安 超， 馬賽箭， 常 帆， 上官亦卿， 丁 浩， 薛文嬌

（陜西省微生物研究所，陜西 西安710043）

出芽短梗霉（Aureobacidium pullulans）是一類與酵母有密切關(guān)系的小型絲狀真菌，屬半知菌門短梗霉屬，能發(fā)酵產(chǎn)生胞外多聚糖、酶、抗菌素、單細(xì)胞蛋白等多種物質(zhì)[1-2]。普魯蘭多糖是一種水溶性黏性多糖可由出芽短梗霉發(fā)酵所產(chǎn)生，1938年，Bauer首次報道了這種特殊的微生物多糖，1959年，Bender分離純化并將這種多糖命名為普魯蘭多糖[3]。普魯蘭多糖為無味、無嗅、無毒、可食用的天然碳水化合物，呈非結(jié)晶不定型粉末，具有極好的成膜性、成纖維性、阻氧性、可塑性、粘結(jié)性和易自然降解等獨(dú)特的理化和生物學(xué)特性，對人體無任何副作用，并且，普魯蘭多糖的水溶液其黏度、特性幾乎不受pH、鹽類、酶的影響，因此被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥制造（膠囊和藥物載體）、食品包裝、水果和海產(chǎn)品保鮮、化妝品（保濕劑和水凝膠）、煙草制造、和農(nóng)業(yè)種子保護(hù)等領(lǐng)域，是一種多功能新型生物制品[4]。

近年來，隨著應(yīng)用領(lǐng)域的不斷細(xì)分及應(yīng)用產(chǎn)品附加值的大幅提高，對普魯蘭多糖的生產(chǎn)提出了更高的要求。作為高聚物，多糖性能與相對分子質(zhì)量及其分布特征密切相關(guān)[5]，不同的應(yīng)用必然要求不同的相對分子質(zhì)量及其分布才能達(dá)到最佳效果[6-11]。普魯蘭多糖的相對分子質(zhì)量分布范圍在5.0×104～5.0×106左右[12]，主要受出芽短梗霉菌種差異、碳源種類、培養(yǎng)時間及發(fā)酵pH等因素的影響。目前，商業(yè)化的普魯蘭多糖的數(shù)均相對分子質(zhì)量大概在1.0×105～2.0×105， 重均相對分子質(zhì)量大概在 3.62×105～1.8×105，相對分子質(zhì)量分散指數(shù)一般在2.1到4.1之間。相對分子質(zhì)量的分布范圍決定了普魯蘭多糖的應(yīng)用范圍，例如 3.0×104～9.0×104大小的普魯蘭多糖分子片段可代替右旋糖酐作為血漿擴(kuò)容劑[13-14]。

有機(jī)氮源中含有豐富的蛋白質(zhì)、肽類、游離的氨基酸、糖類、脂肪和生長因子等，在出芽短梗霉的發(fā)酵過程中對普魯蘭多糖的產(chǎn)量和相對分子質(zhì)量起著至關(guān)重要的作用。Wiley和Lin等人研究了碳源、氮源和磷酸鹽對普魯蘭多糖相對分子質(zhì)量分布的影響，其中氮源式影響相對分子質(zhì)量的最大因素，銨離子被證實比硝酸根離子更有利于生產(chǎn)高相對分子質(zhì)量的普魯蘭多糖[15-16]；Morin和Kumar等人報道碳氮質(zhì)量比為10∶1是普魯蘭多糖的最佳培養(yǎng)條件[17]；Cheng等人研究表明：75 g/L蔗糖，3 g/L酵母粉和5 g/L的硫酸組合下，普魯蘭多糖的產(chǎn)量最高，培養(yǎng)7天后，收獲25.8 g/L的普魯蘭多糖[18]。作者選用低色素出芽短梗霉CGMCC.No.11602為目標(biāo)菌株，研究了不同質(zhì)量濃度酵母粉對普魯蘭多糖產(chǎn)量、結(jié)構(gòu)及相對分子質(zhì)量的影響，為不同特性普魯蘭多糖的生產(chǎn)提供技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 菌種

出芽短梗霉 （Aureobasidium pullulans）CGMCC 11062，保藏于中國微生物菌種保藏中心。

1.2 培養(yǎng)基

活化培養(yǎng)基（g/L）：馬鈴薯去皮去芽眼、洗凈、切塊，稱200 g放入1 000 mL蒸餾水中用文火煮沸30 min，雙層紗布過濾，濾液加水補(bǔ)至1 000 mL，加20 g蔗糖，15 g瓊脂粉，121℃，20 min滅菌。

