楚品品，蔣智勇，勾紅潮，宋 帥，李 淼，李 艷，李春玲，蔡汝健

(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所/廣東省畜禽疫病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510640)

隨著重組DNA技術(shù)在20世紀(jì)70年代的出現(xiàn)，使得生產(chǎn)特定基因編碼的蛋白質(zhì)成為可能。細(xì)菌和酵母細(xì)胞的相關(guān)技術(shù)較成熟，并且生長(zhǎng)容易，成為了早期生產(chǎn)重組蛋白的主要載體。但是對(duì)于生產(chǎn)復(fù)雜的蛋白及需要翻譯后再修飾的蛋白而言，這些生產(chǎn)系統(tǒng)便顯示出了其固有的局限性，而動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用及規(guī)模化培養(yǎng)的出現(xiàn)很好地彌補(bǔ)了這一缺陷。

動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)最早可追溯到1885年，離體的雞胚組織于溫生理鹽水中可存活數(shù)天。真正成為一項(xiàng)技術(shù)被廣泛應(yīng)用始于1907年，美國(guó)生物學(xué)家Harrison R G[1]成功在試管中培養(yǎng)蛙胚神經(jīng)組織數(shù)周并觀察到細(xì)胞突起的生長(zhǎng)過程[2]。最初對(duì)于動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)是為了研究細(xì)胞的代謝和生長(zhǎng)，隨后發(fā)現(xiàn)其有更廣泛的應(yīng)用，之后細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)不斷成熟，被用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域。經(jīng)過一個(gè)多世紀(jì)的探索與發(fā)展，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)從實(shí)驗(yàn)室走向工業(yè)化生產(chǎn)。隨著基于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的蛋白質(zhì)醫(yī)藥和疫苗等生物制品成為生物醫(yī)藥的主導(dǎo)以及需求量和質(zhì)量的不斷提高[3-4]，多種動(dòng)物細(xì)胞規(guī)?；囵B(yǎng)技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生并不斷發(fā)展，倍受科研機(jī)構(gòu)和高新技術(shù)企業(yè)的關(guān)注，顯示出了極好的工業(yè)發(fā)展前景[5]。

1 哺乳動(dòng)物細(xì)胞規(guī)?；囵B(yǎng)方式

按細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)的生長(zhǎng)特性將哺乳動(dòng)物細(xì)胞分為貼壁生長(zhǎng)型細(xì)胞和懸浮生長(zhǎng)型細(xì)胞，前者體外培養(yǎng)時(shí)只有附著于特定的物質(zhì)表面才得以生長(zhǎng)繁殖，而后者在體外培養(yǎng)時(shí)不需要任何附著物，懸浮狀態(tài)下即可完成整個(gè)生長(zhǎng)繁殖過程。為了達(dá)到生產(chǎn)要求，需要擴(kuò)大細(xì)胞培養(yǎng)的體積及提高細(xì)胞培養(yǎng)密度，規(guī)?；?xì)胞培養(yǎng)技術(shù)主要是在pH、溫度、培養(yǎng)基成分等條件可控下，運(yùn)用生產(chǎn)設(shè)備培養(yǎng)細(xì)胞使之達(dá)到較高密度用于生產(chǎn)相應(yīng)生物制品的技術(shù)，主要培養(yǎng)方式有貼壁培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)和固定化培養(yǎng)。

1.1 貼壁培養(yǎng)

規(guī)?；N壁培養(yǎng)的經(jīng)典方法是轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)。轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)是將貼壁細(xì)胞置于經(jīng)過表面處理的轉(zhuǎn)瓶?jī)?nèi)，同時(shí)注入一定量培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)瓶以一定轉(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn)，細(xì)胞交替接觸空氣和培養(yǎng)液，以維持細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖。最早由Wells R P[6]于1870年申請(qǐng)了轉(zhuǎn)瓶的相關(guān)專利，以圓形培養(yǎng)瓶置于轉(zhuǎn)軸上旋轉(zhuǎn)，從而加大細(xì)胞的貼壁面積，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行規(guī)?；囵B(yǎng)。此后，研究者們以最大限度的增大轉(zhuǎn)瓶的內(nèi)表面積為目的設(shè)計(jì)了多種內(nèi)部結(jié)構(gòu)，以進(jìn)一步提高細(xì)胞量。如1976年到1991年間，分別提出了在轉(zhuǎn)瓶中加入塑料卷軸、中空環(huán)形小室、泡沫型多孔填充物及波浪形內(nèi)壁等設(shè)計(jì)，此外于1999年和2004年打破以往的圓形轉(zhuǎn)瓶的設(shè)計(jì)，出現(xiàn)了多角形轉(zhuǎn)瓶和螺旋形轉(zhuǎn)瓶，這些設(shè)計(jì)都在一定程度上增大了細(xì)胞密度，提高了產(chǎn)量。

轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)作為傳統(tǒng)的規(guī)?；N壁培養(yǎng)方式，結(jié)構(gòu)及操作相對(duì)簡(jiǎn)單，耗資少，只需簡(jiǎn)單增加轉(zhuǎn)瓶數(shù)目即可實(shí)現(xiàn)擴(kuò)大培養(yǎng)，產(chǎn)品收獲方便。早期應(yīng)用廣泛，為基于細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)的藥物及疫苗做出了貢獻(xiàn)。但由于其所需勞動(dòng)強(qiáng)度較大，培養(yǎng)參數(shù)無(wú)法檢控，難以實(shí)現(xiàn)均一化，使得批間差異較大，有限的貼附面積限制了產(chǎn)量的進(jìn)一步提高等原因，以及懸浮培養(yǎng)及固定化技術(shù)的出現(xiàn)和不斷成熟，使得轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)技術(shù)逐漸被淘汰?！吨腥A人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告》第1708號(hào)中明確規(guī)定，自2012年2月1日起，各省級(jí)獸醫(yī)行政管理部門停止對(duì)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)生產(chǎn)方式的獸用細(xì)胞苗生產(chǎn)線項(xiàng)目的獸藥GMP驗(yàn)收申請(qǐng)[7]。

1.2 懸浮培養(yǎng)

規(guī)?；瘧腋∨囵B(yǎng)方式類似于微生物發(fā)酵，即細(xì)胞在生物反應(yīng)器中隨著培養(yǎng)液的運(yùn)動(dòng)而處于分散懸浮的狀態(tài)進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖，達(dá)到較高的密度，進(jìn)而用于生產(chǎn)各種產(chǎn)品。懸浮培養(yǎng)可分為全懸浮培養(yǎng)和貼壁微載體懸浮培養(yǎng)，微載體懸浮培養(yǎng)也屬于固定化培養(yǎng)方式，通常所說的懸浮培養(yǎng)是指全懸浮培養(yǎng)。以懸浮培養(yǎng)方式進(jìn)行規(guī)模化細(xì)胞培養(yǎng)始于1965年。Capstick P B等[8]于1962年馴化貼壁生長(zhǎng)型細(xì)胞乳倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(baby hamster kidney 21，BHK-21)進(jìn)行懸浮生長(zhǎng)，并于1965年借鑒微生物發(fā)酵原理在不銹鋼發(fā)酵罐中懸浮培養(yǎng)BHK-21細(xì)胞用于獸用疫苗生產(chǎn)，獲得成功[9]。規(guī)模化懸浮培養(yǎng)因其諸多優(yōu)點(diǎn)，自出現(xiàn)便備受關(guān)注，成為研究熱點(diǎn)[10]。

規(guī)模化懸浮培養(yǎng)最大的優(yōu)勢(shì)在于通過更為精確有效的工藝控制手段，在獲得最大產(chǎn)量的同時(shí)能穩(wěn)步提高產(chǎn)品的質(zhì)量。進(jìn)行懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞屬于非貼壁依賴性細(xì)胞，具有傳代方便(不需消化處理)，易于收獲細(xì)胞等特點(diǎn)，除此以外，規(guī)?；瘧腋∨囵B(yǎng)借鑒于微生物發(fā)酵?；谖⑸锇l(fā)酵擁有較成熟的理論和經(jīng)驗(yàn)，以生物反應(yīng)器為生產(chǎn)設(shè)備的懸浮培養(yǎng)技術(shù)迅速發(fā)展起來(lái)，其自動(dòng)化程度高，節(jié)省了人力的同時(shí)也降低了因人為操作而造成的污染，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，隨時(shí)掌握細(xì)胞用于生產(chǎn)的最佳狀態(tài)，進(jìn)而提高了產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量，放大效應(yīng)小，大大提高了細(xì)胞密度等。此外，由于血清的使用造成的成本高，批間差異大，生產(chǎn)工藝及產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定，以及后續(xù)純化過程復(fù)雜等原因[11]，使得無(wú)血清培養(yǎng)液的研發(fā)及使用越來(lái)越受到關(guān)注，而懸浮培養(yǎng)過程恰可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的無(wú)血清生長(zhǎng)過程。眾多優(yōu)勢(shì)之處使得規(guī)?；瘧腋∨囵B(yǎng)成為了動(dòng)物細(xì)胞規(guī)?；囵B(yǎng)的理想模式。

