曾 力 綜述，吳永忠，翁克貴 審校

(重慶大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院/重慶市腫瘤研究所/重慶市腫瘤醫(yī)院 400030)

目前，肺癌的主要治療手段包括手術(shù)、靶向治療、免疫治療、化療、放療等[1]，在治療前通常需要有明確的組織學(xué)或細胞學(xué)診斷才能更好地實現(xiàn)精準治療。近年來，隨著腫瘤分子生物學(xué)研究的快速發(fā)展，新一代“液體活檢”成為目前關(guān)注的焦點，其中檢測血液中的ctDNA在腫瘤的診斷、治療及預(yù)后評估監(jiān)測等方面開始發(fā)揮重要作用[2]。其標(biāo)本采用外周血，具有微創(chuàng)、方便、經(jīng)濟、快速、可重復(fù)性高等優(yōu)勢，適合臨床應(yīng)用。

1ctDNA的生物學(xué)特征

循環(huán)游離DNA(circulating free DNA,cfDNA)是血液的組成部分之一，可以從血漿中分離出來[3]。cfDNA不僅可在惡性腫瘤的患者外周血中檢測到，同時也可以在健康人、非惡性疾病患者中發(fā)現(xiàn)，如紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肺栓塞、侵入性治療措施、孕婦等[4]，ctDNA是由腫瘤細胞壞死、凋亡后分泌釋放的一種游離DNA，其基因組信息與腫瘤組織一致，代表來自原發(fā)性腫瘤和轉(zhuǎn)移灶的組合遺傳物質(zhì)，其片段的大小約為166 bp[5]。當(dāng)癌細胞大量播散和壞死時，釋放出來的核酸超過機體的清除力，所以惡性腫瘤患者體內(nèi)cfDNA的含量高于健康人。有研究表明，健康人體內(nèi)的cfDNA含量非常少，1～100 μg/L，平均約30 μg/L。而腫瘤患者體內(nèi)的cfDNA含量可達到1 000 μg /L，平均約180 μg/L。除此以外，外傷、鍛煉、心肌梗死、終末期腎衰等也會使血液中cfDNA含量增加[4,6-8]。

2ctDNA的檢測

一般認為，ctDNA與健康人cfDNA的區(qū)別就在于ctDNA有體細胞基因突變，而這些突變僅存在于癌前細胞或者癌細胞基因組中，在同一機體內(nèi)，它不會出現(xiàn)在其他正常細胞的DNA，因此用于檢測體細胞變異體DNA的方法也能用于ctDNA的檢測[6]。隨著DNA 測序技術(shù)的快速發(fā)展，通過現(xiàn)有檢測手段如突變擴增阻滯系統(tǒng)(ARMS)、數(shù)字PCR(dPCR)、新一代測序(NGS)等可以實現(xiàn)對ctDNA進行直接定性定量分析，通過DNA擴增對ctDNA進行精確檢測[3]。ARMS、dPCR靈敏度高，據(jù)研究顯示，其檢測ctDNA部分突變基因與通過組織活檢發(fā)現(xiàn)的突變基因相一致，而NGS可以對多基因核酸片段進行高通量平行深度測序，檢測出極其罕見的突變基因，但該技術(shù)卻不能直接檢測天然DNA中的堿基修飾[9-11]。目前尚在研發(fā)中的一種新興測序技術(shù)，即因態(tài)納米孔測序技術(shù)，又被稱為第四代DNA測序技術(shù)，該技術(shù)借助純物理學(xué)方法，不需要利用光信號及生化預(yù)處理材料，而是利用不同的堿基通過納米孔時產(chǎn)生的電信號變化直接進行測序，具有高讀長、易集成、省時間等優(yōu)勢[12-13]。

