陳華萬 綜述，張健偉，蘆 斌，吳順龍△ 審校

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤科 400016;2．陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科，重慶 400038;3．重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院放射科 400016)

2-ME是雌二醇(17β-estradiol,E2)在體內(nèi)的生理代謝產(chǎn)物。原始的觀點認(rèn)為E2代謝物是不具有活性的。然而最近研究發(fā)現(xiàn)2-ME是E2代謝物中惟一具有抗腫瘤效應(yīng)的代謝物，其具有抑制腫瘤細胞增殖、細胞周期阻滯、促凋亡與自噬、抑制血管形成等抗腫瘤效應(yīng)，因而得到了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。2-ME正作為一種很有前景的抗腫瘤藥物進行臨床評估中。

1 2-ME的生物合成及藥理學(xué)特點

雌激素是由膽固醇經(jīng)一系列的生化反應(yīng)形成，然而其直接前體是雄激素，如睪酮。雌激素表達于靶器官(乳腺、子宮、卵巢、胎盤等)中，在這些靶器官中E2代謝失活或者產(chǎn)生重要的生化功能。E2由雄烯二酮和睪酮經(jīng)17β膽固醇脫氫酶合成。然后，E2經(jīng)細胞色素P450羥基化，E環(huán)的2、4、16位羥基化能分別形成2-hydroxyestradiol(2-OHE2)、4-hydroxyestradiol(4-OHE2)和 16-hydroxyestradiol (16-OHE2)。隨后，新合成的鄰苯二酚雌激素被鄰苯二酚氧甲基轉(zhuǎn)移酶(catechol-O-methyl transferase,COMT)甲基化，分別形成2,4,16甲氧基雌二醇。因細胞色素P450及COMT廣泛存在于人體內(nèi)各器官中,如肝、腎等,所以諸多組織中均可合成2-ME,但其在不同組織中具體濃度尚不清楚[1]。

在正常的生理條件下，2-ME在血漿中的濃度為10～37 pg/mL。男性、女性及孕婦血漿中2-ME的生理濃度分別為10～35、18～138、216～10 690 pg/mL。大量基礎(chǔ)和臨床的研究都表明2-ME的濃度需要達到微摩爾水平才能產(chǎn)生抗腫瘤效應(yīng)，懷孕期間2-ME能達到血液循環(huán)濃度的最高水平(2～10 ng/mL)。因此2-ME 的生理濃度遠低于它的效應(yīng)水平[1]。

2-ME存在于血液中，半衰期較短(1～2 d)。人體內(nèi)的2-ME最終隨著尿液排出到體外。體內(nèi) 2-ME 的肝臟清除率高達712 mL/min,約為人體肝臟血流量的一半,所以首過代謝作用在2-ME的體內(nèi)分布中起著重要作用。在腫瘤治療過程中，為達到良好的治療效果，患者常需大劑量服用2-ME[2]。

2-ME與雌激素受體 α、β 的親和力分別是E2的1/500和1/3 200，且雌激素受體激動劑和拮抗劑對其作用無影響,表明2-ME并非通過影響雌激素受體通路起作用，所以2-ME臨床治療并不會引起雌激素依賴型疾病，如乳腺癌等[3]。

2 2-ME的抗癌功能與機制

2.1抗增殖與微管紊亂、細胞周期阻滯、促進增殖抑制因子的合成 2-ME在多種腫瘤細胞株的體外實驗中表現(xiàn)出顯著的細胞毒性：乳腺癌(MCF-7、MDAMB-231、MDAMB435、ZR-75、T-47D)，肺癌(A549、H460、HOP64)，卵巢癌(OVCAR-3)，前列腺癌(LNCaP、DU-145)，胰腺癌(PaTu8902、PaTu8988s、PaTu8988t)，胃癌(SC-MI、NUGC-3)，宮頸癌(HeLa、HeLaS3)等[4]。研究表明其抗增殖效應(yīng)的機制主要與微管紊亂、細胞周期阻滯和促進增殖抑制因子的合成等相關(guān)。