種子培養(yǎng)基 （g/L）： 葡萄糖 50.0；MgSO4·7H2O 0.2；K2HPO45.0； 酵母粉 1.7；（NH4）2SO40.6；NaCl 1.0；初始 pH 6.5，113～116 ℃，20 min 滅菌。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：蔗糖 50；MgSO4·7H2O 0.2；K2HPO45.0；（NH4）2SO40.6；NaCl 1.0，酵母粉質(zhì)量濃度 （0，0.6，0.9，1.2，1.5，1.8，2.1 g/L）。 初 始 pH 6.5，113～116 ℃，20 min 滅菌。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)品試劑

普魯蘭多糖標(biāo)準(zhǔn)品P4516-25G：Sigma公司產(chǎn)品。

1.4 儀器

恒溫培養(yǎng)箱SPX-250：北京科偉永興儀器有限公司產(chǎn)品；控溫?fù)u床ZWY-2102：上海智誠分析儀器制造有限公司產(chǎn)品；傅立葉變換紅外光譜儀Nicolet is 50：Thermo Scientific產(chǎn)品；高效液相色譜儀（Waters 1515）：Waters公司產(chǎn)品。

1.5 培養(yǎng)方法

活化培養(yǎng)方法：將菌種在28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d；種子培養(yǎng)方法：將活化好的菌株接種在裝有50 mL種子培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中，置于恒溫?fù)u床上（230 r/min），28℃條件下培養(yǎng) 48 h，即為種子液；發(fā)酵培養(yǎng)方法：按照體積分?jǐn)?shù)5%接種量將種子接種到裝有體積分?jǐn)?shù)20%培養(yǎng)液的三角瓶中，置于恒溫?fù)u床上（230 r/min），28℃條件下培養(yǎng)96 h。

1.6 分析方法

1.6.1 菌體生物量 將發(fā)酵液30 mL裝入50 mL離心管中，8 000 r/min，離心 10 min，取沉淀于 105℃干燥至恒重，生物量計算公式如下：

生物量（g/L）=（m實-m空）×1 000/30

1.6.2 普魯蘭多糖產(chǎn)量 取上清液15 mL加入30 mL體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇，4℃靜置12 h，8 000 r/min離心10 min，收集沉淀，加水重溶，再次加入30 mL體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇進(jìn)行沉淀，將沉淀于80℃烘至恒重，精確稱重，多糖質(zhì)量濃度計算公式如下：

多糖質(zhì)量濃度（g/L）=（m實-m空）×1 000/15

1.6.3 殘?zhí)琴|(zhì)量濃度 苯酚硫酸法[19]。

反應(yīng)30 min，等冷卻之后測定A490nm。待測樣品稀釋合適的倍數(shù)，使用與標(biāo)曲測定的相同體系測定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和稀釋倍數(shù)計算發(fā)酵液中的殘?zhí)琴|(zhì)量濃度。

1.6.4 結(jié)構(gòu)測定 應(yīng)用傅里葉變換衰減全反射紅外光譜法（ATR-FTIR）直接測定制備獲得的普魯蘭多糖粉末[20]。

1.6.5 相對分子質(zhì)量測定 利用高效液相色譜法（GPC）測定普魯蘭多糖相對分子質(zhì)量分布范圍。以0.1 mol/L NaNO3作為流動相，流量0.5 mL/mim，柱溫箱溫度35℃，樣品質(zhì)量濃度1 g/L，進(jìn)樣量20 μL，數(shù)據(jù)處理使用Waters自帶的Breeze軟件積分獲得[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母粉質(zhì)量濃度對出芽短梗霉發(fā)酵普魯蘭多糖的影響

不同酵母粉質(zhì)量濃度對普魯蘭多糖發(fā)酵的影響如圖1所示。由圖我們可以看出，酵母粉的質(zhì)量濃度對普魯蘭多糖產(chǎn)量及底物的碳源轉(zhuǎn)化率影響很大，而對菌體的產(chǎn)量影響不是很大。其中，在未加酵母粉時，菌體產(chǎn)量5.92 g/L，普魯蘭多糖產(chǎn)量34.74 g/L，殘?zhí)琴|(zhì)量濃度44.18 g/L。因此，有機(jī)氮源的缺失導(dǎo)致菌體含量和普魯蘭多糖產(chǎn)量偏低，造成大量底物剩余。隨著酵母粉質(zhì)量濃度的增加，菌體含量和普魯蘭多糖產(chǎn)量逐漸升高，同時，底物的利用效率也提升，特別是當(dāng)酵母粉質(zhì)量濃度為1.5 g/L時，普魯蘭多糖的產(chǎn)量出現(xiàn)最大峰值，達(dá)到了61.32 g/L，相對于單一的無機(jī)氮源，有機(jī)氮源類的酵母膏與無機(jī)氮源混合作為發(fā)酵氮源時，更有利于出芽短梗霉的生長及胞外多糖合成。而當(dāng)酵母粉質(zhì)量濃度超過1.5 g/L，多糖產(chǎn)量逐漸降低，這可能是由于過多的有機(jī)氮源供給促使碳源流向生物體自身。

