劉希華， 江丹丹， 文 欣

(1.福建省資源環(huán)境監(jiān)測與可持續(xù)經(jīng)營利用重點實驗室，福建三明 365004； 2.三明學(xué)院資源與化工學(xué)院，福建三明 365004)

小飛蓬(Conyzacanadensis)別稱加拿大飛蓬，屬菊科白酒草屬，為一年生草本植物，廣泛分布在福建省各地，具有生命力強(qiáng)、生長迅速、生物量大的特點，在礦區(qū)有很強(qiáng)的生長優(yōu)勢。楊剛等對四川甘洛鉛鋅礦廢棄礦區(qū)和尾礦庫區(qū)自然生長的15種草本植物進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，不同植物地上部分體內(nèi)重金屬鉛(Pb)、鋅(Zn)、鎘(Cd)的富集量以小飛蓬最高[1]，小飛蓬富集土壤中Pb的方式是利用它們植物穩(wěn)定化(固定化)的作用吸收固定土壤中的Pb[2]，其中葉片吸收囤積的重金屬元素最多，達(dá)到147.105 8 mg/kg，遠(yuǎn)高于其根、莖部所吸收囤積的重金屬元素量。因此，在治理土壤中的鉛污染時，可以通過大面積收割鉛污染區(qū)小飛蓬地上部分來治理回收利用重金屬[3]。

對福建省重金屬污染現(xiàn)狀的調(diào)查結(jié)果表明，重點防控的重金屬污染物為鉻(Cr)、鉛(Pb)，而三明市則以鉛為重點防控的重金屬污染。小飛蓬生長緩慢，植株矮小，地上部生物量小，在實際應(yīng)用中受到很大的限制。植物內(nèi)生細(xì)菌(endophytic bacteria)是從植物內(nèi)部得到的并且可以定殖于健康植物體內(nèi)的，或者從表面消毒的植物組織中分離得到的各類菌，但是不會改變植物的表型特征和功能[4]。學(xué)者們通過研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生細(xì)菌對植物的生長具有促進(jìn)作用，不僅可以緩解重金屬的毒性，而且會對土壤中的重金屬生物有效性產(chǎn)生影響[5-11]。目前，在內(nèi)生細(xì)菌與植物相聯(lián)合對重金屬污染的土壤進(jìn)行修復(fù)方面已經(jīng)有了一些研究，還取得了很好的治理效果[12-14]，但是對小飛蓬內(nèi)生菌的研究還未見報道。本研究以小飛蓬根莖葉為材料，采用常規(guī)方法分離內(nèi)生細(xì)菌并對其進(jìn)行生理生化和分子進(jìn)化檢測，以了解小飛蓬耐鉛內(nèi)生細(xì)菌種類組成，嘗試從內(nèi)生細(xì)菌特性方面對小飛蓬的耐鉛脅迫特性進(jìn)行探索。

1 材料與方法

1.1 材料與方法

1.1.1 小飛蓬 野生盆栽小飛蓬，等小飛蓬長到高約為 50 cm 時，分別用配制的濃度梯度為0(空白對照組)、0.3、0.6、0.9、1.2 mmol/L的硝酸鉛溶液澆灌盆栽小飛蓬，3 d澆灌1次，1個月后，正常澆自來水2個月，采集長勢好、無病害小飛蓬根、莖、葉3個部分進(jìn)行內(nèi)生細(xì)菌分離。

1.1.2 培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：3 g/L牛肉膏，10 g/L蛋白胨，5 g/L NaCl，固態(tài)培養(yǎng)基另加瓊脂20 g/L，調(diào)節(jié)pH值至7.4，121 ℃滅菌20 min。

配制鉛濃度分別為0、0.3、0.6、0.9、1.2 mol/mL的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。

1.2 內(nèi)生細(xì)菌的分離和純化

將小飛蓬根、莖、葉3個部分分別用5%洗潔精浸泡 5 min，于流水下沖洗干凈，在無菌操作臺上，用75%乙醇振蕩沖洗 2 min，再用無菌水振蕩沖洗5次，以最后1次漂洗液涂布于培養(yǎng)基上做滅菌效果檢測。將滅菌材料置于無菌研缽中，加入適量無菌磷酸緩沖鹽溶液(PBS)和石英砂進(jìn)行研磨至漿狀。將勻漿液轉(zhuǎn)入離心管中，2 000 r/min離心2 min，取上層澄清液涂布于固態(tài)培養(yǎng)基中，每個鉛濃度設(shè)3次重復(fù)。于37 ℃培養(yǎng)至長出單菌落，反復(fù)劃線至得到純培養(yǎng)菌株。

1.3 形態(tài)及生理生化鑒定

純化菌株采用常規(guī)方法進(jìn)行革蘭氏染色、檸檬酸鹽反應(yīng)、接觸酶反應(yīng)、甲基紅試驗和VP試驗等檢驗[15]。

1.4 分子鑒定

采用3S柱離心式環(huán)境樣品DNA回收試劑盒V2.2提取分離菌株基因組DNA，以通用引物8f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492r(5′-GGTTACCTT GTTACGACTT-3′)(上海華大基因科技有限公司)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。50 μL PCR擴(kuò)增體系如下：5 μL 10×PCR buffer(2.0 mmol/L MgCl2)，4 μL dNTPs(10 mmol/L )，1 μL 8f(10 mmol/L)，1 μL 1492r(10 mmol/L)，1 μLTaqDNA聚合酶(2.5 U/μL)，1 μL模板DNA。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35個循環(huán)；72 ℃ 7 min。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物?；厥? 700 bp左右的PCR產(chǎn)物并連接到pMD19-T Vector，挑取陽性克隆送往上海華大基因公司測序。