實(shí)現(xiàn)規(guī)模化懸浮培養(yǎng)的關(guān)鍵技術(shù)主要有4個(gè)，即貼壁細(xì)胞的馴化改造，個(gè)性化培養(yǎng)基的研制，生物反應(yīng)器的選擇及培養(yǎng)工藝的選擇及優(yōu)化。生產(chǎn)用大多數(shù)細(xì)胞為貼壁生長(zhǎng)型細(xì)胞，要實(shí)現(xiàn)規(guī)模化懸浮培養(yǎng)，第一步就是對(duì)貼壁細(xì)胞進(jìn)行馴化或者改造以適應(yīng)懸浮生長(zhǎng)狀態(tài)。如1997年，一株馬-達(dá)二氏犬腎細(xì)胞(Madin-Darby canine kidney，MDCK)通過連續(xù)傳代的方式被馴化為懸浮細(xì)胞；2009年，另一株MDCK細(xì)胞通過轉(zhuǎn)染入siat7e基因被成功改造[12]。此外還有小鼠骨髓瘤NS0細(xì)胞(mouse myeloma line NS0)、人胚腎細(xì)胞(human embryo kidney-293，HEK293)、 BHK21細(xì)胞、非洲綠猴腎細(xì)胞(African green monkey kidney，Vero)、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(Chinese hamster ovary cell，CHO)和人類視網(wǎng)膜細(xì)胞永生化和細(xì)胞系細(xì)胞(cell line derived from primary human retina cells that were immortalized upon transfection with the E1 region of adenovirus type 5，PER-C6)等實(shí)現(xiàn)了懸浮生長(zhǎng)，并用于生產(chǎn)。其中CHO細(xì)胞因其諸多優(yōu)點(diǎn)，成為工業(yè)化生產(chǎn)重組蛋白應(yīng)用最廣泛的細(xì)胞系[13-14]。隨著多種可用商業(yè)化培養(yǎng)基的開發(fā)和優(yōu)化使得馴化過程變得相對(duì)容易[15]。同時(shí)對(duì)于不含血清培養(yǎng)基的開發(fā)很好的規(guī)避了血清帶來(lái)的弊端，經(jīng)過無(wú)血清培養(yǎng)基、無(wú)動(dòng)物源培養(yǎng)基，到無(wú)蛋白源培養(yǎng)基和化學(xué)成分限定培養(yǎng)基，培養(yǎng)基的開發(fā)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)質(zhì)的飛躍[16]。但是對(duì)于馴化的懸浮細(xì)胞而言，由于不同細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)需求不同，對(duì)懸浮狀態(tài)的適應(yīng)性不同，用于生產(chǎn)的目的也不同，所以需要個(gè)性化的無(wú)血清培養(yǎng)基來(lái)支持。研究表明，個(gè)性化培養(yǎng)基的使用能夠明顯提高產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量[17]。

生物反應(yīng)器作為懸浮培養(yǎng)的關(guān)鍵設(shè)備，必須能夠?yàn)榧?xì)胞生長(zhǎng)、繁殖及代謝提供穩(wěn)定無(wú)菌的環(huán)境，具備良好的混合功能和低剪切力，此外還要具有規(guī)模的可放大性以滿足生產(chǎn)的需要。攪拌式生物反應(yīng)器的建立，成功的解決了懸浮培養(yǎng)過程中細(xì)胞剪切敏感性以及傳氧問題等，成為懸浮細(xì)胞規(guī)?；囵B(yǎng)的首選，迄今為止應(yīng)用最為廣泛[18]，最大體積已達(dá)20 000 m3。與攪拌式生物反應(yīng)器相比，氣升式生物反應(yīng)器因其耗電量低、剪切力低、內(nèi)部無(wú)結(jié)構(gòu)，滅菌更徹底等優(yōu)點(diǎn)，得到一定程度的應(yīng)用，最大體積達(dá)17 000 m3。除此之外，一次性生物反應(yīng)器開發(fā)，因其具有反應(yīng)器預(yù)先滅菌，即開即用，省去在線清洗、滅菌，以及驗(yàn)證，一次性投入低，避免交叉污染等優(yōu)點(diǎn)，很大程度的促進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)的發(fā)展，成為生物制藥領(lǐng)域發(fā)展的一個(gè)重要方向[19-20]。不同反應(yīng)器還要選擇合適的培養(yǎng)工藝，流加培養(yǎng)和灌注培養(yǎng)相比分批培養(yǎng)更有優(yōu)勢(shì)，流加培養(yǎng)在分批培養(yǎng)的基礎(chǔ)上補(bǔ)充新的培養(yǎng)液[21]，灌注培養(yǎng)是增加了截留裝置，保留細(xì)胞始終在反應(yīng)器中而只有培養(yǎng)液的不斷流動(dòng)。灌注培養(yǎng)較好的實(shí)現(xiàn)了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的補(bǔ)給及代謝廢物的排出，成為將來(lái)的發(fā)展趨勢(shì)，但是培養(yǎng)基的利用率較低而且操作及裝置過于復(fù)雜，有待進(jìn)一步的突破和優(yōu)化[22-24]。

