張玉，張綿松，史亞萍，趙佩佩，王加祥，劉昌衡

（齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院），山東省科學(xué)院生物研究所，山東濟(jì)南250103）

銅藻（Sargassum horneri）又稱“丁香屋”，屬于褐藻綱（Phaeophyceae），墨角藻目（Fulcales），馬尾藻科（Sargassaceae），馬尾藻屬（Sargassum）[1]。銅藻資源主要分布于我國沿海地區(qū)，是我國淺海植被中的珍貴物種，含有多糖、蛋白質(zhì)、褐藻酸、維生素、纖維素、甾醇類化合物等[2]。大量研究發(fā)現(xiàn)銅藻多糖具有抗氧化、抗腫瘤、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能等作用[3]。顧麗霞等研究了銅水提法獲得的銅藻粗多糖的抗氧化能力和免疫調(diào)節(jié)能力[4]。李偉則詳細(xì)的研究了水提法得到的銅藻多糖及其組分的免疫調(diào)節(jié)作用[5]。分析目前的銅藻多糖的研究，大多數(shù)研究均使用水提法獲取銅藻多糖，但是提取過程中褐藻酸、褐藻膠等的存在，導(dǎo)致獲取的銅藻多糖組成復(fù)雜，極性相近，分子量分布較寬，使分離純化銅藻多糖的難度加大，導(dǎo)致銅藻多糖抗氧化活性組分尚不明確，且目前關(guān)于銅藻多糖的分離組分的抗氧化活性的研究報(bào)道較少。

本研究采用2%CaCl2溶液提取銅藻多糖，經(jīng)由DEAE-Sephrose-Fast-Flow分離純化得到銅藻多糖的組分，并分別進(jìn)行紅外光譜分析和單糖結(jié)構(gòu)解析，通過體外抗氧化實(shí)驗(yàn)，比較各個(gè)組分的抗氧化能力，從而獲得銅藻多糖抗氧化活性的功效組分，為從銅藻活性多糖作為天然抗氧化劑及研發(fā)功能食品提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 材料

銅藻：溫州?；⒑Ｔ屦B(yǎng)殖有限公司。

鹽酸、氫氧化鈉、乙醇、甲醇、硫酸、苯酚、三氯乙酸、氯化鐵、水楊酸、過硫酸鉀、鐵氰化鉀、三氯乙酸、氯化鐵、硫酸亞鐵、雙氧水均為分析純：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙腈（有機(jī)試劑）：Fisher公司。

甘露糖、半乳糖、木糖、巖藻糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、DPPH、Trolox、ABTS：Sigma 公司；葡萄糖胺、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）：Aladdin公司；葡萄糖醛酸：上海源葉生物科技有限公司；牛血清蛋白（ABSA）：濟(jì)南朋遠(yuǎn)生物技術(shù)有限公司；考馬斯亮藍(lán)G-250：Klontech公司；維生素C：北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器

JSP-350A高壓多功能粉碎機(jī)：浙江省永康市金穗機(jī)械制造廠；MODEL NO.XX8200230 6-600 RPM 0.1 HP美國組裝超濾機(jī)：Thermo Fisher Scientific；Millipore超濾膜：深圳明盛九州實(shí)業(yè)有限公司；HITACHI高速冷凍離心機(jī)（CR22GIII):湘銳離心機(jī)有限公司；LG-1.5型真空冷凍干燥設(shè)備：沈陽航天新陽速凍設(shè)備制造有限公司；TECAN M200PRO多功能酶標(biāo)儀：上海安景科技有限公司；TU-1810紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；METTLER TOLEDO ME104分析天平：海富來科技有限公司；DK-S26電熱恒溫浴鍋：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司和太倉精密儀器設(shè)備有限公司；DHG-9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；安捷倫1260高效液相色譜儀：上海山儀自動(dòng)化儀表有限公司；紅外光譜儀：費(fèi)爾伯恩實(shí)業(yè)發(fā)展（上海）有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 銅藻粗多糖及其組分的制備

新鮮銅藻洗凈，50℃烘干（水分含量7%以下），粉碎，過60目篩網(wǎng)。稱取1 000 g藻粉，95%的乙醇浸泡過夜，過濾，加入5 L、2%的氯化鈣溶液，60℃提取2h，重復(fù)一次，合并2次濾液，離心（6 000 r/min，20 min），上清液利用超濾的方式進(jìn)行初步的純化，選用100 kDa的濾膜超濾收集，合并大于100 kDa的組分，然后用5 kDa的濾膜進(jìn)行超濾除鹽濃縮，60%的乙醇沉淀，過濾，經(jīng)冷凍干燥得銅藻的高分子多糖 （high molecular poymor，HMP），然后利用DEAE-Sephrose-Fast-Flow 柱純化[6]，以 0～2 mol/L氯化鈉溶液進(jìn)行梯度洗脫，獲得各個(gè)分級(jí)組分。

