郭穎慧，鄭世超，霍勝楠

（山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東濟(jì)南250101）

近年來，我國食品業(yè)進(jìn)入了飛速發(fā)展的黃金時期，禽畜類肉制品及其制品豐富了廣大人民群眾的餐桌，然而狐貍?cè)?、馬肉冒充牛肉、驢肉等事件不斷出現(xiàn)，對我國動物源性食品產(chǎn)業(yè)發(fā)展產(chǎn)生了極大的誠信危機(jī)，對食品安全性日常監(jiān)管、檢測技術(shù)提出了新的挑戰(zhàn)。當(dāng)前，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）為基礎(chǔ)的核酸檢測技術(shù)在動物源性成分檢測方法上日趨成熟。PCR技術(shù)主要是通過熱循環(huán)，實(shí)現(xiàn)對目的基因片段的大量擴(kuò)增。因其具有快速、靈敏、特異性高等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于食品成分摻假鑒別檢測中[1]。意大利研究者利用PCR技術(shù)檢測牛線粒體脫氧核糖核酸（Deoxyribose Nucleic Acid，DNA）片段以檢測動物源性飼料中牛源性成分并對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序確證，檢測靈敏度可達(dá)0.125%[2]，美國也建立了應(yīng)用PCR技術(shù)快速檢測動物源性飼料中牛源性成分的方法[3]。

在應(yīng)用PCR方法進(jìn)行動物源性成分檢測時，通常需要陽性材料作為質(zhì)控對照。然而，典型的陽性材料經(jīng)常難以獲取，而附有證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)由于生產(chǎn)工藝復(fù)雜、價格昂貴等問題，已成為檢測方法建立和應(yīng)用的瓶頸[4]。為了解決這一難題，眾多機(jī)構(gòu)都在研究用陽性質(zhì)粒分子替代基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[5]。陽性質(zhì)粒分子具有很多優(yōu)點(diǎn)：1）可以根據(jù)需要進(jìn)行設(shè)計，同一個標(biāo)準(zhǔn)分子可以同時包含多個外源目的基因；2）不需要煩瑣的動物基因提取和分子鑒定；3）可以通過微生物進(jìn)行大量培養(yǎng)，容易操作和保存；4）質(zhì)粒DNA純度較高；5）在轉(zhuǎn)基因定量PCR檢測過程中，陽性質(zhì)粒分子根據(jù)分子量大小與動物基因組DNA分子換算，也可以完成樣品的定量分析[6]。

試劑盒作為一種新型快速檢測分析方法，其作為商品化定型產(chǎn)品的屬性被長期忽略，多數(shù)試劑盒產(chǎn)品并非等同國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)檢測技術(shù)指標(biāo)，尤其是以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的分子生物技術(shù)在試劑盒研發(fā)中的廣泛使用，使試劑盒的應(yīng)用、結(jié)果判定工作缺乏標(biāo)準(zhǔn)化、令人信服的技術(shù)依據(jù)，相應(yīng)的評價技術(shù)研究和發(fā)展普遍滯后于檢測技術(shù)。本研究針對以上存在問題，完成了狐貍、驢、馬檢測陽性質(zhì)粒分子的構(gòu)建，進(jìn)行了方法特異性、靈敏度的驗(yàn)證，同時對國內(nèi)3種品牌DNA聚合酶檢測效果進(jìn)行對比。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒的合成

通過NCBI網(wǎng)站BLAST序列比對分析，選擇狐貍線粒體色素氧化酶I亞基基因（COI）、驢線粒體ATPase6基因、馬線粒體ATPase6基因特異序列[7-9]，合成DNA序列，鏈接pGEM-T Easy載體，構(gòu)建相應(yīng)陽性質(zhì)粒DNA分子。序列合成由濟(jì)南博尚生物技術(shù)有限公司完成。

1.1.2 實(shí)時熒光PCR檢測引物、探針的合成

通過NCBI網(wǎng)站BLAST序列比對分析，選擇狐貍線粒體色素氧化酶I亞基基因（COI）、驢線粒體ATPase6基因、馬線粒體ATPase6基因特異序列，合成引物、探針[7-9]。序列合成由濟(jì)南博尚生物技術(shù)有限公司完成。

