趙愛靜 ， 付嬌嬌 ， 宋雪迎 ， 孫曉紅 ，2，3， 潘迎捷 ，2，3， 趙 勇 *，2，3

（1.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海 201306；2.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306；3.農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（上海），上海 201306）

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是一種常見的食源性致病菌，尤其在夏秋季節(jié)，因誤食污染的水產(chǎn)品而引發(fā)的急性腸胃炎、原發(fā)性敗血癥等疾病時(shí)有發(fā)生，對(duì)食品安全構(gòu)成了巨大威脅。國家食源性疾病監(jiān)測(cè)網(wǎng)數(shù)據(jù)顯示，VP引起的食物中毒，發(fā)生規(guī)模及人群暴露規(guī)模呈明顯上升趨勢(shì)，已高居我國微生物性食物中毒首位[1]。在正常的少鹽或無鹽環(huán)境中，VP是不容易繁殖的，因此，在不利環(huán)境中極有可能以一種特殊的保持自身有利生存的狀態(tài)存在，即生物被膜。

生物被膜（Biofilm，BF）指的是附著于各種載體表面的細(xì)菌細(xì)胞和包裹細(xì)菌的由細(xì)菌自身所分泌的含水聚合性基質(zhì)所組成的結(jié)構(gòu)性無柄細(xì)菌群落[2]。食源性致病菌易在食品及其加工、運(yùn)輸和保藏設(shè)備的接觸表面形成BF，并通過殘留、接觸、散播微生物或氣溶膠的方式污染整個(gè)生產(chǎn)環(huán)境，隨機(jī)性強(qiáng)、易被忽視[3-5]。這些形成BF的微生物細(xì)胞自身可以分泌胞外多聚物（EPS），能增強(qiáng)微生物細(xì)胞對(duì)外界環(huán)境因素的抵抗能力，使得常規(guī)殺菌方法不能有效徹底地滅菌，進(jìn)而再次污染食品[3，6]。美國國立衛(wèi)生研究所（NIH）指出，人類細(xì)菌性感染約有65%是由BF 引起的[7]。

溫度、pH、離子強(qiáng)度等環(huán)境條件，以及微生物生長的營養(yǎng)條件等，都會(huì)影響微生物BF的形成[3，8]。近年來，食品接觸材料對(duì)微生物BF形成能力的影響引起廣泛關(guān)注。已有研究指出，食源性致病菌單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌等易在常見的食品接觸材料聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、不銹鋼等表面形成BF，給食品安全帶來了極大風(fēng)險(xiǎn)[9-10]。VP是一種海洋細(xì)菌，主要來源于魚、蝦、蟹、貝類等水產(chǎn)品。在這些水產(chǎn)品運(yùn)輸、加工及貯藏過程中，會(huì)直接或間接接觸各種表面，如魚缸、塑料運(yùn)輸盒、工器具、刀具、桌面、冰箱等，從而使VP易在玻璃、聚苯乙烯、不銹鋼等材料表面附著形成生物被膜。法國報(bào)道稱，60%的食源性疾病是由于生產(chǎn)加工過程中接觸材料表面的微生物污染食品引起的[11]。然而，關(guān)于VP在不同溫度和食品接觸材料交互作用下BF形成情況的研究鮮有報(bào)道。另外，Nilsson等[12]發(fā)現(xiàn)致病血清型與非致病血清型單增李斯特菌BF形成能力的存在差異，而Lianou等[13]則指出沙門氏菌BF的形成與其致病性血清型沒有相關(guān)性。因此，作者模擬致病性與非致病性VP在食品工業(yè)中不同溫度及食品接觸表面BF的形成情況，旨在為通過食品加工環(huán)境對(duì)BF的有效控制提供理論，為食品安全提供保障。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

作者共檢測(cè)了39株VP生物被膜形成情況，其中，致病性菌株22株，非致病性菌株17株（結(jié)果見表1）。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與設(shè)備

結(jié)晶紫：美國sigma公司產(chǎn)品；SYBR GreenⅠ染料：北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；24和96孔板：美國康寧公司產(chǎn)品；BioTek酶標(biāo)儀：美國伯騰儀器有限公司產(chǎn)品；垂直流超凈工作臺(tái)、二級(jí)生物安全柜：Esco China公司產(chǎn)品；MIR154高精度低溫培養(yǎng)箱、MLS-3750型高壓滅菌鍋：日本三洋電機(jī)生物醫(yī)藥株式會(huì)社產(chǎn)品；LSM710型激光掃描共聚焦顯微鏡：德國卡爾蔡司公司產(chǎn)品。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 菌株的活化

