陳秀金， 任國(guó)艷， 許凱旋， 崔 璨，張永麗， 侯玉澤， 胥傳來(lái)， 李 根

（1.河南科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471023；2.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫214122）

麻保沙星 （Marbofloxacin，CAS 號(hào)：115550-35-1），其化學(xué)名為 9-氟-2，3-二氫-3-甲基-10-（4-甲基-1-哌嗪）-7-氧-7H-吡啶-[3，2，1-ij][4，1，2]-苯并噁二嗪-6-羧酸，為動(dòng)物專(zhuān)用的一種新型氟喹諾酮類(lèi)抗菌藥，因抑制細(xì)菌DNA復(fù)制中所需要的拓樸異構(gòu)酶而表現(xiàn)出殺菌活性，具有抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)、生物利用度高、毒性低、對(duì)其他抗菌物無(wú)交叉耐藥性等優(yōu)點(diǎn)[1-4]。然而，由于經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使 ，一些養(yǎng)殖戶不合理地使用和濫用麻保沙星，如在休藥期出售和屠宰畜禽[5]，從而導(dǎo)致了動(dòng)物性源食品中的麻保沙星殘留超標(biāo)。長(zhǎng)期食用超標(biāo)的動(dòng)物源性食品，易使人體內(nèi)的敏感菌產(chǎn)生耐藥性，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致人體長(zhǎng)期腹瀉或營(yíng)養(yǎng)不良，還可能會(huì)引起皮疹、過(guò)敏性休克等不良反應(yīng)[6]。因此，建立牛奶中殘留麻保沙星的有效的檢測(cè)方法是目前的當(dāng)務(wù)之急。

用于檢測(cè)麻保沙星殘留的方法有高效液相色譜法[7]、高效毛細(xì)管電泳法[8]和免疫分析法[9-11]，其中高效液相色譜法和毛細(xì)管電泳法檢測(cè)限低，但設(shè)備昂貴，不易推廣。免疫法雖然簡(jiǎn)便快速，但抗體制備周期長(zhǎng)。微生物法檢測(cè)樣品成本低，簡(jiǎn)便可靠，不需要特殊設(shè)備，適用于麻保沙星殘留大量樣品的初步篩選。為了更好對(duì)麻保沙星殘留進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)控，作者選擇金黃色葡萄球菌為工作菌，建立麻保沙星在牛奶中殘留的微生物學(xué)檢測(cè)方法，為牛奶中麻保沙星殘留的檢測(cè)提供了一種簡(jiǎn)便、可行的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus subsp.aureus，ATCC 27217），購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 試驗(yàn)材料 純牛奶：市售。

1.1.3 主要試劑 麻保沙星標(biāo)準(zhǔn)品：購(gòu)自上海楚定分析儀器有限公司；酵母粉、蛋白胨、瓊脂粉、牛肉膏：購(gòu)自深圳市科天化玻儀器有限公司。

1.1.4 麻保沙星標(biāo)品貯備液的配制 準(zhǔn)確稱(chēng)取麻保沙星標(biāo)準(zhǔn)品50.0 mg，采用無(wú)菌的磷酸鹽緩沖溶液（0.05 moL/L，pH 7.2）溶解后，用 50 mL 容量瓶定容，得到質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL麻保沙星標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，4℃下保存2周。

1.1.5 培養(yǎng)基 培養(yǎng)基I、培養(yǎng)基II和培養(yǎng)基III按照參考文獻(xiàn)[12]進(jìn)行配制。

1.2 儀器設(shè)備 超凈工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品；生化培養(yǎng)箱：上海博迅有限公司醫(yī)療設(shè)備產(chǎn)品；水平型電子數(shù)顯搖床：上海雙旭電子有限公司產(chǎn)品。

1.3 菌懸液的制備

將實(shí)驗(yàn)室保存的金黃色葡萄球菌斜面轉(zhuǎn)接到新制備的營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上，在37℃下恒溫培養(yǎng)20 h，完成活化過(guò)程。然后將活化過(guò)的斜面菌種用接種針接種到液體培養(yǎng)基中，振蕩混勻，同時(shí)以未接種的液體培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，在37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，采用可見(jiàn)分光光度儀測(cè)定不同培養(yǎng)時(shí)間下菌懸液在560 nm波長(zhǎng)下的透光率，選擇透光率為20%時(shí)的菌懸液進(jìn)行涂布[13]。