1.1.3 實(shí)時熒光PCR檢測試劑的選購

DNA 聚合酶：BioFlux公司 BioReady rTaq、TIANGEN 公司 Taq DNA Polymerase（Mg2+free）、TaKaRa公司 TaqTM（with Mg2+free Buffer）；dNTP、PCR 反應(yīng)預(yù)混液：BioFlux公司、TIANGEN公司、TaKaRa公司。檢測用其他試劑，均為分析純。

1.2 主要儀器

NanoDrop 2000c紫外可見分光光度計：美國Thermo公司；7500 FAST實(shí)時熒光PCR儀：美國ABI公司；5424R小型臺式冷凍離心機(jī)：德國Eppendorf公司。

1.3 實(shí)時熒光PCR檢測

1.3.1 狐貍成分檢測實(shí)時熒光PCR法反應(yīng)體系

體積為 25 μL，樣品 DNA（10 μg/mL～100 μg/mL）2 μL，狐貍引物各（10 μmol/L）0.5 μL，狐貍探針（10 μmol/L）0.5 μL，Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）0.3 μL，dNTP（各 2.5 mmol/L）2 μL，10×PCR 緩沖液 2.5 μL，水16.7 μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性 2 min；95℃變性15 s，60℃退火40 s，60℃收集熒光，45個循環(huán)。

1.3.2 驢成分檢測實(shí)時熒光PCR法反應(yīng)體系

體積為25 μL，包括實(shí)時熒光PCR反應(yīng)混合液12.5 μL（DNA 聚合酶 2 U，熒光 PCR 緩沖液，Mg2+2.5 mmol/L，dNTP0.25mmol/L）。引物對及探針（10nmol/L）各 1 μL，模板 DNA（100 ng±50 ng）2 μL，補(bǔ)足雙蒸水。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性30 s；94℃變性30 s，60℃退火40 s，60℃收集熒光，40個循環(huán)。

1.3.3 馬成分檢測實(shí)時熒光PCR法反應(yīng)體系

體積為25 μL，包括實(shí)時熒光PCR反應(yīng)混合液12.5 μL（DNA 聚合酶 2 U，熒光 PCR 緩沖液，Mg2+2.5 mmol/L，dNTP 0.25mmol/L）。引物對及探針（10 nmol/L）各 1 μL，模板 DNA（100 ng±50 ng）2 μL，補(bǔ)足雙蒸水。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性30 s；94℃變性30 s，60℃退火40 s，60℃收集熒光，40個循環(huán)。

試驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用ABI 7500 FAST Software v2.0.1進(jìn)行分析處理。依據(jù)不同標(biāo)準(zhǔn)判定CT值小于或等于35的擴(kuò)增陽性結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 陽性質(zhì)粒分子檢測方法特異性驗(yàn)證

按照1.3方法，對所構(gòu)建的狐貍、驢、馬陽性質(zhì)粒分子進(jìn)行特異性驗(yàn)證，同時選取狐貍?cè)狻ⅢH肉、馬肉基因組DNA作為陽性對照品，雞肉基因組DNA作為陰性對照品，水作為空白對照，進(jìn)行3種陽性質(zhì)粒分子特異性驗(yàn)證。檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所構(gòu)建的3種質(zhì)粒分子均可以作為實(shí)時熒光PCR反應(yīng)陽性對照品來使用，方法特異性良好（圖1～圖3）。

2.2 陽性質(zhì)粒分子檢測方法靈敏度驗(yàn)證

將3種陽性質(zhì)粒分子按10倍遞增逐級稀釋，自100 ng/μL濃度稀釋至10-4ng/μL，分別做方法靈敏度驗(yàn)證（圖 4～圖 6）。

圖1 陽性質(zhì)粒分子檢測方法特異性驗(yàn)證結(jié)果（狐貍）Fig.1 Results of the specificity of positive plasmid（fox）

圖2 陽性質(zhì)粒分子檢測方法特異性驗(yàn)證結(jié)果（驢）Fig.2 Results of the specificity of positive plasmid（donkey）

圖3 陽性質(zhì)粒分子檢測方法特異性驗(yàn)證結(jié)果（馬）Fig.3 Results of the specificity of positive plasmid（horse）

檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)3種質(zhì)粒濃度從100 ng/μL～10-4ng/μL時，均可在40個循環(huán)內(nèi)出現(xiàn)實(shí)時熒光PCR顯著擴(kuò)增曲線。

一般認(rèn)為，當(dāng)檢測Ct值小于35時可判斷實(shí)時熒光PCR檢測結(jié)果為陽性，以能夠測出樣品最低模板濃度為相應(yīng)反應(yīng)的檢測下限[10]。因此，狐貍、驢、馬陽性質(zhì)粒分子的檢測方法靈敏均為10-4ng/μL。

2.3 3種品牌DNA聚合酶實(shí)時熒光PCR反應(yīng)效果比較

將3種陽性質(zhì)粒分子按10倍遞增逐級稀釋，自100 ng/μL 濃度稀釋至 10-4ng/μL，分別選取 BioFlux公司BioReady rTaq、TIANGEN公司Taq DNA Polymerase（Mg2+free）、TaKaRa 公司 TaqTM（with Mg2+free Buffer）DNA聚合酶及其配套實(shí)時熒光PCR檢測試劑，進(jìn)行實(shí)時熒光PCR反應(yīng)效果比較分析，結(jié)果見圖7～圖9。

圖4 陽性質(zhì)粒分子檢測方法靈敏度驗(yàn)證結(jié)果（狐貍）Fig.4 Results of the sensitivity of positive plasmid（fox）

圖5 陽性質(zhì)粒分子檢測方法靈敏度驗(yàn)證結(jié)果（驢）Fig.5 Results of the sensitivity of positive plasmid（donkey）

圖6 陽性質(zhì)粒分子檢測方法靈敏度驗(yàn)證結(jié)果（馬）Fig.6 Results of the sensitivity of positive plasmid（horse）

檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)3種質(zhì)粒濃度從100 ng/μL～1 ng/μL時，3個品牌DNA聚合酶實(shí)時熒光PCR檢測體系均可在40個循環(huán)內(nèi)出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線?？傮w上所有曲線的拐點(diǎn)清楚，指數(shù)增長期明顯，基線平穩(wěn)無上揚(yáng)現(xiàn)象[11]。曲線指數(shù)期斜率大，表明擴(kuò)增效率高，實(shí)際靈敏度、引物和探針效果好[12]；擴(kuò)增曲線的整體平行性好，重復(fù)性好，相鄰濃度標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線與曲線之間的間距都十分接近，是擴(kuò)增效率都高的反應(yīng)。且圖中，基線起峰范圍適當(dāng)，各檢測結(jié)果都在12～35之間，保證了定量的準(zhǔn)確性[11]。

圖7 3種品牌DNA聚合酶狐貍陽性質(zhì)粒實(shí)時熒光PCR反應(yīng)效果比較Fig.7 Comparation of the effective of real-time fluorescence PCR reaction of three brands of DNA polymerase for fox

圖8 3種品牌DNA聚合酶驢陽性質(zhì)粒實(shí)時熒光PCR反應(yīng)效果比較Fig.8 Comparation of the effective of real-time fluorescence PCR reaction of three brands of DNA polymerase for donkey

圖9 3種品牌DNA聚合酶馬陽性質(zhì)粒實(shí)時熒光PCR反應(yīng)效果比較Fig.9 Comparation of the effective of real-time fluorescence PCR reaction of three brands of DNA polymerase for horse

根據(jù)圖 7 結(jié)果，分別利用 BioFlux、TaKaRa、TIANGEN公司DNA聚合酶進(jìn)行實(shí)時熒光PCR反應(yīng)，狐貍陽性質(zhì)粒實(shí)時熒光PCR檢測重復(fù)性較好，靈敏度的檢出下限分別為 1、10-4、10-2ng/μL，顯然，TaKaRa 公司DNA聚合酶的檢出限最低，靈敏度最高，而TIANGEN公司的DNA聚合酶相對于其他兩種品牌聚合酶反應(yīng)效率有一定的波動性。