2.2 硫酸苯酚法測(cè)多糖樣品的總糖含量

采用硫酸苯酚法，以巖藻糖作為標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定樣品的總糖含量[7]。銅藻多糖及其組分樣品按上述步驟測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總糖含量。

2.3 考馬斯亮藍(lán)法測(cè)多糖樣品的蛋白質(zhì)含量

參考Bradford方法測(cè)定多糖樣品中的蛋白質(zhì)含量[8]，以牛血清蛋白（ABSA）為標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定樣品中的蛋白含量。

2.4 紅外光譜分析

稱取10mg以上獲得的各組分多糖，利用傅里葉紅外光譜儀，采用KBr壓片法測(cè)定[9]。

(3)屬性rid表示指代中的照應(yīng)要素(或照應(yīng)事件)的順序編號(hào),屬性anaphor表示指代中的照應(yīng)要素(事件指代標(biāo)注沒有這個(gè)屬性).

2.5 液相色譜分析單糖組成

準(zhǔn)確稱取多糖樣品100 mg于具塞試管中，加入10 mL 1 mol/L H2SO4，于烘箱中100℃水解8 h，水解結(jié)束后，水解液離心，取上清液4.5 mL用2 mol/L NaOH中和至中性，定容至10 mL，離心取上清衍生化。

采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP）柱前衍生法測(cè)定單糖組成[10]，100μL水解樣品加入100μL 0.3 mol/LNaOH和 120 μL 0.5 mol/L PMP甲醇溶液，70℃水浴 1 h，加入100 μL 0.3 mol/L HCl終止反應(yīng)。用 700 μL二氯甲烷萃取，取上層清液，重復(fù)萃取4次。上清過0.22 μm濾膜至液相上樣瓶。配制濃度為10 mg/mL的單糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，按等摩爾比混合。

液相色譜條件：色譜柱為ZORBAX SB-C18（5 μm，4.6×150 mm），流動(dòng)相為乙腈 ∶磷酸鹽緩沖液（17∶83體積比），進(jìn)樣量為 10 μL，流速為 1.0 mL/min，柱溫35℃，紫外檢測(cè)器波長245 nm。將樣品圖譜與單糖標(biāo)準(zhǔn)品圖譜比較，根據(jù)各個(gè)峰的保留時(shí)間判斷單糖種類，然后根據(jù)峰面積計(jì)算摩爾比。

2.6 體外抗氧化活性

2.6.1 DPPH自由基清除活性

DPPH自由基的測(cè)定參照文獻(xiàn)方法[11]，并在此基礎(chǔ)上稍加改進(jìn)。Trolox母液溶液的配制：準(zhǔn)確稱取0.008 g Trolox置于10 mL容量瓶中，先用3 mL乙醇助溶，再加入蒸餾水定容到10 mL。標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制見表1。

表1 Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制Table 1 Standard solutions of Trolox

DPPH自由基清除能力的測(cè)定：將10 μL的Trolox溶液、稀釋到不同的樣品溶液及空白（蒸餾水）加到96孔板中，再加入40 μL新鮮配制的DPPH甲醇溶液（1 mmol/L），混合均勻后加入190 μL的甲醇溶液，200 r/min振搖1 min；在室溫條件下，避光孵育30 min。用酶標(biāo)儀于517 nm波長下檢測(cè)，每個(gè)樣品重復(fù)3次。自由基清除率/%=（A0-AS）/A0×100，式中：AS樣品溶液吸光度值；A0空白溶液吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算DPPH自由基清除能力IC50值。

2.6.2 ABTS+·清除活性

ABTS+·自由基的測(cè)定參照文獻(xiàn)方法[12]，并在此基礎(chǔ)上稍加改進(jìn)。Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制同2.6.1；ABTS+·工作液的配制：將 ABTS+·母液（7 mmol/L）和過硫酸鉀溶液（2.4 mmol/L）等體積混合，室溫放置12 h～16 h。然后用甲醇稀釋至吸光度值穩(wěn)定在0.7±0.02為止，即制成ABTS+工作液。每次實(shí)驗(yàn)都需測(cè)定此吸光度值，如果不在此范圍中，必須進(jìn)行微調(diào)。