用平板劃線法將-80℃冰箱內(nèi)甘油管保藏的菌種接種至TCBS瓊脂培養(yǎng)基，37℃過夜培養(yǎng)，挑取單菌落于5 mL TSB（質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%NaCl）試管中，在37℃、180 r/min的搖床中培養(yǎng)10 h，連續(xù)活化兩次，作為接種液備用（A600nm=0.4）。

2.2 BF的培養(yǎng)

為研究不同食品接觸表面對(duì)BF的影響，選用無菌的聚苯乙烯（簡寫PS，直徑14 mm）、玻璃片（簡寫GS，直徑14 mm）和不銹鋼片（簡寫SS，直徑12.5 mm）作為實(shí)驗(yàn)材料。將以上3種無菌的薄片分別置于24孔板中，并依次加入990 μL的TSB（質(zhì)量分?jǐn)?shù) 3%NaCl），10 μL 的菌液（A600nm=0.4），隨后分別于 4、10、15、25和 37℃培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng) 48 h。

2.3 BF形成能力的檢測(cè)

采用結(jié)晶紫染色法對(duì)菌株BF形成能力進(jìn)行檢測(cè)[14]，并稍作修改。在PS和GS兩種材料表面的BF培養(yǎng)結(jié)束后，棄掉菌液，用無菌PBS輕輕洗滌3次，以除去未粘附的細(xì)菌；待室溫晾干后，加1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的結(jié)晶紫染色30 min；染色結(jié)束后，用無菌水沖洗以去除多余染液，洗滌3次，室溫風(fēng)干；最后加入1 mL體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇洗脫附著的結(jié)晶紫。在600 nm下測(cè)定洗脫液的吸光值。在SS表面的BF培養(yǎng)結(jié)束后，移取SS片至新的24孔板內(nèi)重復(fù)上述步驟。其中每個(gè)樣品重復(fù)6個(gè)孔，以未接種菌液放置PS、GS、SS片的孔板重復(fù)上述操作作為空白對(duì)照。

表1 實(shí)驗(yàn)中所用菌株Table 1 Strains used in this study

2.4 激光共聚焦顯微鏡（CLSM）的觀察

BF經(jīng)PBS輕輕洗3次，去除未附著的細(xì)胞，用體積分?jǐn)?shù)4%戊二醛溶液固定30 min，之后用PBS溶液沖洗 3遍，SYBR GreenⅠ染料避光染色 30 min，PBS溶液清洗3次，取片，在CLSM下觀察。

2.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0軟件對(duì)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），檢驗(yàn)水平為P＜0.05時(shí)為差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并用origin 8.0作圖。另外，變異系數(shù)（Coefficient of Variation，CV）的計(jì)算公式為：變異系數(shù)CV=（標(biāo)準(zhǔn)偏差SD/平均值Mean）×100%。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同溫度條件下VP菌株BF形成情況分析

VP在不同溫度條件下BF形成情況見表2和圖1。低溫4、10、15℃是水產(chǎn)品低溫貯藏中常用溫度，高溫25、37℃是適于VP生成的環(huán)境溫度。由表2可知，在 PS表面，低溫條件下（4～15 ℃），33.3%～48.7%的 VP生成 BF；高溫條件下 （25、37℃），94.9%以上的VP形成BF。在低溫和37℃條件下，僅生成弱粘附性BF；在25℃條件下，則生成強(qiáng)、中粘附性BF，分別占1.28%和1.0%。由圖1（a）可知，25℃條件下BF形成能力較強(qiáng)，且VP-S36菌株在此條件下BF形成量明顯強(qiáng)于其他菌株。總的來說，在PS表面，低溫條件下，VP成膜能力較弱，25℃條件下最強(qiáng)，37℃條件下相對(duì)較強(qiáng)。

