黃宇 何宏勇 李軍 段振華 甘一波 唐第深 吳翠蘭 閉炳芬 潘艷*

（1，廣西玉林市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 537000；2，廣西獸醫(yī)研究所 530001；3，廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 530001）

猝死癥在近幾年是比較盛行的一種疾病，其表現(xiàn)為家畜突然死亡，豬牛羊等易發(fā)生該病。猝死癥的發(fā)病特點(diǎn)是急、病程短、死亡快。中毒因素、多種細(xì)菌及病毒混合感染因素、營(yíng)養(yǎng)因素、應(yīng)激等因素都可造成猝死癥。該病給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

2017年7月，廣西玉林市某養(yǎng)殖戶送檢一份羊病料。通過(guò)對(duì)該病料進(jìn)行剖檢和實(shí)驗(yàn)室診斷，最終確定該病例是由肺炎克雷伯菌引起的，然后對(duì)其他山羊進(jìn)行防治性措施，得到較好效果，現(xiàn)將具體的診斷方法和防治方法報(bào)道如下。

1 發(fā)病情況

2017年7月11日，廣西玉林市某養(yǎng)殖戶山羊場(chǎng)發(fā)現(xiàn)1只羊表現(xiàn)為精神沉郁、呼吸急促、體溫正常，然后對(duì)其進(jìn)行用藥治療，經(jīng)過(guò)4h后，該羊死亡。第3天又有2只羊死亡。該養(yǎng)殖戶立即送病死羊進(jìn)行疫病檢測(cè)。

2 病理變化

剖檢發(fā)現(xiàn)除肺臟有出血外，其他臟器無(wú)明顯的病理變化。

3 材料與方法

3.1 材料

3.1.1 主要儀器和試劑

PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)，購(gòu)自Bio-rad公司；血平板、胰蛋白胨大豆肉湯、麥康凱瓊脂，購(gòu)自北京路橋技術(shù)有限責(zé)任公司；細(xì)菌DNA提取試劑盒、2×Taq MasterMix、DNA Marker100 bp Ladder、快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒等，均購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；藥敏紙片，購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司。

3.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

10只健康小鼠，購(gòu)自廣西中醫(yī)藥大學(xué)。

3.1.3 引物

[1]將16SrRNA細(xì)菌鑒定引物序列由蘇州金唯智生物科技有限公司合成，擴(kuò)增片段大小約為1500bp，引物序列信息如下：

27F： 5’ -AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’

1492R： 5’ -GGTTACCTTGTTACGACTT-3’

3.2 診斷方法

3.2.1 細(xì)菌分離和鑒定

將肺組織劃線接種于血平板上，置于37℃培養(yǎng)24h后有菌生長(zhǎng)。再?gòu)闹刑羧蝹€(gè)菌落接種于麥康凱培養(yǎng)基上置于37℃培養(yǎng)24h也有菌生長(zhǎng)。然后挑取單個(gè)菌落革蘭氏染色后、鏡檢，觀察細(xì)菌形態(tài)；同時(shí)用細(xì)菌抽提試劑盒抽提DNA，以此為模板，用細(xì)菌鑒定引物16SrRNA對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增、克隆、測(cè)序。

3.2.2 致病性試驗(yàn)

將10只小鼠隨機(jī)分成2組，每組5只。一組用純細(xì)菌培養(yǎng)物進(jìn)行腹腔注射接種的試驗(yàn)組，劑量為0.3ml/只 （3×108CFU）；另一組為無(wú)菌的純培養(yǎng)液腹腔注射接種的對(duì)照組，劑量為0.3ml/只，觀察小鼠的生長(zhǎng)狀況。

3.2.3 藥敏試驗(yàn)

用環(huán)丙沙星、林可霉素、氧氟沙星、青霉素G等10種常用抗菌藥物對(duì)分離菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，置于37℃培養(yǎng)24h，觀察抑菌效果。

4 結(jié)果

4.1 細(xì)菌分離及形態(tài)學(xué)結(jié)果

血平板上生長(zhǎng)單一白色黏稠菌落且不溶血，從中挑取單一菌落接種于麥康凱平板，其有奶油狀菌落生長(zhǎng)，經(jīng)鏡檢為革蘭氏陰性、短桿菌。

4.2 PCR結(jié)果

對(duì)該菌的16srRNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增、電泳 （附圖），然后用膠回收試劑盒進(jìn)行回收、克隆、測(cè)序及將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，該分離株與肺炎克雷伯氏菌同源性達(dá)98%，因此，鑒定該細(xì)菌為肺炎克雷伯氏菌。

附圖 細(xì)菌分離株電泳結(jié)果圖

4.3 致病性試驗(yàn)

試驗(yàn)組接種菌4h后，小鼠開始表現(xiàn)為精神萎靡、不好動(dòng)且行動(dòng)緩慢等癥狀，24h內(nèi)小鼠全部死亡；對(duì)照組小鼠無(wú)異常變化。對(duì)死亡小鼠進(jìn)行解剖，發(fā)現(xiàn)肺表面有出血，將肺進(jìn)行血平板劃線培養(yǎng)，回收到該細(xì)菌。