1.4 菌液平板的制備

試驗(yàn)采用混菌雙層平板法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。首先向直徑為90 mm的平皿中加入融化的固體培養(yǎng)基II 7.0～8.0 mL，左右晃動(dòng)后，放置在超凈臺(tái)上凝固；帶培養(yǎng)基完全凝固后，另取固體培養(yǎng)基II適量加熱溶化，冷卻至50℃，一般每100 mL培養(yǎng)基中加入1 mL透光率為20%的菌懸液，搖勻，在每一平皿中分別加入7.0～8.0 mL左右，左右晃動(dòng)使其鋪滿平皿作為菌層。待平皿中的培養(yǎng)基完全凝固后，采用無(wú)菌操作用鑷子將滅菌的試紙片放到菌層上，對(duì)每個(gè)平皿進(jìn)行標(biāo)記，每個(gè)試驗(yàn)做3次平行。

1.5 麻保沙星標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

1.5.1 基于磷酸鹽緩沖溶液的麻保沙星標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 采用0.05 moL/L，pH 7.2無(wú)菌磷酸鹽緩沖溶液將麻保沙星的標(biāo)準(zhǔn)貯備液稀釋為0.1，0.2，0.4，0.8，1.6 μg/mL，然后量取不同濃度的麻保沙星標(biāo)準(zhǔn)液滴加到平板的濾紙片上，每個(gè)濃度做3個(gè)平行試驗(yàn)，每個(gè)濾紙片上麻保沙星的添加體積為100 μL。標(biāo)記每個(gè)平板后，將其小心平移至4℃冰箱中，放置4 h，而后轉(zhuǎn)入37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h。再用游標(biāo)卡尺測(cè)定每個(gè)抑菌圈的直徑，計(jì)算平均值，以抑菌圈直徑的平均值為橫坐標(biāo)，麻保沙星濃度的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，采用origin 8.5軟件進(jìn)行線性回歸擬合，得到測(cè)定麻保沙星的標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程。

1.5.2 空白牛奶的測(cè)定 采用混菌雙層平板法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，其中濾紙片上僅添加牛奶樣品，經(jīng)培養(yǎng)后，依據(jù)平板上是否產(chǎn)生抑菌圈，判斷牛奶中是否含有抑制金黃色色葡萄球菌的抗生素（包括麻保沙星）。若平板上無(wú)抑菌圈產(chǎn)生，則可以選作空白奶樣。

1.5.3 牛奶基質(zhì)的麻保沙星標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 采用空白牛奶將麻保沙星的標(biāo)準(zhǔn)貯備液稀釋為0.1，0.2，0.4，0.8，1.6 μg/mL，其他試驗(yàn)步驟參照 1.5.1 方法進(jìn)行，繪制牛奶基質(zhì)的麻保沙星標(biāo)準(zhǔn)曲線。1.6 添加回收試驗(yàn)

從100 μg/mL的麻保沙星標(biāo)品儲(chǔ)備液中準(zhǔn)確移取30，60，120 μL加到一定體積奶樣中，總體積為10 mL，得到添加麻保沙星終濃度的水平分別為0.3，0.6，1.2 μg/mL， 每個(gè)濃度分別設(shè)置 3 個(gè)平行試驗(yàn)，回收率按照1.5.3方法建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌懸液濃度的確定

按照1.3的方法，測(cè)定不同培養(yǎng)時(shí)間菌懸液在560 nm處透光率。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌懸液濃度不斷增加，透光率將不斷變小。通常選擇菌懸液在560 nm波長(zhǎng)下透光率為20%的培養(yǎng)時(shí)間。同時(shí)對(duì)透光率為20%的菌懸液涂平板，37℃下恒溫培養(yǎng)20 h，觀察菌落的生長(zhǎng)狀態(tài)。通過(guò)抑菌試驗(yàn)得出，培養(yǎng)時(shí)間為10.5 h時(shí)，菌懸液濃度可以產(chǎn)生清晰的抑菌圈。

2.2 麻保沙星對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌結(jié)果

按照1.5.1方法測(cè)定金黃色葡萄球菌對(duì)麻保沙星（質(zhì)量濃度：0.4 μg/mL）的敏感性，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 麻保沙星抑菌結(jié)果Fig.1 Inhibition result of marbofloxacin