3 檢測ctDNA的優(yōu)勢

目前，腫瘤組織活檢是臨床研究測序的主要方法，但腫瘤組織的獲取過程為有創(chuàng)性操作，部分患者在操作后可能出現(xiàn)嚴重并發(fā)癥，患者接受度低，此外，獲得的組織標(biāo)本是通過福爾馬林固定石蠟包埋的方式進行保存，可能出現(xiàn)DNA被降解的情況。另外，由于腫瘤的異質(zhì)性，即便是在同一個體中，其體內(nèi)轉(zhuǎn)移灶與原發(fā)灶的腫瘤細胞共有的突變可能僅占三分之一[14]。由此可見，組織活檢用于診斷腫瘤不僅不能達到百分之百的準確率，還有可能對機體造成損傷。而檢測血液中的ctDNA即“液體活檢”，比組織活檢更快，更容易重復(fù)，可以獲取關(guān)于癌癥的實時信息，指導(dǎo)臨床治療方案的選擇，它提供的信息更全面，具有經(jīng)濟、快捷、方便、微創(chuàng)等特點，更能實現(xiàn)對腫瘤進展的實時跟蹤。組織活檢獲得的癌癥信息是靜態(tài)的，而液體活檢技術(shù)更能及時、有效的反映治療過程中腫瘤的動態(tài)變化情況。采用外周血作為標(biāo)本，操作容易實現(xiàn)，可重復(fù)多次采血，從而實時監(jiān)測治療反應(yīng)的動態(tài)變化[7,15]。

4ctDNA在非小細胞肺癌中的應(yīng)用

鑒于臨床病理特征在非小細胞肺癌中應(yīng)用的局限及腫瘤固有分子生物學(xué)特征的巨大差異，從分子生物學(xué)角度尋找用于非小細胞肺癌耐藥監(jiān)測、預(yù)后評估、微小殘留灶追蹤、復(fù)發(fā)監(jiān)測等的新生生物學(xué)指標(biāo)成為了目前關(guān)注的焦點[16]。盡管液體活檢應(yīng)用于臨床還未獲得批準，但相關(guān)研究已顯示出其巨大的應(yīng)用價值。

4.1靶向藥物用藥指導(dǎo)及耐藥監(jiān)測 單個基因改變可指導(dǎo)臨床靶向治療，如結(jié)腸腫瘤患者存在KRAS基因突變將對EGFR-TKI產(chǎn)生耐藥[17]，非小細胞肺癌患者有ALK 重排會對克里唑替尼產(chǎn)生耐藥[18]，黑色素瘤患者存在BRAF突變可能對維羅非尼產(chǎn)生耐藥[19]。研究顯示，高水平KRAS基因突變對結(jié)直腸腫瘤患者進行西妥昔單抗、伊立替康治療起到很好的指示作用[20]。

根據(jù)NCCN指南推薦，靶向治療是目前非小細胞肺癌治療方案的首選，但很多患者在服藥過程中相繼出現(xiàn)耐藥。近年來，大量研究表明液體活檢可以有效地監(jiān)測到治療過程中出現(xiàn)的耐藥基因，如EGFR-T790M，攜帶有該基因的患者超過半數(shù)會對靶向藥物產(chǎn)生繼發(fā)性耐藥[21]。利用ctDNA 檢測技術(shù)，有學(xué)者[22]對接受EGFR抑制劑類藥物治療的癌癥患者進行耐藥性靶點的檢測發(fā)現(xiàn)，KRAS基因出現(xiàn)了40余種與耐藥相關(guān)的基因突變。ZHENG等[23]對318例進行EGFR-TKI靶向治療的非小細胞肺癌患者進行觀察，通過檢測ctDNA發(fā)現(xiàn)約36%(117例)患者存在耐藥，約47%(55例)患者發(fā)生T790M突變。

4.2預(yù)后評估 預(yù)后評估主要根據(jù)影像學(xué)資料、參考其他輔助檢查，再結(jié)合臨床表現(xiàn)、疾病分期、組織病理學(xué)及分子生物學(xué)特征等因素進行綜合判斷，而這些信息多從影像資料及活檢標(biāo)本中得到。影像學(xué)檢查價格昂貴、對人體有輻射；組織切片通常不易獲得且為有創(chuàng)檢查，患者接受度相對較低。而“液體活檢”用于預(yù)后評估，微創(chuàng)、方便、經(jīng)濟、快速，進行DNA分析是監(jiān)測腫瘤基因組實時變化的一種有效手段，是對組織活檢分子領(lǐng)域的重要補充[15]。

在一項對246例接受一線靶向治療的晚期非小細胞肺癌患者進行多變量分析中發(fā)現(xiàn)，檢測到KRAS突變的患者預(yù)后相對較差[24]。有研究顯示，ctDNA也可用于乳腺癌的預(yù)后評估，它采用的方法是全基因組測序，選取了30例攜帶有Tp53基因、PIK3CA基因突變的患者進行觀察并監(jiān)測其治療過程中ctDNA的動態(tài)變化,他們發(fā)現(xiàn)，該變化與術(shù)后效果一致，療效越好，ctDNA含量越低[14]。另一項在胰腺癌中的研究發(fā)現(xiàn)，存在KRAS基因突變與不存在KRAS基因突變的患者相比生存率更低，半年生存率比為17%∶41%，1年生存率比為0%∶24%[25]。

