張召興，肖麗榮，李巧玲，李蘊(yùn)玉，李佩國，吉志新，岳香云，賈青輝，史秋梅

(河北科技師范學(xué)院/河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北秦皇島 066604)

大腸桿菌病是由某些致病性大腸埃希菌(Escherichiacoli，E.coli)菌株引起多種動(dòng)物及人不同疾病的總稱，大腸埃希菌廣泛存在自然界中，可以感染豬、雞、狐貍、貉、貂等多種動(dòng)物，引發(fā)不同的癥狀，是一種人畜共患重要的條件致病菌[1-2]。狐貍致病性大腸埃希菌主要感染斷奶前后的幼獸，多呈暴發(fā)流行并有一定的季節(jié)性，臨床以敗血癥和腹瀉為主，感染率和病死率均較高，還侵害中樞神經(jīng)系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)，成年和老年的狐貍很少發(fā)病，成年母狐感染致病性大腸埃希菌會(huì)引起流產(chǎn)和死胎，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3]。

近年來，在養(yǎng)殖過程中抗菌藥物的不合理使用，導(dǎo)致了致病性大腸埃希菌產(chǎn)生很強(qiáng)的耐藥性，是許多敏感的抗菌藥物變?yōu)椴幻舾谢蚨嘀啬退帲⑶覍?dǎo)致大量的抗菌藥物在動(dòng)物體內(nèi)的殘留，給人類的健康造成嚴(yán)重的危害[4-6]。中草藥富含有多種化學(xué)成分，不僅具有抗菌、增強(qiáng)免疫力、抗炎、抗內(nèi)毒素多種藥理作用，還具有無副作用、低殘留、不易產(chǎn)生耐藥性等多種優(yōu)點(diǎn)[7]。中草藥藥理作用復(fù)雜，對動(dòng)物機(jī)體具有雙向調(diào)節(jié)作用，通過多個(gè)途徑調(diào)解機(jī)體的功能狀態(tài)[8]。中草藥在防治畜禽疾病中被廣泛應(yīng)用，因此，本研究通過測定26味中草藥對狐貍E.coliHL2(O1)地方菌株的體外抑菌活性，為進(jìn)一步研發(fā)防治狐貍致病性大腸桿菌病復(fù)方中草藥制劑及臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 狐貍致病性E.coliHL2(O1)地方株及標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922，由河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑與儀器 五味子、訶子、金銀花、黃連等26味單味中草藥，購自秦皇島民樂醫(yī)藥有限公司; 普通培養(yǎng)培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯，北京奧星生物技術(shù)公司產(chǎn)品；96孔細(xì)菌培養(yǎng)板，美國Corning公司產(chǎn)品；10 g/L紅四氮唑，美國Corning公司產(chǎn)品；普通粉碎機(jī)，青州市精誠醫(yī)藥裝備制造有限責(zé)任公司產(chǎn)品；YT-CJ-1D型超凈工作臺(tái)，北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司產(chǎn)品;GHP-9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品;常規(guī)試劑及儀器，河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 材料

1.2.1 單味中草藥藥液的制備 參照文獻(xiàn)[9]的方法，用水提法制備的中草藥藥液，取26味中草藥，用普通粉碎機(jī)粉碎后稱量50 g，加入5倍～0倍的蒸餾水浸泡1 h～1.5 h，煮開后用文火再煎煮30 min，用12層紗布過濾，再加入5倍蒸餾水煮沸，用文火再煎煮20 min過濾藥液。將兩次所煮藥液合并進(jìn)行濃縮為每毫升含原藥為1 g。離心后并調(diào)整其pH為7.2～7.4之間，分裝，121℃滅菌10 min,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌液的制備與計(jì)數(shù) 將HL2(O1)地方株與標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922的菌種接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，將接種好的培養(yǎng)基置于37℃的恒溫箱中培養(yǎng)12 h，挑取單菌落接種于肉湯培養(yǎng)基中，置于37℃振蕩培養(yǎng)，每隔2 h用分光光度計(jì)在600 nm測其OD值，確定細(xì)菌的對數(shù)期，利用平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，調(diào)整菌液濃度108CFU/mL。

1.2.3 單味中草藥體外抑菌圈直徑的測定 參照文獻(xiàn)[7]的方法，用平板打孔法測定26種單味中草藥抑菌圈直徑，取對數(shù)期的菌液0.1 mL(108CFU/mL)均勻涂布在平板上，待完全吸收后用直徑6 mm的打孔器打孔，并加滿中草藥藥液，置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h～16 h，每種藥物3個(gè)重復(fù)，取平均值；判定標(biāo)準(zhǔn)為：10 mm<抑菌直徑為低敏；10 mm≤抑菌直徑<15 mm為中敏；15 mm≤抑菌直徑<20 mm為高敏；20 mm≤抑菌直徑為極敏。

1.2.4 單味中草藥MBC的測定 參照文獻(xiàn)[8]的方法，采用改良微量二倍法測定26種單味中草藥的最低殺菌濃度(minimum bactericidal concentration,MBC)。用96孔細(xì)菌培養(yǎng)板，第1～10孔加入100 μL滅菌水，在第1孔中加入100 μL中草藥藥液混勻后取100 μL加入到第3孔中，以此類推到10孔，在第3孔混勻后取100 μL混合液加入第4孔，以此類推，到第9孔混勻后棄去100 μL。在第1～11孔中分別加入100 μL 2×NB，第10孔不加藥做為陽性對照孔，第11孔不接菌做為陰性對照孔。在第1～10孔接種10 μL(108CFU/mL)對數(shù)期的菌液，每種藥物3個(gè)重復(fù)，每孔分別加入5 μL紅四氮唑(10 g/L)，置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，若顏色變紅則說明有細(xì)菌生長。用無菌棉簽分區(qū)劃線法，無菌生長的區(qū)域則為各中藥的MBC。