由圖1可見(jiàn)，在長(zhǎng)滿金黃色葡萄球菌的平板上，僅濾紙片的周?chē)纬闪嗣黠@的抑菌圈，說(shuō)明麻保沙星對(duì)金黃色葡萄球菌具有抑菌作用。因此，選擇金黃色葡萄球菌作為敏感菌。

2.3 麻保沙星標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

2.3.1 空白牛奶的測(cè)定結(jié)果 按照1.5.2的方法對(duì)牛奶樣品抑菌效果進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 空白牛奶的測(cè)定結(jié)果Fig.2 Detection result of control milk samples

由圖2可見(jiàn)，在濾紙片周?chē)鷽](méi)有產(chǎn)生抑菌圈，說(shuō)明牛奶中不含有對(duì)金黃色葡萄球菌有抑制作用的藥物 （包括麻保沙星），故可以選其作為空白樣品。

2.3.2 麻保沙星標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 對(duì)不同麻保沙星質(zhì)量濃度按照1.5的方法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，以麻保沙星質(zhì)量濃度c對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以抑菌圈直徑為縱坐標(biāo)，繪制基于磷酸鹽緩沖溶液和牛奶基質(zhì)的麻保沙星標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 測(cè)定麻保沙星的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of marbofloxacin determination

在磷酸鹽緩沖溶液的麻保沙星標(biāo)準(zhǔn)曲線基礎(chǔ)上，建立了基于牛奶基質(zhì)的麻保沙星標(biāo)準(zhǔn)曲線。以磷酸鹽緩沖溶液和伊利純牛奶為基質(zhì)的麻保沙星標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程分別為Y=0.053X-1.052和Y=0.061X-1.05；相關(guān)系數(shù)都在0.99以上；在抑菌圈直徑和麻保沙星質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)之間存在著良好的線性關(guān)系，在此范圍內(nèi)測(cè)定麻保沙星的結(jié)果較接近真實(shí)值。

2.4 添加回收試驗(yàn)

按照1.6方法測(cè)定添加陽(yáng)性奶樣中麻保沙星含量，基于牛奶基質(zhì)麻保沙星標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計(jì)算回收率，其中抑菌圈的直徑是減去濾紙片直徑（d=13 mm）后的數(shù)據(jù)，結(jié)果見(jiàn)表1和圖4。

表1 添加回收試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Result of spiked test

圖4 麻保沙星的抑菌結(jié)果Fig.4 Inhibition result of marbofloxacin in milk sample

由表1和圖4可見(jiàn)，作者建立的方法對(duì)牛奶中麻保沙星的平均回收率在77.3%～93.3%之間，說(shuō)明該方法具有較好的可靠性。重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)在2.69%～4.05%之間，批間試驗(yàn)的變異系數(shù)5.27%～7.26%變化，說(shuō)明該方法批內(nèi)和批間的穩(wěn)定性較好。

3 結(jié) 語(yǔ)

1）作者首次選擇金黃色葡萄球菌為敏感菌種，建立了牛奶中麻保沙星殘留的微生物學(xué)檢測(cè)方法。

2）通過(guò)試驗(yàn)表明，采用分光光度法不僅有效地節(jié)省了試驗(yàn)時(shí)間，而且減少不同批次培養(yǎng)菌懸液造成的濃度波動(dòng)，有效地保證了該方法的穩(wěn)定性。

3）試驗(yàn)過(guò)程必須嚴(yán)格執(zhí)行無(wú)菌操作，盡可能地避免平板污染現(xiàn)象發(fā)生。另外，作者還研究了濾紙片上麻保沙星添加體積對(duì)結(jié)果的影響，每個(gè)濾紙片上的添加體積以100 μL為宜。在添加麻保沙星標(biāo)液后，一定要將平板緩慢地平移至冰箱。

4）目前，用于檢測(cè)麻保沙星的各種儀器分析方法存在前處理復(fù)雜和檢測(cè)成本高的缺點(diǎn)，不適合對(duì)日常大量樣品的初篩，難以實(shí)現(xiàn)在基層的普及應(yīng)用。而作者建立的方法操作簡(jiǎn)單、成本低和不需要前處理，完全能用于牛奶中殘留麻保沙星的初篩，并為制定其標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)技術(shù)提供依據(jù)。

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