4.3追蹤微小殘留病灶 ctDNA可用于探測經(jīng)手術(shù)或藥物治療后疾病的復(fù)發(fā)。目前監(jiān)測疾病復(fù)發(fā)的主要手段是放射影像學(xué)檢查，其價格昂貴對人體有輻射，對于微小轉(zhuǎn)移灶不易檢測出。HABER等[9]在監(jiān)測結(jié)直腸腫瘤患者術(shù)后血液中腫瘤的特定基因如APC、TP53、KRAS的研究中發(fā)現(xiàn)，ctDNA預(yù)測復(fù)發(fā)的靈敏度和特異度接近100%。另一項研究對55例乳腺癌早期患者經(jīng)手術(shù)、化療等治療后血液中ctDNA 的變化進行監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，治療后血液中ctDNA陽性患者較ctDNA陰性患者復(fù)發(fā)率高，可達12倍左右，而且在復(fù)發(fā)前8個月已經(jīng)可以在血液中檢測到ctDNA[26]。此外，在慢性淋巴細胞白血病的治療中，檢測ctDNA對微小殘留病進行評估，可以大致預(yù)測無進展生存期和總生存率[27]。

4.4評估腫瘤負荷，實時監(jiān)測治療反應(yīng)及腫瘤演變 MURTAZA等[28]研究指出，ctDNA可用于追蹤腫瘤負荷，監(jiān)測癌癥基因組，在這項研究中，他們追蹤了1例3年內(nèi)接受兩線靶向治療(他莫昔芬和曲妥珠單抗)的ER、HER2均為陽性的轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者，應(yīng)用深度擴增子測序的方法分析了8例腫瘤活檢標(biāo)本和9例血漿標(biāo)本，結(jié)果表明，血漿標(biāo)本中的突變水平反映了由腫瘤活組織檢查測序所推斷的克隆層級，此外，在治療期間，體細胞突變的連續(xù)變化與腫瘤疾病進展、轉(zhuǎn)移部位之間的不同治療反應(yīng)均有相關(guān)性，這些結(jié)果來自單個轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者，表明ctDNA反映了克隆性腫瘤分級，并實時捕獲亞克隆的動態(tài)變化。

4.5觀察疾病治療抗性及復(fù)發(fā) FIALA等[29]研究隊列由被診斷患有早期非小細胞肺癌的100例患者組成，并進行手術(shù)切除腫瘤，使用手術(shù)切除的腫瘤標(biāo)本與健康組織來進行基因蛋白質(zhì)編碼區(qū)域測序，隨后比較二者的序列，鑒定遺傳差異，特別是單核苷酸變體(SNV)，每人測試10～32個SNV，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SNV在腫瘤發(fā)展早期發(fā)現(xiàn)，與腫瘤異質(zhì)性無關(guān)，在腫瘤前平均70 d從ctDNA測試結(jié)果中就可以觀察到治療抗性及復(fù)發(fā)，且ctDNA SNV突變頻率與腫瘤大小相關(guān)。

5 小 結(jié)

盡管ctDNA作為一種應(yīng)用前景廣闊的無創(chuàng)性“液體活檢”手段，對癌癥特異性分子改變的研究有著重大潛力，但仍處于起步階段，要真正應(yīng)用于臨床仍需克服諸多困難。(1)檢測靈敏度，目前沒有足夠的靈敏度來對無癥狀個體的肺癌進行檢測；(2)成本和時間，從單個基因組區(qū)域測序到創(chuàng)建特定的腫瘤特征，再進行“液體活檢”測試，最后由專業(yè)人士對大量數(shù)據(jù)進行分析，過程費用昂貴，等待時間較長；(3)即使檢測出ctDNA，也不能區(qū)分它是來源于原發(fā)灶還是轉(zhuǎn)移灶，其代表轉(zhuǎn)移異質(zhì)性的程度未知；(4)即使檢測到腫瘤基因出現(xiàn)耐藥突變或者出現(xiàn)了新的突變基因，但如果沒有研究出相應(yīng)藥物，依然束手無策。因此，ctDNA廣泛應(yīng)用于臨床除了需要檢測流程的標(biāo)準化外，還需要大量相關(guān)臨床試驗的進一步驗證。