2.6.3 還原力測(cè)定

還原力的測(cè)定按照文獻(xiàn)的方法[14]，并稍作改進(jìn)。

準(zhǔn)確量取0.4 mL不同濃度樣品溶液和空白溶液（蒸餾水），再加入 1 mL（0.2 mol/L，pH 6.6）磷酸緩沖液及 1 mL 1%鐵氰化鉀（K3[Fe（CN）6]）溶液，混合均勻后，于50℃水浴孵育20 min；再加入0.5 mL 10%三氯乙酸溶液，室溫孵育10 min。取上述溶液1 mL，加入1 mL蒸餾水和0.2 mL 0.1%氯化鐵溶液，均勻混合，用分光光度計(jì)于700 nm處測(cè)定吸光度值。溶液的吸光度值越高，還原力越強(qiáng)，反之越弱。

2.6.4 超氧陰離子自由基清除能力

本試驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)方法[15]，50 μL不同濃度的樣品溶液以及空白溶液（甲醇），加入1mL 0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH7.4）以及 150 μmol/L的 NBT、60 μmol/L的PMS和468 μmol/L的NADH。25℃反應(yīng)8 min，560 nm處測(cè)定吸光度值。按照下式計(jì)算自由基清除率。自由基清除率/%=（A0-AS）/A0×100，式中：AS為樣品溶液吸光度值；A0為空白溶液吸光度值。根據(jù)Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算超氧陰離子自由基清除能力的IC50值。

3 結(jié)果與分析

3.1 銅藻多糖的純化

銅藻多糖經(jīng)過DEAE-Sephrose-Fast-Flow分離純化后得到4個(gè)組分的氯化鈉梯度洗脫液（如圖1），分別命名為 SF1（0.46mol/L）、SF2（1.0mol/L）、SF3（1.5 mol/L）SF4（1.8 mol/L）。多次試驗(yàn)收集 4個(gè)組分的洗脫液，分別透析除鹽，冷凍干燥后得到SF的四個(gè)組分，考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)均無蛋白質(zhì)，純度達(dá)到95%。

圖1 洗脫曲線Fig.1 The elution curves

3.2 銅藻多糖組分紅外光譜分析

銅藻多糖的四種分級(jí)組分在4000cm-1～500cm-1進(jìn)行掃描，得到圖2：五種分級(jí)組分在3 460 cm-1、2 980 cm-1、1 650 cm-1、1 380 cm-1、1 070 cm-1左右處得到的特征吸收峰可能代表了多糖結(jié)構(gòu)中-O-H的伸縮振動(dòng)、-C-H的伸縮振動(dòng)、-C=O的伸縮振動(dòng)、-C-H的彎曲振動(dòng)和C-O-C或C-O-H中的C-O鍵的彎曲振動(dòng)；2 933 cm-1是C-H的伸縮振動(dòng)吸收峰，1633cm-1可能是酰胺基中的C=O伸縮振動(dòng)，754.6cm-1、842 cm-1處可能是α-吡喃環(huán)的特征吸收。1 090 cm-1～1 260 cm-1處是C-O-C和C-OH的振動(dòng)峰。SF1、SF2、SF3、SF4在1 250 cm-1處的峰增強(qiáng)，可能是由于硫酸根S=O的對(duì)稱伸縮振動(dòng)[16-18]。

3.3 銅藻多糖組分的單糖分析

本文采用PMP柱前衍生高效液相色譜法分析4種銅藻多糖組分的單糖組成[19-20]。試驗(yàn)以甘露糖（Mannose，Man）、葡萄糖胺（Glucosamine，GlcN）、葡萄糖醛酸（Glucuronic acid，GlcA）、半乳糖醛酸（DGalacturonic acid，GalA）、葡萄糖（Glucose，Glc）、半乳糖（Galactose，Gal）、木糖（Xylose，Xyl）、巖藻糖（fucose，F(xiàn)uc）組成的八糖標(biāo)準(zhǔn)品作為對(duì)照品。其中標(biāo)準(zhǔn)品HPLC色譜圖如圖3所示，對(duì)比樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間，并根據(jù)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積計(jì)算各單糖的摩爾比，發(fā)現(xiàn)SF2、SF4中巖藻糖占優(yōu)勢(shì)，占總糖的二分之一以上；SF3中半乳糖占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，都在80%左右。具體的單糖組成及摩爾比見表2。

