趙 鑫,常 穎,劉玉俠,趙 暉,盧衛(wèi)平,王啟文*

(1.吉林省腫瘤醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春130012；2.吉林省腫瘤防治研究所)

食道癌是我國(guó)常見的惡性腫瘤之一，其中90%的食道癌是食道鱗癌。目前的主要治療手段為手術(shù)治療及化療。但是，在化療治療過(guò)程中，很多人會(huì)對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥，影響治療效果。為了探求腫瘤細(xì)胞的耐藥機(jī)制及為腫瘤耐藥治療提供實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，我們用順鉑反復(fù)誘導(dǎo)的方法建立了人食道癌細(xì)胞Ecap-109耐藥細(xì)胞模型，為進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1試劑及器材IMDM培養(yǎng)基，Gibco產(chǎn)品；MTT(噻唑藍(lán))，Sigma產(chǎn)品；胎牛血清，天津TB公司；DMSO(二甲基亞砜)，Sigma產(chǎn)品；順鉑，購(gòu)于江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司；瓊脂糖，DNA標(biāo)準(zhǔn)品，寶泰克公司產(chǎn)品；低溫低速離心機(jī)，SORVALL RTT USA；全自動(dòng)酶標(biāo)儀，Labsystems Dragon；萬(wàn)能視頻成像系統(tǒng)(LY-WN-HPCCD)，成都勵(lì)揚(yáng)精密機(jī)電有限公司；電泳儀,上海天能。

1.2食道癌細(xì)胞系Ecap-109吉林省腫瘤防治研究所保存。

1.3方法

1.3.1培養(yǎng)人食道癌細(xì)胞Ecap-109 將Ecap-109細(xì)胞從液氮罐中取出復(fù)蘇后，離心洗滌，加入含10%FCS的IMDM培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，置于CO2培養(yǎng)箱中，37℃、5%CO2、飽和濕度條件下靜止培養(yǎng)。

1.3.2誘導(dǎo)Ecap-109細(xì)胞耐藥 將Ecap-109細(xì)胞培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期且已鋪滿瓶底80%以上時(shí)，加入終濃度為50 μmol/L順鉑，培養(yǎng)1小時(shí)后棄去含順鉑培養(yǎng)基，更換為新鮮配制的含10%FCS的IMDM培養(yǎng)液，置于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，拍照。待細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶時(shí)，用0.25%胰酶消化傳代。待再長(zhǎng)滿瓶底時(shí)用同樣濃度同樣方法沖擊，再培養(yǎng)并觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，拍照，再傳代。如此反復(fù)，體外連續(xù)培養(yǎng)、沖擊、傳代，并反復(fù)凍存，復(fù)蘇，觀察細(xì)胞株生長(zhǎng)穩(wěn)定性，同時(shí)進(jìn)行抗藥性檢測(cè)。

1.3.3檢測(cè)細(xì)胞抗藥性 用MTT法，將培養(yǎng)的人食道癌細(xì)胞株Ecap-109和經(jīng)過(guò)順鉑沖擊處理4次和6次的Ecap-109細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用0.25%胰酶消化，生理鹽水洗滌，計(jì)數(shù)后，重懸于10%FCS的IMDM培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104/mL，加入96孔培養(yǎng)板，100 μL/well，置于CO2培養(yǎng)箱中，37℃、5%CO2、飽和濕度條件下靜止培養(yǎng)過(guò)夜，細(xì)胞貼壁后加入順鉑，終濃度分別是100、50、25、12.5、6.25 μmol/L，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照(等體積的生理鹽水)和空白對(duì)照(無(wú)細(xì)胞)。各組設(shè)6復(fù)孔。37℃、5%CO2、飽和濕度條件下靜止培養(yǎng)72小時(shí)，培養(yǎng)結(jié)束前4小時(shí)加入MTT(5 mg/mL)，20 μL/well，繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后，小心吸棄培養(yǎng)上清，每孔加入DMSO 150 μl，震蕩溶解后，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔吸光度值(A) ，波長(zhǎng)為492 nm。

計(jì)算方法：抑制率=[1-(實(shí)驗(yàn)組均值/陰性對(duì)照組均值)]×100%。

50%細(xì)胞生長(zhǎng)抑制所需的藥物濃度(IC50)：應(yīng)用SPSS17.0軟件計(jì)算IC50值。

耐藥指數(shù)(RI)=耐藥細(xì)胞IC50/親本細(xì)胞IC50。

1.3.4檢測(cè)耐藥Ecap-109細(xì)胞多藥耐藥基因(MDR)表達(dá) 提取人食道癌細(xì)胞Ecap-109細(xì)胞及順鉑耐藥細(xì)胞DNA，用PCR擴(kuò)增法做MDR1全長(zhǎng)序列(約4.7kb)檢測(cè)。引物設(shè)計(jì)：上游引物 ATGGATCTTGAAGGGGACCGCAATGGAGG，下游引物 CATCTCATACAGTCAGAGTTCACTGGCGC。擴(kuò)增方法和條件： 在離心管內(nèi)加入下列物質(zhì)：10x bf ，2.5 μl；MgCl2，2.5 μl；DNTP(2 mM)，1.0 μl；Primers ，1.0 μl (each)；DDW，16.0 μl；Target，1.0 μl；95℃,5 min；Tag ，0.5 μl；94℃，60 s；55℃，80 s；72℃，150 s；共30個(gè)循環(huán),72℃延伸10分鐘。用0.8%的瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量數(shù)據(jù)采用Mean±SD表示，使用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)及生長(zhǎng)特征