2.2 有機(jī)氮源種類對普魯蘭多糖結(jié)構(gòu)的影響

研究多糖結(jié)構(gòu)的方法有許多種，如紫外光譜、紅外光譜、核磁共振波譜、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用以及多糖的分子修飾等。糖的紅外光譜技術(shù)源自于20世紀(jì)70年代后，由于紅外光譜技術(shù)的發(fā)展及糖化學(xué)的研究深入，紅外光譜成為糖結(jié)構(gòu)研究的重要手段之一，主要用于不同糖的鑒別、吡喃糖和呋喃糖的識別、糖苷鍵及糖構(gòu)型的確定、糖鍵上主要取代基的識別[22]。

紅外色譜分析結(jié)果見圖2，結(jié)果表明：6種不同有機(jī)氮源的培養(yǎng)液發(fā)酵合成的普魯蘭多糖樣品具有明顯的多糖特征吸收峰，與普魯蘭多糖標(biāo)準(zhǔn)品具有一致的紅外吸收。普魯蘭多糖在3 600～3 200 cm-1出現(xiàn)一寬峰，是糖類存在的分子間或分子內(nèi)的O-H伸縮振動產(chǎn)生的；3 000～2 800cm-1存在吸收較弱的O-H的吸收峰；此兩組吸收峰是糖類的特征峰[23]。1 400～1 200cm-1的吸收峰是由兩個C-O伸縮振動產(chǎn)生，其中一個屬于C-O-H，另一個是糖環(huán)C-O-C；1 000～700 cm-1包含著糖類特征吸收峰，主要表現(xiàn)為糖的吡喃環(huán)的振動譜。因此，酵母粉質(zhì)量濃度對普魯蘭多糖的結(jié)構(gòu)未產(chǎn)生顯著影響。

2.3 有機(jī)氮源對普魯蘭多糖相對分子質(zhì)量的影響

作者選用Sigma普魯蘭多糖相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品，使用Waters 1515-2414（示差檢測器）檢測平臺，獲得了普魯蘭多糖相對分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如表1所示，相對分子質(zhì)量越大，出峰時間越早。通過GPC測定不同有機(jī)氮源條件下的普魯蘭多糖相對分子質(zhì)量大小，如圖3所示，隨著酵母粉質(zhì)量濃度的增加，生成的普魯蘭多糖相對分子質(zhì)量越來越小。通過Waters GPC自帶的Breeze軟件，依據(jù)普魯蘭多糖相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)而對不同質(zhì)量濃度酵母粉制備的普魯蘭多糖的相對分子質(zhì)量積分計算，具體參數(shù)見表2所示，其中不加酵母粉時生產(chǎn)的普魯蘭多糖相對分子質(zhì)量最大，重均相對分子質(zhì)量Mw為529 528，隨著酵母粉質(zhì)量濃度的增加，生成的普魯蘭多糖相對分子質(zhì)量逐漸降低，重均相對分子質(zhì)量Mw從529 528降低到183 278。Campbell等人發(fā)現(xiàn)在碳源被消耗完后且發(fā)酵液中仍然有很高的氮源濃度下，會誘導(dǎo)普魯蘭多糖降解酶的產(chǎn)生，并導(dǎo)致普魯蘭多糖相對分子質(zhì)量及產(chǎn)量的降低[24]；Orr等人發(fā)現(xiàn)提供過多的氮源會導(dǎo)致更高的出芽短梗霉生物量，而不是普魯蘭多糖的產(chǎn)量[25]，研究也證明了這一點(diǎn)。所有條件下制備的普魯蘭多糖的分散系數(shù)在2.0～2.4之間，相對較窄，這可能與發(fā)酵周期短，未被水解酶水解有關(guān)。