3.4 抗氧化活性分析

3.4.1 DPPH自由基清除活性

3.4.1.1 Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制見圖4。

圖2 銅藻多糖組分的紅外光譜掃描光譜圖Fig.2 IR spectrum of SF1，SF2，SF3，SF4

圖3 單糖標(biāo)準(zhǔn)品的液相色譜圖Fig.3 HPLC spectrum of standard monosaccharide

表2 銅藻多糖的四個(gè)組分單糖組成Table 2 Monosaccharide composition of SF1，SF2，SF3，SF4

3.4.1.2 銅藻多糖的DPPH自由基的清除活性比較

DPPH自由基在517nm處有最大吸收波長，并呈現(xiàn)穩(wěn)定的紫色。當(dāng)自由基清除劑存在時(shí)，DPPH自由基的單電子由于被配對(duì)，DPPH自由基濃度減小而使其顏色變淺，且顏色變化與配對(duì)電子數(shù)成化學(xué)計(jì)量關(guān)系[21]。通過吸光度得讓變化，可以簡(jiǎn)便、快速的判斷其清除活性，所以被廣泛用于清除自由基物質(zhì)性質(zhì)的研究與天然抗氧化劑的篩選。圖5反映了銅藻多糖及不同組分的DPPH自由基的清除活性，發(fā)現(xiàn)在SF2的效果最好，IC50值為0.499 μg。

圖4 Trolox的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 The standard curve of Trolox

3.4.2 銅藻多糖及組分的ABTS+·清除活性比較

不同濃度的銅藻多糖及組分的ABTS+·清除活性見圖6。

ABTS+·為一穩(wěn)定的有機(jī)自由基，試樣抗氧化能力越強(qiáng)，其提供電子的能力也就越強(qiáng)，與該有機(jī)自由基反應(yīng)量越大，反應(yīng)速率也越快，通過測(cè)定反應(yīng)液吸光度的變化，直接反應(yīng)出樣品抗氧化能力的大小[22]。如圖6所示，隨著濃度的變化，SF2的ABTS+清除活性也在增強(qiáng)，并在達(dá)到一定濃度后，表現(xiàn)出下降趨勢(shì)，其 IC50值為 34.30 μg。

圖5 不同濃度的銅藻多糖及組分的DPPH清除活性Fig.5 The scavenging effect of FS，F(xiàn)S1，F(xiàn)S2，F(xiàn)S3，F(xiàn)S4 with different concentration on DPPH

圖6 不同濃度的銅藻多糖及組分的ABTS+自由基清除活性Fig.6 The scavenging effect of FS，F(xiàn)S1，F(xiàn)S2，F(xiàn)S3，F(xiàn)S4 with different concentration on ABTS+·

3.4.3 銅藻多糖及組分的還原力比較

不同濃度的銅藻多糖及組分的還原力見圖7。通過圖7還原力的比較，可以看出隨濃度的增大，銅藻多糖及組分的還原力越來越強(qiáng)，在同一濃度下，SF2組分的還原力最強(qiáng)。

圖7 不同濃度的銅藻多糖及組分的還原力Fig.7 The effect of FS，F(xiàn)S1，F(xiàn)S2，F(xiàn)S3，F(xiàn)S4 with different concentration on reducing power

3.4.4 銅藻多糖及組分的超氧陰離子自由基清除活性

不同濃度的銅藻多糖及組分對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用見圖8。

圖8 不同濃度的銅藻多糖及組分對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用Fig.8 The scavenging effect of FS，F(xiàn)S1，F(xiàn)S2，F(xiàn)S3，F(xiàn)S4 with different concentration on O2-

超氧陰離子自由基（O2·）是生物體內(nèi)所有氧自由基中的第一個(gè)自由基，可以經(jīng)過一系列反應(yīng)生成其他的氧自由基，引起脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的改變[23]。利用PMS及NADH作用產(chǎn)生超氧陰離子，而超氧陰離子會(huì)進(jìn)一步將NBT還原并在波長560 nm處具有強(qiáng)吸光度，根據(jù)吸光度值可以判定樣品清除超氧陰離子的能力。圖8可以看出在一定濃度下銅藻多糖及組分的超氧陰離子自由基清除活性明顯增強(qiáng)，其IC50值為18.987 μg。

4 結(jié)論

在評(píng)價(jià)抗氧化能力的方法中，DPPH自由基清除能力、抗脂質(zhì)過氧化能力、O2-自由基清除能力為判定多糖是否具有抗氧化能力的重要指標(biāo)[24]，試驗(yàn)結(jié)果表明該多糖在離體條件下具有較好的自由基清除能力、抗脂質(zhì)過氧化能力和O2-自由基清除能力，并通過Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出IC50值。銅藻多糖及組分在體外對(duì)活性氧自由基均有清除作用，證明多糖能夠清除體內(nèi)產(chǎn)生的過多氧自由基，是通過阻斷體內(nèi)自由基反應(yīng)鏈的發(fā)揮作用，通過純化手段得到的銅藻多糖組分SF的體外抗氧化活性較未純化前的效果更好。因此銅藻多糖組分有待于開發(fā)為一種抗氧化、防衰老的藥品、食品或化妝品。

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