序列經(jīng)Blast進(jìn)行最大相似性比對，用 Clustal X 1.83[16]進(jìn)行同源性分析，用來自MEGA(2.1)的鄰接(neighbor-joining，簡稱NJ)法[16]構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生菌的分離與純化

小飛蓬表面滅菌處理后，經(jīng)涂布檢測表明滅菌徹底。通過小飛蓬不同部位、不同鉛濃度培養(yǎng)基平板的分別培養(yǎng)，共分離到31株內(nèi)生細(xì)菌，在根的部位分離到14株，莖的部位分離到7株，葉的部位分離到10株(表1)。在不同鉛離子濃度的平板培養(yǎng)基上，0、1.2 mol/mL鉛離子濃度培養(yǎng)基中無菌株產(chǎn)生；0.3 mol/mL鉛離子濃度培養(yǎng)基上分離到最多的內(nèi)生菌，達(dá)到13株；0.9 mol/mL鉛離子濃度培養(yǎng)基上分離到11株內(nèi)生菌；0.6 mol/mL鉛濃度培養(yǎng)基上分離到7株內(nèi)生菌。

2.2 形態(tài)學(xué)與耐鉛生理濃度檢測

由表2可以看出，經(jīng)革蘭氏染色、顯微鏡觀察，所有菌株均為G+菌，接觸酶反應(yīng)都為陽性(+)，甲基紅試驗測定結(jié)果均為陰性(-)，24株菌檸檬酸鹽反應(yīng)結(jié)果為陽性(+)，21株菌VP試驗結(jié)果為陽性(+)。

表1 小飛蓬分離菌株情況

表2 生理生化結(jié)果

2.3 內(nèi)生菌株16S rDNA基因序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

對小飛蓬31株內(nèi)生細(xì)菌DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，擴(kuò)增產(chǎn)物長度均為1 500 bp左右。小飛蓬內(nèi)生細(xì)菌的16S rDNA測序結(jié)果表明，部分內(nèi)生菌為同種，經(jīng)過合并歸類后，得到5種小飛蓬內(nèi)生菌(CC2、CC6、CC14、CC16和CC23)。經(jīng)過BLAST檢索，找到與之相似性最高的種屬。

將上述5個菌株與其同源性較高的菌株16S rDNA序列利用MEGA(2.1)程序包構(gòu)建發(fā)育樹(圖1)。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹，可以推斷CC2、CC6、CC16和CC23在遺傳距離上較為接近，聚為一類。同時，從遺傳距離上來看，這4個菌株與短芽孢桿菌屬(Brevibacillussp.)較為接近，表明這4個菌株與短芽孢桿菌屬在系統(tǒng)發(fā)育上的親緣關(guān)系較近。CC14則與節(jié)桿菌屬(Arthrobactersp.)在遺傳距離上較為接近，表明這二者在系統(tǒng)發(fā)育上的親緣關(guān)系較近。根據(jù)16S rDNA分類標(biāo)準(zhǔn)，一般認(rèn)為，屬于同一個種的16S rDNA序列同源性大于99%，歸為一個屬的可以認(rèn)為同源性在95%～99%之間。據(jù)此推斷，所分離的小飛蓬內(nèi)生細(xì)菌CC2、CC6、CC16和CC23是短芽孢桿菌屬，CC14是節(jié)桿菌屬。

3 結(jié)論與討論

本研究通過分離純化鉛脅迫下的小飛蓬根莖葉的內(nèi)生菌，共得到31株內(nèi)生細(xì)菌，在根的部位分離到14株細(xì)菌，在莖的部位分離到7株細(xì)菌，在葉的部位分離到10株細(xì)菌。得到的菌株經(jīng)過革蘭氏染色等生理生化檢測和內(nèi)生菌基因組DNA提取、16S rDNA擴(kuò)增和系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建等分子檢測分析方法，推測所分離到的菌株中CC2、CC6、CC16和CC23是短芽孢桿菌屬，CC14是節(jié)桿菌屬。植物內(nèi)生菌是與植物組織共生在一起的，長期存在于植物組織內(nèi)部，內(nèi)生菌的存在能促進(jìn)植物生長，在某些重金屬污染地區(qū)，可增強(qiáng)植物抗逆能力，提高生物修復(fù)能力[17]?？乱暗葟拇髮毶降V區(qū)重金屬污染的土壤中分離到類短短芽孢桿菌(B.parabrevis)，對發(fā)酵液中鉛的去除效率高達(dá)30.27%[18]，但并未探明該菌株富集鉛離子的機(jī)制。節(jié)桿菌菌屬菌株對沉淀態(tài)鉛有很強(qiáng)的活化效能[19]，以及對鉛的高抗性水平[20]、吸附鉛效果較好[21]等一些富集鉛的功能。對節(jié)桿菌富鉛的生理生化研究也表明，節(jié)桿菌菌屬菌株對鉛的吸附主要是通過細(xì)胞成分中的磷酸基團(tuán)、羰基、羥基、酰胺基團(tuán)、羧基等活性基團(tuán)與鉛離子發(fā)生絡(luò)合作用[21]，吸附鉛后可誘導(dǎo)鉛離子在細(xì)菌表面形成含鉛的礦物[22]。本研究首次從植物(小飛蓬)中分離到鉛富集內(nèi)生菌菌株(短芽孢桿菌屬和節(jié)桿菌屬)，說明這些菌株是可以與植物進(jìn)行共生的，但是由于小飛蓬生長緩慢，所以在植物修復(fù)重金屬污染方面的效果不明顯，因此下一步的試驗將著眼于將分離的菌株與其他生長快速、生物量大的植物進(jìn)行共生，將有助于重金屬污染地區(qū)的土壤修復(fù)研究。

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