在GS材料表面，4～37℃條件下，分別有15（38.5%）、25（64.1%）、29（74.4%）、35（89.7%）和 38（97.4%）株VP生成BF。此結(jié)果表明隨著溫度的升高，VP生成BF能力逐漸增強(qiáng)。Bonaventura等[15]研究指出，在4～37℃變化范圍內(nèi)，單增李斯特菌BF形成能力逐漸增強(qiáng)，與本研究結(jié)果相似。VP在4、10℃條件下，僅生成弱粘附性BF；在15、37℃條件下，分別有2株和14株VP生成中粘附性BF；在25℃條件下則15株生成中粘附性BF，2株生成強(qiáng)粘附性BF。菌株VP-S36在此條件下BF形成量明顯強(qiáng)于其他菌株。結(jié)合圖1（b）可知，25℃條件下，VP成膜能力較強(qiáng)，37℃次之，低溫較弱。

在SS材料表面，4～37℃條件下，成膜菌株數(shù)量分別為18、14、28、29和19株。在低溫條件下生成的BF均呈弱粘附性，在高溫條件下均僅有1株VP生成中粘附性BF。由圖1（c）可知，25℃條件下VP成膜能力較強(qiáng)。因此，在SS材料表面，4℃和10℃條件下，BF形成能力較弱，37℃條件下VP成膜能力稍強(qiáng)，15℃和25℃條件下VP成膜能力較強(qiáng)。

圖1 不同溫度及聚苯乙烯（PS，A）、玻璃（GS，B）、不銹鋼（SS，C）表面VP菌株BF生成量的箱形分布圖Fig.1 Boxplots of biofilm formation by V.parahaemolyticus at different temperatures on polystyrene（PS，A），glass（GS，B） and stainless steel（SS，C）

鞭毛是細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)器官，在BF形成過程中扮演者重要角色，溫度的變化會(huì)影響鞭毛的生成，從而影響B(tài)F的形成[16]。在低溫（4～15℃）下，VP自身生長遲緩，鞭毛的運(yùn)動(dòng)受到抑制，這可能是低溫BF生成能力較弱的重要因素。25℃是VP菌株BF形成的最佳溫度，在此條件下可形成強(qiáng)粘附的BF，可能是由于25℃適宜VP生長，在此溫度下鞭毛生長較快，促進(jìn)了胞外多糖、胞外蛋白等胞外物質(zhì)的分泌，進(jìn)而利于BF的生成。在37℃條件下，VP雖能維持生存但形成BF能力相對(duì)較弱，這可能是胞外酶類物質(zhì)對(duì)高溫敏感的原因所致[4]。因此，建議在以后的食品加工、運(yùn)輸及保藏過程中通過控制溫度抑制VP菌株BF的形成，進(jìn)而降低因其污染而引發(fā)的食品風(fēng)險(xiǎn)。

通過變異系數(shù)分析可知，溫度影響VP菌株BF形成能力的變異性，其變異系數(shù)從大到小排序?yàn)椋篊V（25 ℃）＞ CV（37 ℃）＞ CV（10 ℃）＞ CV（15 ℃）＞CV（4℃），表明25℃對(duì)VP成膜能力變異性影響最大。Lianou等認(rèn)為，沙門氏菌成膜能力變異性在25℃最小[13]，與結(jié)論相反。說明不同種屬的細(xì)菌，溫度對(duì)其BF形成能力變異性的影響存在很大差異。

3.2 不同材料表面VP菌株BF形成情況分析

在低溫條件及不同接觸材料表面VP菌株BF形成情況見表2。在4℃條件下，分別有48.7%、38.5%、46.2%的 VP在 PS、GS和 SS表面生成 BF。因此，在4℃條件下，VP更易在PS材料表面粘附，其次是SS表面，最后是GS表面。在10℃條件下，GS表面64.1%的VP生成BF，而PS和SS材料表面成膜菌株所占比例相對(duì)較低，僅有33.3%和35.9%的VP形成BF。說明在10℃條件下，VP在GS材料表面粘附性較強(qiáng)，在PS和SS材料表面粘附性明顯較弱。在15℃條件下，PS、GS和SS 3種材料表面VP成膜菌株所占比例分別為41.0%、74.4%和71.8%。其中，在GS材料表面，2株VP形成了中粘附性BF。因此，在15℃條件下，VP在GS材料表面成膜能力較強(qiáng)，其次是SS表面，最后是PS表面。

