邱 剛，芮亞培，劉鎖珠，李 坤，韓照清，黃淑成，羅厚強(qiáng)，蘭彥芳，李家奎*

(1.西藏農(nóng)牧學(xué)院動物科學(xué)學(xué)院，西藏林芝 860000；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院動物醫(yī)學(xué)院，湖北武漢 430070)

豬支原體肺炎是由豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae)引起的一種慢性消耗性傳染病，又稱豬地方流行性肺炎[1]。該病在我國養(yǎng)豬業(yè)中常見多發(fā)，給藏豬養(yǎng)殖帶來較大經(jīng)濟(jì)損失。環(huán)境變化和豬肺炎支原體侵襲是導(dǎo)致該病的主要原因[2]。雖然豬肺炎支原體單純感染時(shí)往往表現(xiàn)出感染率高而病死率低，但豬肺炎支原體作為其他感染性疾病的先導(dǎo)，通過侵襲呼吸道導(dǎo)致呼吸道纖毛黏結(jié)、折斷、脫落，為其他病原如豬繁殖與呼吸綜合征病毒、圓環(huán)病毒2型、巴氏桿菌、鏈球菌等的感染提供重要的條件，引起病死率上升。

藏豬主要分布于海拔2 900 m～4 100 m的高原地帶，在藏豬的棲息地晝夜溫差可達(dá)20℃以上，藏豬生長于野外并沒有圈舍用來抵御嚴(yán)寒，在較為極端的環(huán)境下，呼吸道疾病在藏豬群中較為常見。據(jù)調(diào)查，散養(yǎng)藏豬均未經(jīng)豬肺炎支原體疫苗免疫接種，因此豬肺炎支原體易于通過帶菌豬向豬群傳播[3-5]。藏豬地方性肺炎臨床癥狀多表現(xiàn)為咳嗽、哮喘、生產(chǎn)性能下降，主要病理變化是肺部實(shí)變，血管周圍和細(xì)支氣管周圍淋巴細(xì)胞浸潤，出現(xiàn)Ⅱ型肺泡細(xì)胞增生和肺泡炎癥。

迄今為止，關(guān)于藏豬地方性肺炎的研究報(bào)道極少，事實(shí)上在藏豬養(yǎng)殖中該病危害很大，常給當(dāng)?shù)仞B(yǎng)豬業(yè)帶來重大經(jīng)濟(jì)損失。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)是一種準(zhǔn)確、高效、經(jīng)濟(jì)的檢測方法[6-7]，因此，本試驗(yàn)采用ELISA對隨機(jī)采樣的藏豬群進(jìn)行豬肺炎支原體流行病學(xué)調(diào)查，以了解該病在藏豬群中的流行情況，為藏豬支原體肺炎防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)用動物 各生長階段藏豬454頭，分布于藏豬原產(chǎn)地西藏林芝地區(qū)米林縣、林芝縣和工布江達(dá)縣。

1.1.2 主要試劑 豬肺炎支原體抗體檢測試劑盒(IDEXX，M.hyo. Ab Test kit)，北京愛德士元亨生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器和耗材 酶標(biāo)儀(Thermo Scientific Multiskan MK3型)，Thermo fisher公司產(chǎn)品；離心機(jī)(Sigma 3K15)，Sigma公司產(chǎn)品；微量移液器， Eppendorf公司產(chǎn)品；超凈工作臺(SW-CJ-2F)，成都一恒科技有限公司產(chǎn)品；未添加抗凝劑一次性負(fù)壓真空采血管(5 mL)，江蘇美康醫(yī)療檢驗(yàn)用品公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 在林芝地區(qū)林芝縣、米林縣和工布江達(dá)縣的牧區(qū)，隨機(jī)對牧民散養(yǎng)的成年藏豬頸靜脈采血，藏仔豬采用前腔靜脈采血，記錄采樣地點(diǎn)，性別，生長階段，共收集454份藏豬血液樣品，及時(shí)送往西藏農(nóng)牧學(xué)院獸醫(yī)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室以3 000 r/min離心，分離血清，置-20℃儲存，備用。

1.2.2 豬肺炎支原體抗體陽性率測定 藏豬血清樣品室溫(15℃～25℃)解凍，在使用前用樣品稀釋液將被檢樣品進(jìn)行40倍稀釋(將10 μL樣品加入390 μL稀釋液中)。10倍濃縮洗液恢復(fù)到18℃～26℃，搖動混合，使析出的鹽類完全溶解。在使用前用蒸餾水或去離子水將濃縮的洗液(10×)進(jìn)行10倍稀釋。所有試劑在使用前恢復(fù)至18℃～26℃，旋轉(zhuǎn)或顛倒混勻。ELISA具體操作按說明書進(jìn)行。

