥冬多糖不同濃度的提取物體外清除ABTS自由基的測(cè)定結(jié)果見圖4，由圖4可知，隨著提取物濃度的增大其清除ABTS自由基的能力越強(qiáng)，并呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系：在供試溶液濃度達(dá)到100 mg/mL之前，不論是標(biāo)準(zhǔn)品還是樣品，其清除率的增幅隨濃度的增大而增加。此后，盡管二者清除率依然會(huì)隨濃度的增大而繼續(xù)增加，但是增幅急劇減小，二者對(duì)ABTS自由基的清除活性維持在50%和80%左右。

圖4 襄麥冬多糖提取物的體外清除ABTS自由基的能力Fig.4 In vitro scavenging ABTS radical ability of L.spicata var prolifera polysaccharide

2.5 抗脂質(zhì)過氧化活性的測(cè)定結(jié)果

脂質(zhì)的自動(dòng)氧化也稱脂質(zhì)的過氧化作用。脂質(zhì)的過氧化一般定義為多不飽和脂肪酸或脂質(zhì)的氧化變質(zhì)。若糖類物質(zhì)含量較高的情況下也會(huì)抑制脂質(zhì)的氧化，襄麥冬多糖提取物的體外抗脂質(zhì)過氧化活性見圖5。

圖5 襄麥冬多糖提取物的體外抗脂質(zhì)過氧化活性Fig.5 In vitro anti lipid peroxidation activity of L.spicata var prolifera polysaccharide

由圖5可知，襄麥冬多糖提取物能明顯的抑制亞油酸的自氧化，同生育酚相比，雖然低濃度的多糖對(duì)亞油酸的抑制作用偏低，但隨其濃度加大，其抑制脂質(zhì)過氧化活性越強(qiáng)，且抑制增幅接近于生育酚的趨勢(shì)。當(dāng)濃度達(dá)到100 mg/mL之后，襄麥冬多糖提取物對(duì)脂質(zhì)過氧化的抑制率保持在55%左右，顯示出較強(qiáng)的抗脂質(zhì)過氧化特性。

2.6 還原能力的測(cè)定結(jié)果

三價(jià)鐵離子具有氧化性，還原糖可將其氧化。若反應(yīng)體系中存在有還原性物質(zhì)時(shí)，鐵氰化鉀會(huì)被還原成亞鐵氰化鉀，亞鐵氰化鉀在酸性條件下與三氯化鐵反應(yīng)，生成普魯士藍(lán)，在700 nm波長(zhǎng)處有最大吸收波長(zhǎng)。故吸光值越大，表示待測(cè)還原性物質(zhì)的還原能力越強(qiáng)。

抗氧化劑清除自由基的機(jī)理是通過自身的還原作用給出電子來清除的，一般來說，吸光值越大，還原能力就越強(qiáng)，其抗氧化性就越好，襄麥冬多糖提取物的體外還原能力見圖6。

圖6 襄麥冬多糖提取物的體外還原能力Fig.6 In vitro reduction ability of L.spicata var prolifera polysaccharide

由圖6可以看出，隨著襄麥冬多糖提取物濃度的增大，處理后的樣品溶液其吸光值也逐漸增大，即對(duì)鐵氰化鉀的還原能力也增強(qiáng)，當(dāng)濃度達(dá)到50 mg/mL之后，其吸光值增幅顯著減小，數(shù)值逐漸維持在0.073上下，這表明盡管濃度在不斷增大，但是襄麥冬多糖的還原能力趨于穩(wěn)定。

3 小結(jié)與討論

目前，國內(nèi)關(guān)于麥冬多糖的抗氧化活性報(bào)道，幾乎全部集中在麥冬Ophiopogon jaonicus上，鮮見襄麥冬Liriope spicata var.prolifera的。本文采用α-脫氧核糖法、鄰苯三酚自氧化法、DPPH法、亞油酸體系法、ABTS法以及鐵氰化鉀還原法等方法，對(duì)產(chǎn)自湖北襄陽的道地藥材——襄麥冬多糖提取物的體外抗氧化活性進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明，襄麥冬多糖的清除自由基活性與其提取物的濃度呈線性關(guān)系，濃度越高，其清除自由基能力和還原能力就越強(qiáng)。除了對(duì)超氧陰離子的清除率僅為20%之外，麥冬多糖對(duì)其它自由基的清除率都超過50%，尤其對(duì)DPPH自由基最高，維持在59%左右。同時(shí)，研究還發(fā)現(xiàn)，襄麥冬多糖提取物對(duì)鐵氰化鉀的還原能力以及抗脂質(zhì)過氧化活性，均是隨著多糖質(zhì)量濃度的增高而增強(qiáng)。