4.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)文獻(xiàn)[2]藥敏試驗(yàn)結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)抑菌圈直徑為20～30mm，判斷為高敏藥物；抑菌圈直徑為10～20mm，判定為中敏藥物；抑菌圈直徑為7～9mm，判定為中敏藥物；無(wú)抑菌圈，判定為不敏感藥物。從附表可知，該菌對(duì)頭孢曲松高敏；對(duì)環(huán)丙沙星、頭孢拉定、氧氟沙星、鏈霉素和大觀霉素中敏；對(duì)強(qiáng)力霉素、氨芐西林、林可霉素、青霉素G不敏感。

5 討論

本次所檢測(cè)的病例，經(jīng)細(xì)菌分離和PCR鑒定、致病性試驗(yàn)和藥物敏感性試驗(yàn)，最終確定該病例是由肺炎克雷伯氏菌引起山羊的死亡。

1882年，由Friediander等從病人肺中首次分離到革蘭氏陰性腸桿菌科克雷伯氏菌屬的條件致病性菌肺炎克雷伯氏菌[3]，隨后，陸續(xù)從豬、牛、羊、水貂、蟒蛇、鯉魚等動(dòng)物都有報(bào)道該病原菌[4-8]，說(shuō)明該病原不僅能感染人和家畜，還可以感染野生動(dòng)物和水生動(dòng)物?；夹蟾腥驹摬≡瓡r(shí)，常引起敗血癥、肺炎、化膿性腦膜炎等疾病[4]。肺炎克雷伯氏菌病本為呼吸道、腸道的常見菌，但飼養(yǎng)環(huán)境條件差和牛羊運(yùn)輸過(guò)程中產(chǎn)生的應(yīng)激都會(huì)直接導(dǎo)致機(jī)體功能下降，進(jìn)而可引起肺炎克雷伯氏菌的入侵，可引發(fā)多種病原感染，比如大腸桿菌、溶血性曼氏桿菌。本次病例發(fā)病急、死亡快、肺出血，這與許惠等[4]的報(bào)道一致。

致病性試驗(yàn)中，試驗(yàn)組小鼠在24h內(nèi)完全死亡，說(shuō)明該菌株致病性極強(qiáng)，這可能與該菌的毒力因子 （菌毛、莢膜多糖等）有關(guān)[3]。王秀坤等[3]報(bào)告，菌毛具有黏附作用，其可以與宿主表面受體作用進(jìn)而促使細(xì)菌成功進(jìn)入宿主體內(nèi)進(jìn)行繁殖和定居；而莢膜多糖不僅可以保護(hù)病原菌，還可以抑制宿主的免疫應(yīng)答能功能。對(duì)于該菌的致病因子是哪個(gè)，還待于進(jìn)一步研究。

隨著養(yǎng)殖行業(yè)快速發(fā)展，濫用抗生素已非常普遍。該養(yǎng)殖戶在發(fā)現(xiàn)該羊出現(xiàn)精神沉郁、呼吸急促后，立即給全體山羊使用大觀霉素等藥物進(jìn)行防治，然而效果不佳。在本次藥物敏感性試驗(yàn)中可以看出，該病原菌對(duì)大觀霉素、氨芐西林等藥物耐藥，而對(duì)頭孢曲松高敏，因此，臨床用藥時(shí)要進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，選擇高敏感性藥物進(jìn)行用藥，不能盲目用藥和濫用藥物。

對(duì)于此次病例，由于發(fā)病期間處于雨季導(dǎo)致羊舍潮濕，所以易引發(fā)本病的發(fā)生。因此，羊舍不應(yīng)該太潮濕。肺炎克雷伯氏菌病的治療原則是及時(shí)發(fā)現(xiàn)、盡早治療，一旦發(fā)現(xiàn)病羊要及時(shí)隔離，防止將該病傳染給其他綿羊。另外，需要選擇敏感性藥物頭孢曲松進(jìn)行用藥治療，對(duì)其飼料要添加礦物質(zhì)等進(jìn)行飼喂優(yōu)質(zhì)性草料。經(jīng)過(guò)一周的治療，病情得到控制。

參考文獻(xiàn)：

[1]房海,陳翠珍,張曉君,等.羊肺炎克雷伯氏菌感染癥及病原菌檢測(cè)與系統(tǒng)發(fā)育分析[J].中國(guó)人獸共患病雜志,2005,21(10):895-899.

[2]王秀坤,王克軍,孫宇.絨山羊肺炎克雷伯氏菌病的診斷與治療報(bào)告[J].現(xiàn)代畜牧獸醫(yī),2013(4):33-34.

[3]康燕菲,田平芳,譚天偉.肺炎克雷伯氏菌毒力因子的研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)報(bào),2015,55(10):1245-1252.

[4]許惠.肉牛肺炎克雷伯氏菌的診治報(bào)告[J].中國(guó)奶牛,2012(14):42-43.

[5]劉海林.豬源肺炎克雷伯氏菌分離株耐藥性調(diào)查及防控技術(shù)研究[D].江蘇南京,南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2015.

[6]楊艷林,陳峙峰,王成福,等.水貂肺炎克雷伯氏菌的分離鑒定[J].特產(chǎn)研究,2012(4):10-12.

[7]郭桂英,李祥,黎丹,等.蟒蛇肺炎克雷伯氏菌的分離與鑒定[J].熱帶生物學(xué)報(bào),2013,4(4):332-346.

[8]盧玉婷,鄭丹丹,胡揚(yáng)揚(yáng),等.鯉魚肺炎克雷伯氏菌分離與鑒定[J].中國(guó)獸藥雜志,2014,48(9):9-13.

附表 藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果 （單位：mm）