懸浮培養(yǎng)技術(shù)盡管有諸多優(yōu)點(diǎn)并且是動(dòng)物細(xì)胞規(guī)?；囵B(yǎng)的理想模式，但仍然存在諸多問題有待解決，如生產(chǎn)用大多數(shù)細(xì)胞為貼壁生長(zhǎng)型細(xì)胞，難以實(shí)現(xiàn)懸浮培養(yǎng)，雖然已有細(xì)胞株能夠滿足蛋白質(zhì)類藥物的生產(chǎn)，但對(duì)于多種病毒疫苗的生產(chǎn)卻難以實(shí)現(xiàn)。此外，反應(yīng)器的剪切力，混合效果及擴(kuò)大培養(yǎng)等問題，雖然得到一定程度的解決，但仍期待更好的解決方案。

1.3 固定化培養(yǎng)

細(xì)胞固定化規(guī)模培養(yǎng)方式來(lái)源于固定化酶技術(shù)，即將細(xì)胞以物理或化學(xué)手段限定于一定空間區(qū)域內(nèi)進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖，達(dá)到較大的細(xì)胞密度，進(jìn)而用于生產(chǎn)。由于生產(chǎn)過程需要細(xì)胞保持較高的活性，因此需要采取相對(duì)溫和的方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定，通常采用吸附法或者包埋法[25]，由此衍生出的固定化規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)有微載體培養(yǎng)，中空纖維系統(tǒng)培養(yǎng)，微囊化培養(yǎng)等，其中微載體技術(shù)最為成熟并且應(yīng)用最廣。

1.3.1 微載體培養(yǎng) 微載體細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)由荷蘭學(xué)者van Wezel A L[26]于1967年提出并創(chuàng)立，微載體的出現(xiàn)和不斷成熟彌補(bǔ)了轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)等傳統(tǒng)貼壁細(xì)胞培養(yǎng)工藝的缺陷，成為貼壁細(xì)胞規(guī)?；囵B(yǎng)的重要方法，也使得細(xì)胞培養(yǎng)的工業(yè)化更上一個(gè)臺(tái)階。

微載體是指一類直徑在60 μm～250 μm的無(wú)毒、非剛性、密度均一的微球型顆粒，允許貼壁依賴性細(xì)胞貼附在其表面進(jìn)而以懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)[27-28]。微載體培養(yǎng)技術(shù)綜合了貼壁培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)，提高了貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)規(guī)模，在有限的空間里提供更大的貼附面積；貼壁細(xì)胞在微載體上生長(zhǎng)失去接觸抑制，可形成多層，獲得更高的細(xì)胞密度；實(shí)現(xiàn)了貼壁細(xì)胞培養(yǎng)的自動(dòng)化可控化管理，減少了人力，降低了污染幾率，提高了產(chǎn)品產(chǎn)量的同時(shí)還保證了質(zhì)量。雖然微載體培養(yǎng)很好的解決了傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)貼壁細(xì)胞存在的問題，但也出現(xiàn)了新的問題，微載體培養(yǎng)繼承了懸浮培養(yǎng)的缺陷，剪切力對(duì)細(xì)胞的損害，凋亡細(xì)胞不及時(shí)的清除等可引起細(xì)胞的大面積死亡；隨著細(xì)胞數(shù)量的增加要及時(shí)補(bǔ)充微載體，但是微載體的補(bǔ)給增加了操作難度和污染幾率；微載體對(duì)細(xì)胞的生物學(xué)作用還不清楚；不能實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)的階段性控制；對(duì)反應(yīng)器的要求更高；此外微載體的價(jià)格普遍昂貴；沒有一種微載體適合所有細(xì)胞；部分微載體難以降解和回收等[29-31]。