分別用BioFlux、TaKaRa、TIANGEN公司DNA聚合酶進(jìn)行實(shí)時熒光PCR反應(yīng)，驢陽性質(zhì)粒實(shí)時熒光PCR檢測重復(fù)性好，靈敏度的檢出下限分別為10-1、10-2、10-2ng/μL。因此，3個品牌公司的DNA聚合酶靈敏度與反應(yīng)效率均相差不大，TaKaRa、TIANGEN公司的DNA聚合酶比BioFlux公司的DNA聚合酶檢出下限低一個濃度梯度，且在質(zhì)粒模板含量為10-2ng/μL時，TaKaRa公司的DNA聚合酶反應(yīng)效率高于TIANGEN公司的DNA聚合酶反應(yīng)效率。

分別利用 BioFlux、TaKaRa、TIANGEN 公司 DNA聚合酶進(jìn)行實(shí)時熒光PCR反應(yīng)，馬陽性對照質(zhì)粒實(shí)時熒光PCR檢測靈敏度的檢出下限分別為1、10-3、10-1ng/μL?？梢?，TaKaRa公司DNA聚合酶的檢出限最低，靈敏度高于BioFlux與TIANGEN公司的DNA聚合酶，并且，TIANGEN公司的DNA聚合酶靈敏度高于 BioFlux公司的 DNA聚合酶靈敏度，TaKaRa、BioFlux公司的DNA聚合酶重復(fù)性與反應(yīng)效率略優(yōu)于TIANGEN公司的DNA聚合酶。

3 討論與結(jié)論

高質(zhì)量的PCR反應(yīng)液是進(jìn)行基因檢測和研究的前提。近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)在食品檢測方面的廣泛應(yīng)用[13]，各大實(shí)驗(yàn)室和研究機(jī)構(gòu)都積極致力于靈敏度更高、效率更高、更準(zhǔn)確的實(shí)時熒光PCR反應(yīng)。本研究構(gòu)建了狐貍、驢、馬源性成分檢測的3種陽性質(zhì)粒分子，對3種質(zhì)粒分子的方法特異性、靈敏度進(jìn)行了驗(yàn)證，并對其關(guān)鍵技術(shù)指標(biāo)-PCR反應(yīng)液進(jìn)行了驗(yàn)證，對比不同廠家PCR反應(yīng)液實(shí)時熒光PCR反應(yīng)效率，驗(yàn)證快速檢測方法的靈敏度、特異性、重復(fù)性、與現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定方法一致性等關(guān)鍵指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)，3種廠家的實(shí)時熒光PCR反應(yīng)液均有較高的重復(fù)性和特異性，對于不同的陽性質(zhì)粒，不同品牌的DNA聚合酶在不同反應(yīng)中表現(xiàn)出不同的優(yōu)勢，總體來說，TaKaRa品牌的反應(yīng)液靈敏度要高于TIANGEN與BioFlux品牌的靈敏度。出現(xiàn)該結(jié)果的原因，除了不同品牌質(zhì)量參差不一，還可能由于以下原因造成：1）3種陽性質(zhì)粒的熒光定量PCR反應(yīng)體系中各組分終濃度不同，比如在以狐貍質(zhì)粒為模板的PCR反應(yīng)中，Taq DNA聚合酶的活力要求為 5 U/μL 取 0.3 μL（即 1.5U），而以驢、馬質(zhì)粒為模板的PCR反應(yīng)中，DNA聚合酶活力要求為2U；2）3種陽性質(zhì)粒的熒光定量PCR反應(yīng)條件不同；3）作為模板，3種陽性質(zhì)粒狐貍、驢、馬本身質(zhì)粒片段大小與長度不同。因此，為避免誤判，在進(jìn)行分子實(shí)驗(yàn)前需進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化組合，選擇滿足實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定要求的DNA反應(yīng)液進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。本研究結(jié)果為進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR的反應(yīng)液選擇提供了一定的依據(jù)，可促進(jìn)檢驗(yàn)基礎(chǔ)薄弱、技術(shù)能力有限的食品檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)動物源性成分檢測能力的提升，研究成果的應(yīng)用推廣將對保障我國食品安全監(jiān)督監(jiān)管發(fā)揮重要的作用，對于肉及肉制品中動物源性成分準(zhǔn)確可靠的鑒定具有重要意義和應(yīng)用前景。

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[9]中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.SN/T 3730.5-2013食品及飼料中常見畜類品種的鑒定方法第5部分:馬成分檢測實(shí)時熒光PCR法[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2014:1-5

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