萬(wàn)紅霞， 孫海燕， 趙 旭， 劉 冬*， 王慧清

（1.深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東 深圳 518055；2.深圳市騰泰米業(yè)有限公司，廣東 深圳 518040）

自由基是人體新陳代謝過(guò)程中產(chǎn)生的中間代謝產(chǎn)物，在正常生理情況下，人體內(nèi)自由基的產(chǎn)生系統(tǒng)和清除系統(tǒng)處于動(dòng)態(tài)平衡中，保護(hù)機(jī)體細(xì)胞和組織受自由基的傷害性攻擊。實(shí)驗(yàn)研究表明，谷物中含有大量抗氧化活性物質(zhì)，攝入足量的谷物食品可有效降低糖尿病、心血管病等慢性退行性疾病和腫瘤的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[1-3]。

目前研究表明稻米中的天然酚類(lèi)物質(zhì)主要包括酚酸類(lèi)和黃酮類(lèi)化合物，且多以酯鍵、糖苷鍵、醚苷鍵等與其他物質(zhì)（包括蛋白質(zhì)、單糖、有機(jī)酸等）以結(jié)合形式存在，不能被上消化道酶分解，但可以在體外被酸或堿水解或在體內(nèi)結(jié)腸中被微生物分泌的酶（如糖苷酶）酶解才能釋放而發(fā)揮抗氧化作用[4-6]。目前，對(duì)谷物抗氧化活性的評(píng)價(jià)采用體外化學(xué)法[4，7]。Baublis等研究發(fā)現(xiàn)谷物在胃酸和胃腸消化酶作用下總抗氧化活性有顯著提高，認(rèn)為在評(píng)價(jià)谷物食品抗氧化活性時(shí)應(yīng)考慮胃腸道環(huán)境[8-10]。為此，作者在前期建立的體外模擬胃腸道消化法評(píng)價(jià)食物抗氧化活性方法的基礎(chǔ)上，以廣西稻米（桂小粘品種）為原料，通過(guò)體外模擬消化實(shí)驗(yàn)研究稻米（糙米、米糠和精米）在模擬消化過(guò)程中多酚、黃酮及其抗氧化活性的變化規(guī)律，以期對(duì)谷物類(lèi)食品的抗氧化活性進(jìn)行更全面科學(xué)的評(píng)價(jià)，也為消費(fèi)者提供更合理的膳食指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

廣西桂小粘（早稻，秈米）的糙米、米糠和精米：購(gòu)于深圳南海糧食工業(yè)有限公司；豬胃蛋白酶、豬胰酶、豬膽汁提取物、沒(méi)食子酸、（+）-兒茶素、Trolox、Folin-ciocalteu 試劑、2，2'-azobis （2-methylpropionamidine） dihydrochloride（AAPH）、熒光素鈉鹽：購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；高帶中藥粉碎機(jī)：中國(guó)大海藥材器械廠產(chǎn)品；T25 digital ULTRA－TURRAX高速勻漿機(jī)：德國(guó)IKA設(shè)備公司產(chǎn)品；5180 R型冷凍離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品；SY-2230恒溫水浴搖床：美國(guó)Crystal Technology&Industries公司產(chǎn)品；Spectra Max M5e多功能酶標(biāo)儀：美國(guó)Molecular Devices公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 樣品及試劑的準(zhǔn)備 將糙米、米糠和精米分別研磨成粉，貯存于-80℃?zhèn)溆?。模擬胃液：0.2 g胃蛋白酶溶于 5 mL 0.01 mol/L HCl；模擬腸液：0.04 g胰酶和0.25 g膽汁溶于10 mL 0.1 mol/L NaHCO3-Na2CO3緩沖溶液，均使用前配制。總酚、總黃酮和氧自由基吸收能力（ORAC）測(cè)定所用樣品為-80℃貯存的稻米游離酚、結(jié)合酚提取樣品和胃、腸模擬消化的樣品經(jīng)37℃水浴融解、4℃離心（12 000 r/min，15 min）處理。

1.2.2 稻米游離多酚和結(jié)合多酚的提取 參照Okarter等[4]的方法對(duì)糙米、米糠和精米游離多酚和結(jié)合多酚分別進(jìn)行提取，并略作改進(jìn)。

1）游離多酚提取 準(zhǔn)確稱(chēng)取1 g（絕干質(zhì)量）樣品，加10 mL正己烷除脂，重復(fù)操作3次；加入50 mL預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)80%丙酮，冰浴高速勻漿（14000r/min，5 min），4 ℃離心（12 000 r/min，10 min），收集上清液，重復(fù)此操作5次。合并上清液，45℃旋轉(zhuǎn)蒸干，去離子水定容至10mL，得游離多酚，-80℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