在高溫條件及不同接觸材料表面VP菌株BF形成情況如下：從表2可知，在25℃條件下，PS材料表面，29株VP生成弱粘附性BF，5株VP生成中粘附性BF，4株VP生成強(qiáng)粘附性BF；在GS材料表面，18株、15株、2株VP分別生成弱、中、強(qiáng)粘附性BF；在SS材料表面，28株VP生成弱粘附性BF，1株VP生成中粘附性BF，無強(qiáng)粘附性BF的生成。由此可見，在25℃條件下，SS材料表面VP成膜能力較弱。在37℃條件下，PS表面37株VP形成弱粘附性BF；在GS材料表面，24株VP生成弱粘附性BF，14株生成中粘附性BF；在SS材料表面，19株VP生成BF，其中1株形成中粘附性BF。該結(jié)果表明，在37℃條件下，GS表面成膜能力較強(qiáng)，PS表面次之，SS表面較弱。綜上所述，VP在GS材料表面粘附性較強(qiáng)，在PS表面相對(duì)較強(qiáng)，在SS材料表面較弱。

表2 不同溫度及接觸材料表面VP菌株BF的形成情況Table 2 Biofilm formtaion of V.parahaemolyticus on different surfaces at various temperatures

VP帶負(fù)電荷，極易與帶正電的材料相結(jié)合，而GS帶正電荷，故在GS表面其BF形成能力較強(qiáng)。Meira等[17]研究指出在疏水性材料-聚丙烯表面，金黃色葡萄球菌BF能力強(qiáng)于親水性材料SS表面BF形成能力，與本研究中VP在疏水材料PS比在親水材料SS表面更易粘附的結(jié)果相類似。Rodriguez和Litzler[18-19]等研究表明菌株在SS表面成膜能力與粗糙度無關(guān)，同樣，本研究中SS不光滑的表面并未影響VP生物被膜的形成。Bonsaglia等[16]發(fā)現(xiàn)單增李斯特菌在SS材料表面可形成強(qiáng)粘附性BF，在GS表面大都形成弱粘附性BF，與作者研究結(jié)果相反。說明細(xì)菌在不同材料表面形成BF的能力與其所在菌屬有很大關(guān)系。VP在37℃下，PS和GS表面成膜能力較強(qiáng)，而SS表面較弱，僅有19株VP形成BF。該現(xiàn)象的原因可能是，較PS與GS，SS是一種導(dǎo)熱性良好的材料，在高溫37℃的交互作用下抑制VP鞭毛的生成，進(jìn)而降低BF的形成[16，20]。因此，在食品加工過程中，可通過改換食品接觸材料的方式有效控制VP菌株BF導(dǎo)致的危害。

由變異系數(shù)CV值可知，CV （PS）=74.17%，CV（GS）=56.15%，CV （SS）=35.99%， 說明對(duì)比 3 種材料，PS表面菌株BF形成能力的變異性最大。由表2可知，在PS表面，低溫條件下低于50%的VP形成BF，而高溫條件下超過94.9%的VP形成BF，成膜VP菌株數(shù)量波動(dòng)范圍較大；在GS表面，4～37℃變化范圍內(nèi)，成膜菌株數(shù)量波動(dòng)規(guī)律，呈逐漸上升趨勢(shì)；在SS表面，成膜菌株數(shù)量波動(dòng)范圍較小。因此，PS材料對(duì)VP成膜變異性影響最大。此外，對(duì)影響B(tài)F生成的外界因素進(jìn)行了變異系數(shù)分析，結(jié)果顯示，CV（溫度）=157.4%，CV（接觸材料）=43.4%，說明溫度對(duì)VP成膜影響最大，其次是接觸材料。綜述所述，在食品加工環(huán)境中，不僅要注意接觸材料表面的衛(wèi)生，更要注意控制環(huán)境溫度，以降低BF污染引發(fā)的食品風(fēng)險(xiǎn)。

3.3 致病性菌株與非致病性菌株BF形成情況

致病性菌株與非致病性菌株BF形成情況見表2。對(duì)于弱粘附性BF，在PS表面，主要是由致病性菌株形成的；在GS表面，4～37℃條件下，致病性VP成膜菌株數(shù)量是非致病性VP的1倍以上，尤其是25℃條件下，達(dá)2倍以上；在SS表面，15℃條件下，弱粘附致病性VP是弱粘附非致病性VP的1.5倍，其他溫度下則多于2倍。對(duì)于中粘附性BF，在15℃、GS表面及25℃、PS表面均為致病性菌株形成的；在25℃和37℃、GS表面，一半由致病性菌株生成，一半由非致病性菌株生成。對(duì)于強(qiáng)粘附性BF，在PS表面，3株為非致病性菌株形成，2株為致病性菌株形成；GS表面則均為非致病性菌株形成?？傮w來說，致病性菌株成膜能力明顯強(qiáng)于非致病性菌株（P＜0.05），這可能與致病性、非致病性菌株對(duì)同一外界環(huán)境應(yīng)激反應(yīng)不同有關(guān)。Nilsson等[12]指出，致病性1/2a血清型單增李斯特菌成膜能力更強(qiáng)。綜上，致病性VP成膜能力強(qiáng)于非致病性VP，這一特性從側(cè)面說明了為何VP高居微生物性食物中毒首位。