1.2.3 判定標(biāo)準(zhǔn) 當(dāng)陽性對照平均值減去陰性對照平均值的差值大于或等于0.150；陰性對照平均值小于或等于0.150 的時(shí)候，檢測結(jié)果有效。M.hyo抗體是否存在是由樣品OD 650 nm與陽性對照平均值的比值(S/P)決定。陽性對照是標(biāo)準(zhǔn)化的，它代表豬血清或血漿中的有效抗體水平。樣品的相對抗體水平按照說明書計(jì)數(shù)。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析 不同性別、地域和生長階段的藏豬支原體肺炎血清陽性率數(shù)據(jù)通過Spss19.0軟件進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，檢驗(yàn)雙向進(jìn)行，當(dāng)P<0.05時(shí)表明差異顯著。

2 結(jié)果

由表1可知，454份血清樣品中共計(jì)330份經(jīng)豬肺炎支原體抗體ELISA試劑盒檢測為陽性，血清陽性率為72.69%。在454份血清樣品中，290份采自林芝縣，血清陽性率75.17%，148份采自米林縣，血清陽性率68.24%，16份采自工布江達(dá)縣，血清陽性率為68.75%。以上3個(gè)縣的血清陽性率經(jīng)卡方檢驗(yàn)差異不顯著(P>0.05)，林芝縣散養(yǎng)藏豬肺炎支原體血清陽性率高于米林縣和工布江達(dá)縣。

由表2可知，根據(jù)性別統(tǒng)計(jì)，雄性藏豬血清陽性率為70.92%，而雌性藏豬為75.40%，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析二者差異不顯著(P>0.05)，但雌性藏豬肺炎支原體血清陽性率更高。

表1 不同地域藏豬肺炎支原體血清陽性率

由表3可知，根據(jù)生長階段統(tǒng)計(jì)，種公豬、繁殖母豬、屠宰豬、肥育豬、育成豬、仔豬的血清陽性率分別為33.33%、50.00%、67.74%、76.38%、74.78%和79.17%，差異顯著(P<0.05)。其中藏仔豬肺炎支原體陽性率最高，在150日齡以內(nèi)藏仔豬M.hyo抗體陽性率為79.17%，然后隨著年齡增長呈現(xiàn)出下降的趨勢，至育成階段(150日齡～360日齡,16 kg～24 kg) 下降為74.78% ；到育肥階段的(361日齡～460日齡,25 kg～40 kg)又有所上升達(dá)到76.38%，到屠宰階段(>460日齡,>40 kg)下降為67.74%。

結(jié)果證實(shí)，在西藏林芝各地，無論性別，在藏豬生長發(fā)育的各個(gè)階段，豬支原體肺炎已經(jīng)在藏豬群中廣泛傳播，嚴(yán)重影響藏豬的生長發(fā)育，危害巨大，已經(jīng)成為需要加以關(guān)注的藏豬主要疫病，必須采取適當(dāng)措施對該病加以防控。

表2 不同性別藏豬肺炎支原體血清陽性率

表3 不同生長階段藏豬肺炎支原體血清陽性率

注：成年雄性藏豬(>460日齡,>40 kg)，藏母豬(>460日齡,>40 kg)，屠宰藏豬(>460日齡,>40 kg)，育肥藏豬(361日齡～460日齡,25 kg～40 kg)，育成藏豬 (150日齡～360日齡,16 kg～24 kg)，藏仔豬(<150日齡，<16 kg);角標(biāo)相同字母表示差異不顯著(P>0.05)；不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note：Adult male Tibetan pigs(>460 days,>40 kg)，adult female Tibetan pigs(>460 days, >40 kg)，slaughter Tibetan pigs(>460 days,>40 kg)，fattening Tibetan pigs(361 days-460 days, 25 kg-40 kg),growing Tibetan pigs(150 days-360 days,16 kg-24 kg)，Piglets of Tibetan pigs (<150 days, <16 kg);The same letters indicate no significant difference in the same column(P>0.05),and with different letters mean significant difference(P<0.05).