細(xì)胞在接受50 μmol/L cDDP沖擊后，出現(xiàn)大量死亡細(xì)胞，活細(xì)胞數(shù)銳減，直至剩下很少的單個(gè)細(xì)胞。之后經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期培養(yǎng)，慢慢出現(xiàn)單細(xì)胞克隆(見圖1，圖2)。待單細(xì)胞克隆長(zhǎng)到一定程度后進(jìn)行消化、傳代，繼續(xù)培養(yǎng)，恢復(fù)單層排列(圖3，圖4)。待細(xì)胞長(zhǎng)滿后，再次用同樣劑量沖擊此細(xì)胞，如此反復(fù)，共沖擊6次。對(duì)沖擊4次和6次的Ecap-109分別進(jìn)行耐藥檢測(cè)和多藥耐藥(MDR)基因檢測(cè)。

我們分別檢測(cè)了經(jīng)50 μmol/L順鉑沖擊4次和6次后不同濃度順鉑對(duì)親本細(xì)胞和耐藥誘導(dǎo)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制情況。見表1和表2。

2.3耐藥Ecap-109細(xì)胞多藥耐藥基因(MDR)表達(dá)檢測(cè)結(jié)果MDR1全長(zhǎng)大約4.7 kb，從電泳結(jié)果可以看出，在此位置上可見一泳帶，證明提取人食道癌細(xì)胞Ecap-109順鉑耐藥細(xì)胞有MDR1基因的表達(dá)，而親本Ecap-109細(xì)胞沒(méi)有表達(dá)。見圖5。

表1 正常Ecap109細(xì)胞和經(jīng)5 0 μmol/L順鉑沖擊4次后Ecap109細(xì)胞的耐藥檢測(cè)

IC50：Ecap-109 23.097 μmol/L Ecap-109/cDDP 72.177 μmol/L RI： 3.12

表2 正常Ecap109細(xì)胞和經(jīng)5 0 μmol/L順鉑沖擊6次后Ecap109細(xì)胞的耐藥檢測(cè)

IC50：Ecap-109 20.561 μmol/L Ecap-109/cDDP 70.869μmol/L RI： 3.45

1.mark 2.親本Ecap-109細(xì)胞 3.誘導(dǎo)4次耐藥的Ecap-109細(xì)胞 4.誘導(dǎo)6次耐藥的Ecap-109細(xì)胞

圖5耐藥Ecap-109細(xì)胞MDR表達(dá)結(jié)果

3 討論

腫瘤細(xì)胞耐藥是影響治療效果的重要原因之一。腫瘤耐藥的產(chǎn)生有多種原因，其中有原藥耐藥和多藥耐藥。多藥耐藥大部分發(fā)生于單用高劑量給藥或聯(lián)合用藥后存活下來(lái)的部分細(xì)胞[1,2]，也就是腫瘤干細(xì)胞(CSCs)。CSCs雖然僅占腫瘤細(xì)胞的一小部分，但它卻有強(qiáng)大的自我更新能力，形成與親代細(xì)胞完全相同的腫瘤細(xì)胞，是腫瘤復(fù)發(fā)的根源[3,4]。

目前，鉑類藥物是最常用的周期非特異性抗腫瘤藥物，它是多種腫瘤治療藥物的首選。其中，順鉑(DDP)是使用廣泛的化療藥物之一[5]。但是由于鉑類抗腫瘤藥物結(jié)構(gòu)上的相似，使其很容易產(chǎn)生原藥耐藥或交叉耐藥，造成化療治療的失敗[6]。根據(jù)這一現(xiàn)象，本實(shí)驗(yàn)用順鉑誘導(dǎo)人食道癌細(xì)胞Ecap-109產(chǎn)生耐藥性，建立人食道癌細(xì)胞Ecap-109順鉑耐藥模型，為耐藥細(xì)胞的治療等研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

我們經(jīng)過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)，最后選擇了用50 μmol/L順鉑對(duì)人食道癌細(xì)胞Ecap-109進(jìn)行反復(fù)沖擊的方法，細(xì)胞經(jīng)沖擊后逐漸死亡，后來(lái)只剩下少量單個(gè)細(xì)胞(見圖1)。之后經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)后，所剩細(xì)胞逐漸形成集落(見圖2)。將形成的集落用胰酶消化后重新培養(yǎng)，逐漸恢復(fù)到原始狀態(tài)(見圖3，圖4)。之后，我們用同樣的方法反復(fù)沖擊，并用沖擊第4次和第6次的細(xì)胞以及親本細(xì)胞分別做了耐藥抑制率和耐藥基因檢測(cè)，結(jié)果證明，經(jīng)4次和6次沖擊后，人食道癌細(xì)胞Ecap-109對(duì)順鉑具有較強(qiáng)的耐受力，IC50分別達(dá)到72.18 μmol/L和70.87 μmol/L，而親本細(xì)胞Ecap-109則分別為23.03 μmol/L和20.56 μmol/L(見表1，表2)，兩者比較有顯著差異(P<0.01)，誘導(dǎo)4次和6次的Ecap-109細(xì)胞均有MDR表達(dá)(見圖5)。因此，本實(shí)驗(yàn)建立了Ecap-109/DDP耐藥細(xì)胞株。該細(xì)胞株通過(guò)反復(fù)凍存、復(fù)蘇后，仍對(duì)順鉑有較高的耐藥性及MDR的表達(dá)。至此，我們建立了具有很好穩(wěn)定性的耐藥細(xì)胞，為尋找抗耐藥腫瘤細(xì)胞的藥物及其它耐藥實(shí)驗(yàn)研究奠定了基礎(chǔ)。

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