2-ME抗增殖的特點與它對微管蛋白聚合的影響相關(guān)。微管系統(tǒng)對細胞的增殖舉足輕重，是目前很好的抗癌藥的生物靶點，如紫杉醇、長春花堿和秋水仙堿[4]。最近的結(jié)構(gòu)活性分析表明，抑制微管聚合是2-ME抗增殖的主要分子機制。有研究表明2-ME在試管內(nèi)高濃度時可抑制微管聚合而抑制腫瘤生長，通過結(jié)合微管蛋白的秋水仙堿結(jié)合位點從而導(dǎo)致細胞周期阻滯。2-ME是秋水仙堿的一種競爭性抑制劑，其KI值為22M[5]。

2-ME的抗增殖活性還與細胞周期阻滯密切相關(guān)。2-ME在高分化的食管癌細胞株EC9706中具有抗癌效應(yīng)，發(fā)生G2/M期阻滯，增加細胞周期蛋白B1(cyclin B1)和原癌基因c-Myc蛋白水平。在多種雄激素依賴LNCaP和非依賴DU-145和PC-3的前列腺癌細胞中2-ME能增強S期和G2/M期細胞的累積[4]。

此外，還有研究表明2-ME可以通過抑制如一氧化氮(NO)、環(huán)磷酸腺苷(cAMP)、環(huán)前列腺素等促進增殖因子的合成,或降低如內(nèi)皮素-1、兒茶酚胺等合成進而抑制腫瘤細胞增殖。

2-ME的抗腫瘤增殖效應(yīng)不依賴于雌激素受體途徑。2-ME對ER陰性或陽性乳腺癌細胞均具有濃度依賴的抗增殖效應(yīng)，包括ER陰性細胞MDA-MB-231和MDA-MB-435，ER陽性細胞MCF-7和T-47D等[6]。另一方面，2-ME在ER陽性細胞株中的效應(yīng)與濃度有關(guān)，低濃度時促細胞增殖，高濃度時抑制細胞生長。在一個致癌物誘導(dǎo)的乳腺癌模型中，2-ME低劑量(1 mg/kg)時有腫瘤刺激效應(yīng)，高劑量(5 mg/kg) 時具有抑制腫瘤效應(yīng)[7]。所以2-ME的抗腫瘤增殖效應(yīng)與雌激素受體途徑無直接相關(guān)。

2.2促凋亡與自噬 2-ME可通過不同的途徑誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生凋亡，而對正常的上皮細胞、靜止期的內(nèi)皮細胞無作用。在不同細胞中，2-ME誘導(dǎo)細胞凋亡的機制不同。在多數(shù)腫瘤細胞中，主要是通過細胞外源性途徑和內(nèi)源性途徑介導(dǎo)。(1)外源性途徑:2-ME可誘導(dǎo)細胞膜表面死亡受體 DR5及Fas表達增加，激活細胞內(nèi)的凋亡蛋白酶caspase，引發(fā)級聯(lián)反應(yīng)[8]。(2)內(nèi)源性途徑:2-ME可通過激活c-Jun氨基末端激酶(JNK)/應(yīng)激活化蛋白激酶(SAPK)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，引起細胞色素C的釋放，并與凋亡蛋白酶激活因子(Apaf-1)、caspase-9前體、ATP/dATP等形成凋亡復(fù)合物體，從而激活caspase，同時上調(diào)Fas及Bcl-2的表達[9]。(3)上調(diào) P53 的表達:P53是一種常見的抑癌基因，在調(diào)節(jié)細胞凋亡、細胞周期和DNA損傷修復(fù)中均發(fā)揮重要作用。在染色體DNA輕微損傷時，P53可通過阻滯細胞周期進程、誘導(dǎo)表達DNA修復(fù)酶對損傷的DNA進行修復(fù)，以減少突變累計。當(dāng)損傷嚴(yán)重不能修復(fù)時，P53將啟動凋亡相關(guān)基因的表達，誘導(dǎo)凋亡。研究表明，2-ME可以上調(diào)P53的表達，通過獨立及依賴途徑促進腫瘤細胞凋亡，如2-ME通過P53獨立途徑誘導(dǎo)凋亡，然而在非小細胞肺癌中卻是通過P53依耐途徑[10]。(4)活性氧(reactive oxygen species,ROS)和活性氮(react ive nit rogen species,RNS)：ROS和RNS是引起蛋白質(zhì)氧化損傷的重要因素，可以通過多種代謝途徑產(chǎn)生，具有較高的反應(yīng)活性，由ROS引起的蛋白質(zhì)氧化性損傷與衰老、腫瘤等的密切發(fā)生相關(guān)。2-ME 產(chǎn)生 ROS 和RNS導(dǎo)致硝基氧化應(yīng)激進而減少線粒體膜電位，介導(dǎo)線粒體膜損傷及細胞色素C釋放,從而誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，但對正常細胞無毒性作用[11]。(5)抑制端粒酶活性：端粒酶與細胞的永生和癌癥有密切關(guān)系。2-ME能通過抑制端粒酶的活性，破壞其穩(wěn)定性，使腫瘤細胞逐漸凋亡[12]。(6)其他：2-ME誘導(dǎo)細胞凋亡還可通過調(diào)節(jié)第五死亡感受器，增強STAT1蛋白的表達，激活天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶來實現(xiàn)[13]。