3 討論

藏豬為高原小型豬種，生長緩慢，與規(guī)模化養(yǎng)殖生長速度較快的其他品種豬不同，在仔豬階段所檢測的血清大部分采自60日齡以上的群體，因此母源抗體對最終結(jié)果的干擾比較有限，檢測結(jié)果基本反映的是M.hyo的感染情況。試驗(yàn)結(jié)果表明，藏豬肺炎支原體感染相對嚴(yán)重，尤其是肥育豬、育成豬和仔豬，三者豬肺炎支原體血清陽性率高達(dá)76.38%、74.78%和79.17%。M.hyo由母豬向仔豬傳播很可能是導(dǎo)致藏豬生長早期階段血清陽性率居高不下的主要原因。寒冷的自然環(huán)境，粗放的管理方式和病原體的感染可能是導(dǎo)致藏豬肺炎支原體感染率較高的原因。大多數(shù)有呼吸道癥狀的藏豬其血清為豬肺炎支原體陽性。細(xì)菌的分離和培養(yǎng)仍然是確診該病的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但豬肺炎支原體是公認(rèn)難于培養(yǎng)和非常費(fèi)時(shí)的病原微生物之一。盡管PCR具有稍高的靈敏度和特異性，ELISA試劑盒與之相比具有在基本保證準(zhǔn)確性的前提下縮短檢測時(shí)間和降低成本的優(yōu)勢，尤其對于藏豬群體水平的檢測。Peter報(bào)道稱帶菌野豬并不表現(xiàn)出明顯的肺部病變而假定野豬僅僅是亞臨床感染[9]，本次檢測結(jié)果與此一致。藏豬的豬肺炎支原體感染率顯然高于時(shí)新春等[10]對于藏豬支原體肺炎流行病學(xué)調(diào)查的報(bào)道(陽性率為58.86%)，可能原因是藏豬支原體肺炎的感染是一個(gè)動態(tài)過程，不同的時(shí)期、不同的采樣地點(diǎn)、不同豬群對檢測結(jié)果具有一定的影響。并且，顯然以前的報(bào)道中并未發(fā)現(xiàn)屠宰藏豬的肺部眼觀病變比例較高。

與其他傳染病一樣，預(yù)防接種是一個(gè)行之有效的預(yù)防藏豬地方流行性肺炎的方法，但是據(jù)調(diào)查，由于當(dāng)?shù)貍鹘y(tǒng)而粗放的管理方式，對該病的危害認(rèn)識不足，以及政府并未將該病列入重大動物疫病防疫范圍，多種客觀條件制約之下，大多數(shù)藏豬并未接種豬肺炎支原體疫苗。藏豬地方流行性肺炎的防控措施包括參考集約化豬場凈化豬支原體肺炎的瑞士減群法或其改良方法,加強(qiáng)飼養(yǎng)管理早期隔離斷奶(SEW)和“三點(diǎn)式”分區(qū)管理生產(chǎn)方式(將哺乳仔豬、保育仔豬及育肥豬分開飼養(yǎng)以達(dá)到減少或切斷病原從母豬傳播給仔豬的目的)、適當(dāng)使用藥物和疫苗[8]。基于藏豬放牧和社會性動物的特點(diǎn)，藏豬地方流行性肺炎易于在豬群內(nèi)和豬群間傳播，并且最常表現(xiàn)在母豬與仔豬中傳播[11]。豬肺炎支原體滅活苗與弱毒苗已經(jīng)廣泛使用，但據(jù)報(bào)道并不能達(dá)到100%防治該病的目的，可能是因?yàn)椴溉樽胸i疫苗接種過早，受母源抗體影響，產(chǎn)生抗體滴度不足，特定疫苗對藏豬保護(hù)力不佳等所致。早期疫苗注射需要配合其他綜合措施及藥物治療才能有效遏制該病發(fā)生與傳播。對于豬群凈化豬肺炎支原體的措施，可以對瑞士減群法或其改良方法再次加以合理改進(jìn)[12]，充分結(jié)合西藏本地實(shí)際，增設(shè)仔豬保育圈舍及設(shè)施，將母豬和仔豬適當(dāng)隔離，再配合藥物治療發(fā)病豬，對未發(fā)病豬群進(jìn)行合理的預(yù)防接種，通過一定時(shí)期多種措施的應(yīng)用，應(yīng)當(dāng)可以有效的降低M.hyo的感染率和發(fā)病率，從而逐漸凈化豬群。在藥物的使用上四環(huán)素類的多西環(huán)素，大環(huán)內(nèi)酯類的泰樂菌素，替米考星與泰萬菌素，氟喹諾酮類的甲磺酸達(dá)氟沙星與恩諾沙星，截短側(cè)耳素類的沃尼妙林等仍然是防控豬支原體肺炎的主要藥物。據(jù)報(bào)道，歐洲各國已經(jīng)使用泰拉霉素結(jié)合瑞士減群法成功凈化多個(gè)規(guī)模化豬場，此法可以在感染嚴(yán)重的藏豬群中加以合理使用。

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