低溫環(huán)境中，致病性VP成膜能力的變異性大于非致病性菌株；25℃條件下，非致病性菌株成膜能力的變異性更大；37℃條件下，致病與非致病性菌株成膜能力的變異性無明顯差別。由此可見，低溫對(duì)致病性菌株成膜能力影響性更大，25℃對(duì)非致病性菌株成膜能力影響更大，37℃對(duì)致病與非致病菌株成膜能力影響類似。由表3（b）可知，較致病性菌株，非致病性菌株在接觸材料表面成膜能力的變異性更大，其中PS表面對(duì)非致病性菌株成膜能力的變異性影響最大。因此，致病與非致病性菌株成膜能力的變異性受溫度和材料的影響，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)溫度的控制及接觸材料表面衛(wèi)生的監(jiān)管，避免因BF污染而導(dǎo)致中毒事件發(fā)生。

3.4 VP-S36在玻璃表面生物被膜CLSM的檢測(cè)

為進(jìn)一步驗(yàn)證上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，特選取典型菌株VP-S36（見圖1），對(duì)其在GS表面不同溫度條件下形成的三維立體BF結(jié)構(gòu)進(jìn)行CLSM觀察（如圖2）。在4℃下幾乎所有細(xì)胞呈單細(xì)胞分布，細(xì)胞無明顯聚集狀態(tài)，熒光強(qiáng)度最弱；在10℃下大部分細(xì)胞則呈單細(xì)胞分布，少數(shù)細(xì)胞聚集，熒光強(qiáng)度較弱；在15℃下部分細(xì)胞聚集成簇，熒光強(qiáng)度明顯弱于25℃和37℃；在25℃下形成了較厚的BF，幾乎覆蓋了GS材料表面，熒光強(qiáng)度最強(qiáng)；在37℃下形成了多細(xì)胞聚集的BF，該結(jié)構(gòu)覆蓋了大部分的材料表面，熒光強(qiáng)度較強(qiáng)。由CLSM觀察結(jié)果可知：VP-S36在25℃和37℃條件下有大量BF形成，在25℃下BF形成能力最強(qiáng)，在低溫條件下成膜能力明顯減弱。VP-S36在CLSM下觀察到的BF結(jié)構(gòu)與結(jié)晶紫染色法半定量的結(jié)果一致。因此，溫度對(duì)VP菌株BF的形成產(chǎn)生一定的影響，低溫條件下BF的形成能力較弱，37℃條件下，菌株成膜能力較強(qiáng)，25℃條件下，菌株成膜能力

圖2 不同溫度下菌株VP-S36生物被膜CLSM圖片F(xiàn)ig.2 CLSM images of VP-S36 strain biofilm formed at different temperatures.

4 結(jié)語

首次闡釋了VP在5個(gè)溫度、3種接觸材料表面BF的形成情況，結(jié)果顯示，低溫環(huán)境中VP生成BF能力較弱，37℃條件下BF能力相對(duì)較強(qiáng)，25℃條件下更適于VP菌株BF的形成；GS表面BF形成能力較強(qiáng)，其次是PS表面，最后是SS表面；影響B(tài)F形成的外界因素中，溫度影響最大，其次為接觸材料。另外，致病性菌株成膜能力強(qiáng)于非致病菌株。因此，建議今后在食品加工過程中，可通過控溫或改變接觸材料的方式以降低致病性VP菌株BF形成而引發(fā)的食品風(fēng)險(xiǎn)。此研究不僅可為后續(xù)VP菌株BF形成特性的深入研究奠定基礎(chǔ)，而且可為食品加工企業(yè)進(jìn)一步控制和清除食品接觸材料表面產(chǎn)生的BF提供理論依據(jù)。

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