2-ME除了引起細胞凋亡，還能激發(fā)細胞自噬。自噬是一種進化保守的代謝途徑，使真核細胞能夠降解并回收細胞組分進行再利用，自噬過度則導(dǎo)致細胞死亡，即自噬性細胞死亡。

用2-ME衍生物——2-甲氧基雌二醇雙氨基磺酸處理乳腺癌細胞MCF-7后，發(fā)現(xiàn)溶酶體染色增強，表明自噬增加，然而在非腫瘤細胞株MCF-12A中卻不會發(fā)生[14]。2-ME可誘導(dǎo)人骨肉瘤細胞微管相關(guān)蛋白LC3-1轉(zhuǎn)換為LC3-2從而誘導(dǎo)自噬，而該現(xiàn)象在健康人非腫瘤細胞(如成骨細胞)中卻未被觀察到[15]。

2-ME的促凋亡活性對增殖活躍的細胞具有特異性，特別是腫瘤細胞和內(nèi)皮細胞，2-ME不會誘導(dǎo)正常的乳腺上皮細胞和靜止的內(nèi)皮細胞凋亡。2-ME誘導(dǎo)凋亡的機制很多還不清楚，但正由于眾多相反的或潛在的更多機制使得2-ME作為一種抗癌藥物產(chǎn)生腫瘤耐藥性的風(fēng)險性較低。

2.3血管形成抑制 研究表明，2-ME可有效抑制多種腫瘤的血管生成。血管生成的步驟主要包括血管基底膜和細胞外基質(zhì)降解，產(chǎn)生基底膜縫隙為內(nèi)皮細胞向腫瘤細胞遷移做好準(zhǔn)備；血管內(nèi)皮細胞黏附、遷移、增殖，以出芽的方式形成新的毛細血管，最后血管周圍基質(zhì)重新包饒血管，新的管腔結(jié)構(gòu)形成。腫瘤血管生成主要與幾個促血管生成因子密切相關(guān)，如血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、胎盤生長因子(placental growth factor，PIGE)、血小板源性生長因子(platelet derived growth factor，PDGF)等。在直徑大于1 mm的腫瘤中血管生成是腫瘤增殖環(huán)節(jié)至關(guān)重要的一步。2-ME可通過多種途徑抑制多種腫瘤的血管生成，主要機制有：(1)直接抑制內(nèi)皮細胞增殖、誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞的凋亡；(2)抑制內(nèi)皮細胞的遷移，有研究表明，2-ME呈劑量依賴性抑制肺動脈內(nèi)皮的遷移[16]；(3)抑制細胞外基質(zhì)降解，2-ME可作用于神經(jīng)細胞瘤細胞使基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子增加，阻斷細胞外基質(zhì)降解[17]；(4)下調(diào)最重要的促血管生成因子VEGF和成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)[11]；(5)下調(diào)乏氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)，它是一種在乏氧環(huán)境中高表達的轉(zhuǎn)錄因子，激活后轉(zhuǎn)移進入核內(nèi)，參與將近40種下游靶基因的表達，包括糖酵解酶、促紅細胞生成素、VEGF/FGF等基因。2-ME促進 HIF-l蛋白降解并抑制HIF-1 核積聚導(dǎo)致微管紊亂，其作用類似于紫杉醇[18]。 HIF-1 下調(diào)后除了導(dǎo)致微管紊亂，還能抑制VEGF及VEGFR2的活性，有研究證實在常氧和乏氧環(huán)境中2-ME以劑量依賴的方式抑制VEGF的分泌，以 HIF-1 獨立或依賴的途徑抑制VEGFR-2的表達[19]。