1.3.2 中空纖維系統(tǒng)培養(yǎng) 中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)由Knazek P A等[32]于1972年提出。一般的細(xì)胞體外培養(yǎng)是在二維平面上生長(zhǎng)，失去了體內(nèi)的立體空間性，而中空纖維系統(tǒng)很好的模擬了細(xì)胞在體內(nèi)的三維生存狀態(tài)。中空纖維類似于毛細(xì)血管，管壁為半透膜，允許一些小分子物質(zhì)及規(guī)定的物質(zhì)通過。多數(shù)纖維集中于圓筒中構(gòu)成中空纖維培養(yǎng)系統(tǒng)的培養(yǎng)室，纖維內(nèi)外形成兩個(gè)腔室，培養(yǎng)液流動(dòng)于纖維內(nèi)，細(xì)胞生長(zhǎng)在纖維外腔室。該培養(yǎng)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)在于很好的模擬了細(xì)胞在體內(nèi)的三維生長(zhǎng)狀態(tài)；體積小，卻能夠在很小的體積里提供相當(dāng)大的表面積，供細(xì)胞高密度生長(zhǎng)；不存在剪切力對(duì)細(xì)胞的破壞；細(xì)胞生長(zhǎng)周期長(zhǎng)；通過選擇半透膜孔徑就可以控制某些代謝物質(zhì)的流動(dòng)，從而控制對(duì)細(xì)胞的影響或者濃縮產(chǎn)物；獲得高濃度和高純度的產(chǎn)物。缺點(diǎn)在于對(duì)于細(xì)胞的觀察比較困難；物質(zhì)的流動(dòng)造成纖維膜的堵塞；過量氣體的產(chǎn)生或者細(xì)胞的生長(zhǎng)破壞纖維。

1.3.3 微囊化培養(yǎng) 微囊培養(yǎng)起源于20世紀(jì)70年代，屬于包埋法，卻又區(qū)別于傳統(tǒng)的包埋法(僅將細(xì)胞包埋入生化材料內(nèi))，它是以選擇性半透膜同時(shí)包裹擬培養(yǎng)細(xì)胞、培養(yǎng)介質(zhì)及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)形成的微囊體，微囊內(nèi)形成了允許細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境，而微囊處于培養(yǎng)系統(tǒng)大環(huán)境之中，通過半透膜與囊內(nèi)進(jìn)行一定的物質(zhì)交換。該系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)在于半透膜的存在保護(hù)了細(xì)胞免受剪切力等物理?yè)p傷；獲得高的細(xì)胞密度；產(chǎn)物濃度高，方便純化處理等。缺點(diǎn)在于微囊的制作過程復(fù)雜，成功率不高，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)難以控制[33]，微囊內(nèi)死亡細(xì)胞極易影響活細(xì)胞以及產(chǎn)物的形成，另外產(chǎn)物的收集必須破壁，無(wú)法實(shí)現(xiàn)連續(xù)化生產(chǎn)等[34]。微囊化培養(yǎng)更多的趨向于臨床應(yīng)用[35]。

2 問題及展望

自實(shí)行動(dòng)物細(xì)胞規(guī)?；囵B(yǎng)以來(lái)，以細(xì)胞培養(yǎng)為基礎(chǔ)的各種產(chǎn)品在產(chǎn)量和質(zhì)量上都有了飛躍性的發(fā)展。但是各種培養(yǎng)技術(shù)和方法都存在著阻礙其廣泛應(yīng)用的不足之處，諸如生產(chǎn)用細(xì)胞多數(shù)為貼壁細(xì)胞，難以實(shí)現(xiàn)懸浮培養(yǎng)；微載體的關(guān)鍵技術(shù)為少數(shù)大公司所有，使得微載體使用的成本高；中空纖維培養(yǎng)技術(shù)纖維材料還有待開發(fā)；各種反應(yīng)器還不能夠更好的符合各種培養(yǎng)方法的要求；一次性反應(yīng)器的體積還有待增大；無(wú)血清培養(yǎng)基開發(fā)成本高，使用范圍窄等。在科技不斷發(fā)展的今天，這些不足有待更新和改善，以更好地實(shí)現(xiàn)細(xì)胞規(guī)?；囵B(yǎng)。而作為動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的理想方式，無(wú)血清全懸浮培養(yǎng)體系的建立，將可以從根本上解決動(dòng)物細(xì)胞規(guī)模放大問題，以更好的符合生物醫(yī)藥行業(yè)的發(fā)展和需求。

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