嚴(yán)碧歌采用超聲波處理提取川麥冬多糖，發(fā)現(xiàn)雖然不會(huì)影響多糖的單糖組成，但是會(huì)改變多糖的微觀結(jié)構(gòu)，提高多糖的抗氧化活性[13]。趙凱的報(bào)道則顯示，經(jīng)超聲波處理所得麥冬多糖，除超氧陰離子自由基（O2-·）的清除作用喪失外，其它抗氧化活性均得到提高[14]。研究還發(fā)現(xiàn)，超聲功率對(duì)麥冬多糖的抗氧化活性具有顯著影響：隨著超聲功率的增大，麥冬多糖的抗氧化活性呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢(shì)，且超聲功率為400 W時(shí)其抗氧化活性最高[15]。王艷翠[16]對(duì)麥冬體外抗氧化測(cè)試結(jié)果顯示麥冬的氯仿/甲醇提取物和正丁醇萃取物具有較好的抗氧化活性，而粗多糖的抗氧化活性較低。李明[17]研究發(fā)現(xiàn)麥冬多糖可提高長(zhǎng)期負(fù)荷訓(xùn)練大鼠的免疫功能，抑制過氧化損傷和糖原的耗竭，具有良好的開發(fā)前景。張力妮[18]測(cè)試了經(jīng)過硫酸化、磷酸化以及羧甲基化修飾的8種麥冬多糖的體外抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)它們均具有一定的抗氧化活性，尤其對(duì)于DPPH自由基，清除率最高可達(dá)70%。陳剛[19]實(shí)驗(yàn)證明具有很好的吸濕保濕性能，具有很好的還原能力，為麥冬多糖開發(fā)成保健品或化妝品提供了一定的理論依據(jù)。張婭芳的實(shí)驗(yàn)表明6種麥冬多糖均具有體外抗氧化活性，且呈劑量依賴關(guān)系，其中POJ-SS體外抗氧化性最強(qiáng)，她推測(cè)這可能與其具有β-（1，3）鍵合的葡聚糖骨架有關(guān)系[20]。

襄麥冬是一種藥食兩用植物，目前已開發(fā)出麥冬酒、麥冬茶、麥冬酸奶等產(chǎn)品，本文對(duì)其多糖展開的抗氧化性研究，將非常有助于襄麥冬資源的綜合利用，尤其是為植物性天然食品抗氧化劑的開發(fā)，提供了一種新的思路。

[1]劉立萍,李然.“純補(bǔ)胃陰”論麥冬[J].遼寧中醫(yī)雜志,2011(1):132-133

[2]王智杰,茍小林.麥冬降血糖作用的藥效學(xué)研究[J].中醫(yī)藥學(xué)刊,2003,21(6):898-899

[3]張力妮,張靜,孫潤廣,等.麥冬多糖的修飾及其抗氧化活性與空間結(jié)構(gòu)的研究[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào),2014,33(1):27-33

[4]王昭晶,羅巔輝.麥冬水溶性多糖OPA的分離純化及其抗氧化活性研究[J].現(xiàn)代中醫(yī)藥,2008,28(5):77-79

[5]王昭晶,羅巔輝.麥冬水溶性多糖OPB的分離純化及抗氧化活性研究[J].長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2008,24(3):254-255

[6]孫永林,余海忠,劉慧宏,等.湖北麥冬塊根多糖提取工藝的優(yōu)化[J].食品工業(yè)科技,2011(4):293-294

[7]周婷,劉統(tǒng),林丹潔,等.魚腥草甲醇提取物體外抗氧化性及抑菌活性評(píng)價(jià)[J].山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報(bào),2012,31(3):87-90

[8]陳留勇,孟憲軍,賈薇,等.黃桃水溶性多糖的抗腫瘤作用及清除自由基、提高免疫活性研究[J].食品科學(xué),2004,25(2):167-170

[9]余海忠,劉統(tǒng),林丹潔,等.鄂西北產(chǎn)魚腥草提取物體外抗氧化性的四種化學(xué)方法評(píng)價(jià)[J].中國野生植物資源,2012,31(1):22-25

[10]白海娜,王振宇,劉瑞海,等.白藜蘆醇與黑木耳多糖協(xié)同清除ABTS自由基活性的研究[J].現(xiàn)代食品科技,2014,30(3):64-68

[11]聶倫,熊尚森,余海忠.襄麥冬不同極性部位粗提物抗氧化性能初步評(píng)價(jià)[J].山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報(bào),2013,32(1):87-90

[12]余海忠,阮士龍,劉統(tǒng),等.鄂西北產(chǎn)貓眼草提取物體外抗氧化性及光穩(wěn)定性測(cè)試[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2012,21(4):137-141

[13]嚴(yán)碧歌,趙凱,杜柯.超聲波提取對(duì)麥冬多糖結(jié)構(gòu)和抗氧化活性的影響[J].壓電與聲光,2011,33(6):859-862

[14]趙凱.超聲波對(duì)麥冬多糖的提取率、結(jié)構(gòu)及抗氧化活性的影響[D].西安:陜西師范大學(xué),2011

[15]王小梅,孫潤廣,張靜,等.超聲提取功率對(duì)麥冬多糖結(jié)構(gòu)及抗氧化活性的影響[J].陜西師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版）,2013,41(3):68-75

[16]王艷翠.麥冬化學(xué)和營養(yǎng)成分及其體外活性的研究[D].楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué),2016

[17]李明.麥冬多糖對(duì)訓(xùn)練大鼠免疫及抗氧化功能的影響[J].食品科技,2014,39(8):182-186

[18]張力妮.麥冬多糖的修飾、抗氧化活性以及結(jié)構(gòu)的研究[D].西安:陜西師范大學(xué),2014

[19]陳剛,郭曉蕾,寶麗.銀耳、麥冬、燕麥多糖的抗氧化活性及吸濕保濕性能研究[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2013,31(1):212-214

[20]張婭芳.麥冬多糖的結(jié)構(gòu)分析及其體外抗氧化活性研究[D].西安:陜西師范大學(xué),2007