2.4 有機(jī)氮源對普魯蘭多糖相對分子質(zhì)量的影響

選用Sigma普魯蘭多糖相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品，使用Waters 1515-2414（示差檢測器）檢測平臺，獲得了普魯蘭多糖相對分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如表1所示，相對分子質(zhì)量越大，出峰時間越早。通過GPC測定不同有機(jī)氮源條件下的普魯蘭多糖相對分子質(zhì)量大小，如圖3所示，隨著酵母粉濃度的增加，生成的普魯蘭多糖相對分子質(zhì)量越來越小。通過Waters GPC自帶的Breeze軟件，依據(jù)普魯蘭多糖相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)而對不同濃度酵母粉制備的普魯蘭多糖的相對分子質(zhì)量積分計算，具體參數(shù)見表2所示，其中不加酵母粉時生產(chǎn)的普魯蘭多糖相對分子質(zhì)量最大，重均相對分子質(zhì)量Mw為529 528，隨著酵母粉濃度的增加，生成的普魯蘭多糖相對分子質(zhì)量逐漸降低，重均相對分子質(zhì)量Mw從529 528降低到183 278。Campbell等人發(fā)現(xiàn)在碳源被消耗完后且發(fā)酵液中仍然有很高的

表1 不同相對分子質(zhì)量普魯蘭多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線測定Table 1 Standard curve of different molecular weight of pullulan

氮源在一定質(zhì)量濃度下，會誘導(dǎo)普魯蘭多糖降解酶的產(chǎn)生，并導(dǎo)致普魯蘭多糖相對分子質(zhì)量及產(chǎn)量的降低[15]；Orr等人發(fā)現(xiàn)提供過多的氮源會導(dǎo)致更高的出芽短梗霉生物量，而不是普魯蘭多糖的產(chǎn)量[16]，研究也證明了這一點(diǎn)。所有條件下制備的普魯蘭多糖的分散系數(shù)在2.0～2.4之間，相對較窄，這可能與發(fā)酵周期短，未被水解酶水解有關(guān)。

圖3 酵母粉質(zhì)量濃度對普魯蘭多糖相對分子質(zhì)量大小的影響Fig.3 Effects of yeast extract concentration on pullulan molecular weight size

3 結(jié)語

普魯蘭多糖的相對分子質(zhì)量決定了普魯蘭多糖的應(yīng)用范圍及醫(yī)用價值，高相對分子質(zhì)量的普魯蘭多糖更適用于商業(yè)用途。但是，針對不同的方向，對于普魯蘭多糖的要求不同，特別是對相對分子質(zhì)量及其分布的要求。例如，作為生物材料及組織工程而言，要求高相對分子質(zhì)量普魯蘭多糖且分布相對均一；作為血漿代用品則需要相對分子質(zhì)量低的普魯蘭多糖（大概6×104左右）且要求其相對分子質(zhì)量分布范圍相對窄，因為高相對分子質(zhì)量的普魯蘭多糖可能產(chǎn)生高的靜脈壓；作為一般的食品添加劑，中等相對分子質(zhì)量的普魯蘭多糖就能滿足需求。因此，不同相對分子質(zhì)量級別的普魯蘭多糖的制備能夠更好地滿足普魯蘭多糖應(yīng)用要求，增加產(chǎn)品的附加值，同時，也滿足不同相對分子質(zhì)量普魯蘭多糖的市場需求。

發(fā)酵過程調(diào)控是控制微生物多糖相對分子質(zhì)量分布重要途徑。氮源的水平和種類對菌體形態(tài)和代謝產(chǎn)物的合成起關(guān)鍵性作用，是一個重要且復(fù)雜的因素。作者選擇工業(yè)生產(chǎn)中常用有機(jī)氮源酵母粉，研究了不同濃度酵母粉對出芽短梗霉CGMCC 11602發(fā)酵生產(chǎn)普魯蘭多糖的產(chǎn)量、結(jié)構(gòu)、相對分子質(zhì)量的影響。結(jié)果表明酵母粉質(zhì)量濃度對出芽短梗霉的產(chǎn)量和相對分子質(zhì)量影響顯著，而對普魯蘭多糖結(jié)構(gòu)不大。當(dāng)酵母粉質(zhì)量濃度為1.5 g/L時，普魯蘭多糖的產(chǎn)量出現(xiàn)最大峰值，達(dá)到了61.32 g/L，同時，過多的酵母粉供給造成了碳源流向生物體，普魯蘭多糖產(chǎn)量減少。不加酵母粉時生產(chǎn)的普魯蘭多糖相對分子質(zhì)量最大，重均相對分子質(zhì)量Mw為529 528，隨著酵母粉質(zhì)量濃度的增加，生成的普魯蘭多糖相對分子質(zhì)量逐漸降低，重均相對分子質(zhì)量Mw從529 528降低到183 278。表明有機(jī)氮源可能會誘導(dǎo)普魯蘭多糖降解酶的產(chǎn)生，并導(dǎo)致普魯蘭多糖相對分子質(zhì)量及產(chǎn)量的降低。

表3 有機(jī)氮源種類對普魯蘭多糖相對分子質(zhì)量分布的影響Table 3 Effects of yeast extract concentration on pullulan molecular weight distribution

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