2 結(jié)果

2.1 單味中草藥抑菌圈直徑測定結(jié)果

由表1可知，狐貍致病性E.coliHL2(O1)地方菌株對五味子、訶子2種藥物為極度敏感；對金銀花、黃連、苦參3種藥物高度敏感；對板藍(lán)根、黃芩、五倍子等10種藥物中度敏感；對地丁、白頭翁、連翹、穿心蓮4種藥物低度敏感，對女貞子、蒲公英、大青葉等7種藥物不敏感。

表1 中藥對狐貍致病性E.coli HL2(O1)地方株體外抑菌試驗(yàn)

注：-.無效果。

Note：-.No effect.

2.2 單味中草藥MBC結(jié)果

由表2可知該菌對五味子、訶子、金銀花3種藥物的MBC在7.825 mg/mL～15.65 mg/mL之間；對黃連、五倍子、苦參3種藥物的MBC在15.65 mg/mL～31.25 mg/mL之間；對五倍子、苦參2種藥物的MBC在31.25 mg/mL；對黃芩、板藍(lán)根、沙棘5種藥物的MBC在62.5 mg/mL～125 mg/mL之間；對白頭翁、黃柏、馬齒莧5種藥物的MBC在125 mg/mL～250 mg/mL之間；對夏枯草、連翹、穿心蓮3種藥物的MBC在250 mg/mL～500 mg/mL之間。女貞子、蒲公英、大青葉等7種藥物對該菌則無效果。

表2 中藥對狐貍致病性E.coli HL2(O1)地方菌株的MBC

注：-.無效果。

Note：-.No effect.

3 討論

致病性大腸埃希菌可以引發(fā)多種動(dòng)物及人發(fā)病，不同動(dòng)物感染致病性大腸埃希菌引起不同的病癥，尤其對幼齡動(dòng)物比較易感，該菌血清型比較多，因地區(qū)而異致病力也有所不同，大腸桿菌病已經(jīng)成為了危害健康養(yǎng)殖的主要傳染病之一[1]。在養(yǎng)殖過程中，臨床大多采用抗菌藥物進(jìn)行防治致病性大腸埃希菌，由于抗菌藥物大量不合理使用，不僅會(huì)破壞動(dòng)物腸道先天免疫力，引起腸道內(nèi)菌群失調(diào)，還容易形成耐藥菌株，同時(shí)也造成大量的藥物殘留[10-11]。 中草藥中富含多種化學(xué)物質(zhì)，這些性物質(zhì)在動(dòng)物體內(nèi)不僅對病原菌有直接或者間接殺滅作用以及消除病原菌的耐藥性，還可以調(diào)節(jié)整個(gè)動(dòng)物機(jī)體免疫系統(tǒng)，提高機(jī)體免疫力，具有雙向調(diào)節(jié)作用[12]。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道了中草藥可以中和病原菌在動(dòng)物產(chǎn)生的內(nèi)毒素，促進(jìn)動(dòng)物機(jī)體毒素的排泄[13]。許多研究證實(shí)中草藥的不同成分對致病性大腸埃希菌具有很好的抑菌效果。馮亞凈等[14]報(bào)道了五味子中的木脂素對大腸埃希菌的抑菌效果。胡立磊等[15]研究表明，金銀花提取物對大腸埃希菌具有很好的抑菌作用。徐倩倩等[16]報(bào)道了白頭翁湯方劑及其單味藥水提取液對豬、雞大腸埃希菌具有很好抑菌效果。

本研究采用平板打孔法和改良微量二倍稀釋法測定26味單味中草藥對狐源致病性E.coliHL2(O1)地方流行株的體外抑菌活性，結(jié)果顯示，五味子、訶子對狐源致病性大腸埃希菌呈極度敏感，抑菌圈直徑在21.3 mm～20.3 mm之間，MBC均為7.825 mg/mL；金銀花、黃連、苦參3種藥物高度敏感，抑菌圈直徑在16.4 mm～19.3 mm之間，MBC在15.65 mg/mL～31.25 mg/mL；對板藍(lán)根、黃芩、五倍子等10種藥物中度敏感；張慧等[17]報(bào)道了金銀花、黃連對禽類大腸埃希菌抑菌效果最好。向雙云等[18]報(bào)道魚腥草、艾葉、五味子對大腸埃希菌K88高度敏感，與本試驗(yàn)結(jié)果存在一定的差異性，其原因可能與中草藥制備工藝、所分離菌株的地區(qū)不同，感染的宿主動(dòng)物等有關(guān)。由于中草藥成分復(fù)雜，需要進(jìn)一步研究中草藥對致病性E.coli作用機(jī)理。本試驗(yàn)通過測定26味單味中草藥對狐源致病性E.coliHL2(O1)地方流行株的體外抑菌活性，國內(nèi)尚未見報(bào)道。本研究進(jìn)一步研發(fā)防治狐貍大腸桿菌病復(fù)方中草藥制劑及臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

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