值得注意的是，2-ME的抗血管生成活性并不依賴于對內(nèi)皮細胞的直接效應(yīng)，有研究表明2-ME作用于乳腺癌細胞48 h后產(chǎn)生的培養(yǎng)基也能抑制毛細血管結(jié)構(gòu)的形成，這表明2-ME能促進乳腺癌細胞產(chǎn)生細胞因子抑制內(nèi)皮細胞重建[20]。

3 藥物開發(fā)及利用

2-ME對內(nèi)皮細胞和腫瘤細胞表現(xiàn)出較強的活性，臨床前研究得出其具有抗腫瘤增殖、促腫瘤細胞凋亡、抗血管生成等活性使得2-ME成為潛在的抗癌藥物，進而進入臨床研究。

研究2-ME抗癌效應(yīng)的第一個臨床試驗的藥物商品名是 PanzemTM，由美國EntreMed 制藥公司生產(chǎn)。幾個實驗聚焦于測試PanzemTM的藥代動力學(xué)和細胞毒性特點。臨床試驗顯示2-ME具有很好的耐受性，較少的不良反應(yīng)，如胃腸反應(yīng)和疲勞等。在一項Ⅰ期臨床試驗中，20個實體瘤的病人，給予劑量3 000 mg每日2次仍然沒有達到最大耐受劑量(the maximum tolerated dose，MTD) 。治療對微血管密度和細胞增殖沒有影響，最后實驗由于較低的血漿濃度而終止[21]。另一項Ⅰ期實驗研究2-ME對乳腺癌和前列腺癌的治療效應(yīng)，口服2-ME日劑量達到1.2 g，雖然此時前列腺腫瘤生物標(biāo)記物PAS降低，仍然沒有產(chǎn)生毒性和抗癌效應(yīng)[22]。多個研究都證實即使是給予高劑量藥物時2-ME的血漿濃度仍很低，其原因很可能是較低的水溶性和快速的首過消除效應(yīng)導(dǎo)致了其較低的口服生物利用度。這可能是抗腫瘤作用弱的原因。

針對2-ME較低口服生物利用度的特點，多種致力于提高其生物利用度的2-ME新型劑型及衍生物進入人們的視野，主要有納米晶體分散系(NanoCrystal dispersion，NCD)、ENMD-0998、STX140等。NCD是1種增加水溶性的新型藥物投遞方法，臨床前研究顯示2-ME-NCD使2-ME的口服生物利用度得到很好改善。而且該藥物每天多次服用比一次服用具有更高的抗癌效應(yīng)。多次服用產(chǎn)生一個穩(wěn)定的血漿濃度，而穩(wěn)定的血漿濃度正是產(chǎn)生抗癌效應(yīng)所需要的。研究顯示2-ME-NCD 對順鉑耐藥的晚期卵巢癌和原發(fā)性腹膜癌有良好的耐受性，僅有很少的不良反應(yīng)。雖然NCD使得2-ME擁有更好的生物利用度，合理的穩(wěn)定的血漿濃度水平，可預(yù)測的2-ME的治療濃度窗，但是其整體抗癌活性仍然較低[5]。一項Ⅱ期研究紫杉醇抵抗的轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者，報道了2-ME-NCD具有很好的耐受性和一定的生物活性，但沒有出現(xiàn)臨床期望的顯著抗癌療效。該研究計劃招募50例受試者而僅僅試驗了21例就提前結(jié)束，因為預(yù)測分析6個月的無進展生存期無法達到[23]?？傮w上這些試驗均顯示了2-ME具有良好的耐受性，但由于其效能的問題，使得無法評估長期不良反應(yīng)。ENMD-1198是2-ME的一種衍生物，也被稱為C24-883，由 CASI Pharmaceuticals Inc.(Rockville,MD,USA) 生產(chǎn)，一項Ⅰ期實驗研究顯示常見的不良反應(yīng)為2級疲勞(55%)，惡心、嘔吐(37%)，便秘(34%)，同時觀察到有2例患者發(fā)生4級中性粒細胞減少。ENMD-1198可以阻止微管聚合，降低HIF-1表達導(dǎo)致腫瘤細胞凋亡，而且生物利用度比2-ME有明顯的增加[21]，所以ENMD-1198是1種很有前途的2-ME衍生物，可以延長多種腫瘤的無進展生存期，前景可觀，值得進一步研究。此外，研究得較多的2-ME衍生物是STX140(2-Methoxyestradiol-3,17-O,O-bis-sulphamate),該化合物包含1個2-ME分子和C3和C17位上的氨基磺酸基。STX140 的需要劑量明顯低于2-ME，較低劑量時便能抑制乳腺癌細胞的生長。同時發(fā)現(xiàn)STX140對非腫瘤性的乳腺細胞活力無影響，表明它是一種較好的人乳腺癌治療的潛在藥物。

雖然2-ME作為一種單一藥物用于腫瘤治療效果欠佳，但作為輔助用藥表現(xiàn)出更廣闊的前景。(1)聯(lián)合化療：乳腺癌細胞株中，2-ME聯(lián)合抗雌激素他莫昔芬取得良好的效果。研究表明2-ME和他莫昔芬均能作為芳香化酶抑制劑[24]。另一項體外實驗中，將子宮內(nèi)膜和卵巢癌細胞用2-ME預(yù)處理，可見其對凋亡因子-腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)更加敏感，標(biāo)準(zhǔn)的化療藥物通常對正常細胞和腫瘤細胞均有損傷作用，因此通過2-ME-TRAIL聯(lián)合嘗試增加癌癥細胞的凋亡同時降低正常組織的損害取得了一定效果[25]。此外，2-ME聯(lián)合表阿霉素、多西紫杉醇、氟尿嘧啶、環(huán)磷酰胺、卡鉑、硼替佐米等可明顯抑制乳腺癌、多發(fā)性骨髓瘤、尿路上皮癌、結(jié)直腸轉(zhuǎn)移癌等細胞增殖[5]。(2)聯(lián)合放療：課題組也研究了2-ME對鼻咽癌干細胞增殖、遷移及放療抵抗性的影響并初步探討其機制，結(jié)果證實2-ME可以降低鼻咽癌干細胞的干性、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、鼻咽癌干細胞對放療的抵抗作用，有望作為放療增敏藥或者聯(lián)合抗腫瘤藥物應(yīng)用于臨床[26]。(3)聯(lián)合靶向治療：為了提高2-ME生物利用度及其臨床效應(yīng)，PanzemTM與多靶點絡(luò)氨酸激酶抑制劑舒尼替尼聯(lián)合治療轉(zhuǎn)移性腎癌[27]，與血管生成抑制劑貝伐單抗聯(lián)合治療晚期類癌[28]，均表現(xiàn)出較好的療效。

4 展 望

2-ME是一種雌激素在體內(nèi)的生理代謝產(chǎn)物，對多種腫瘤均具有抗癌活性，其抗癌作用的完整機制仍有待深入探索。在臨床前及臨床試驗中均表明其具有很好的耐受性和較低的毒副作用，但由于其低生物利用度限制了其效應(yīng)。幾種提高生物利用度的劑型和衍生物正處于臨床研究中。值得關(guān)注的是，2-ME作為聯(lián)合化療或放療或靶向治療的輔助用藥，均表現(xiàn)出極大的潛力。倡導(dǎo)腫瘤精確治療的今天，2-ME功能與機制被不斷深入探索，其抗癌效應(yīng)將得到最大的發(fā)揮。