2）結(jié)合多酚提取 在提取游離多酚后的殘?jiān)屑尤?0 mL 2 mol/L NaOH溶液，充氮?dú)? min，避光室溫振蕩消化1 h；用濃鹽酸調(diào)pH至2.0，加入20 mL正己烷混勻，棄上層正己烷油脂層，重復(fù)此操作2次；加20 mL乙酸乙酯混勻，4℃離心（12 000 r/min，10 min），收集上清液，重復(fù)此操作5次。合并上清液，45℃旋轉(zhuǎn)蒸干，去離子水定容至10 mL，得結(jié)合多酚，-80℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 體外模擬胃腸消化 體外模擬消化實(shí)驗(yàn)參照趙旭[11]實(shí)驗(yàn)方法對(duì)稻米（糙米、米糠和精米）進(jìn)行消化。體外模擬消化包含體外模擬胃消化和體外模擬腸消化兩部分。體外模擬腸消化是在胃消化的基礎(chǔ)上，根據(jù)胃消化的最佳消化時(shí)間點(diǎn)，即在該時(shí)間點(diǎn)多酚釋放量達(dá)到最大且再無(wú)顯著性變化后再進(jìn)行腸消化。

1）模擬胃消化 模擬胃液組：取20 g（絕干質(zhì)量）樣品，加入200 g生理鹽水，沸水浴糊化并持續(xù)攪拌15 min后冷卻，用去離子水恒重至220 g，用1 mol/L HCl調(diào)pH至2.0，加入 2.5 mL模擬胃液；胃空白對(duì)照組：用等體積生理鹽水（pH7.0）代替模擬胃液；胃酸對(duì)照組：用等體積的0.01 mol/L HCl代替胃蛋白酶消化液。用錫紙將燒杯頂部和四周包好避光，充分充入氮?dú)夂笤?7℃恒溫水浴搖床消化4 h（持續(xù)充入氮?dú)猓?分別在消化 0、0.5、1、2和 3 h時(shí)取定量懸濁液，4 ℃離心 （12 000 r/min，15 min），取上清液，分裝，-80℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

2）模擬腸消化 模擬腸液組：向達(dá)到最佳胃消化時(shí)間 （2 h）的消化液中加入1 mol/L NaHCO3調(diào)pH至7.0，加入 5 mL模擬腸液，胰酶-膽汁消化液，繼續(xù)置于37℃恒溫水浴搖床中，持續(xù)充入氮?dú)庀? h。腸空白對(duì)照組：用等體積的0.1 mol/L NaHCO3-Na2CO3緩沖溶液代替模擬腸液。分別在腸消化 0、0.5、1、2、3和 4 h時(shí)取定量懸濁液，4 ℃離心（12 000 r/min，15 min），取上清液，分裝，-80 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 多酚的測(cè)定 多酚的測(cè)定按Folin-ciocalteu法[12]進(jìn)行。

1.2.5 黃酮的測(cè)定 黃酮含量測(cè)定采用氯化鋁-亞硝酸鈉比色法[13]。

1.2.6 氧自由基吸收能力（ORAC）的測(cè)定 ORAC的測(cè)定參照文獻(xiàn)[14-15]方法進(jìn)行。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 實(shí)驗(yàn)結(jié)果用Mean±SD表示，重復(fù)3次。用SYSTAT.Sigmaplot V10.0軟件進(jìn)行作圖，用SPSS V18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，平均值的差異顯著性用one-way ANOVA的LSD檢驗(yàn)，P＜0.05視為有顯著性差異，P＜0.01視為有極顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 稻米多酚、黃酮含量及抗氧化活性

目前對(duì)谷物食品抗氧化能力評(píng)價(jià)主要采用傳統(tǒng)方法有機(jī)溶劑提取結(jié)合堿消化法分別提取游離多酚和結(jié)合多酚，再通過(guò)測(cè)定谷物的多酚含量和抗氧化活性來(lái)評(píng)價(jià)谷物的抗氧化能力[7]。因米糠中含大量的抗氧化多酚物質(zhì)，大米的加工精度越精越易導(dǎo)致抗氧化物質(zhì)的大量丟失。

2.2 體外模擬消化過(guò)程中稻米多酚的變化規(guī)律

體外模擬胃消化過(guò)程中糙米、米糠和精米多酚釋放量的變化情況如圖1（a、b和c）所示。與模擬胃消化0 h相比，糙米、米糠和精米的多酚釋放量在0.5 h內(nèi)顯著升高（P＜0.05），糙米和米糠的多酚釋放量在分別在 2 h和 1 h后趨于穩(wěn)定（P＞0.05），精米的多酚釋放量在3 h時(shí)仍有顯著性升高 （P＜0.05）。三者的胃空白對(duì)照組和糙米及米糠胃酸對(duì)照組的多酚釋放量在模擬消化前后無(wú)顯著變化 （P＞0.05），而精米胃酸對(duì)照組的多酚釋放量在0.5 h內(nèi)顯著升高（P＜0.05），0.5 h 后趨于穩(wěn)定（P＞0.05），表明胃蛋白酶對(duì)促進(jìn)稻米抗氧化物質(zhì)的釋放占主導(dǎo)作用，胃酸（鹽酸）對(duì)糙米和米糠抗氧化物質(zhì)的釋放無(wú)顯著影響，而胃酸對(duì)精米抗氧化物質(zhì)的釋放有顯著影響。模擬胃消化3 h過(guò)程中糙米、米糠和精米多酚的最大釋放量 （10.29±0.45、24.54±1.98、9.615±0.440 μmol/g）分別為胃消化 0 h （2.940±0.145、14.00±0.54、1.458±0.117 μmol/g）的 3.499、1.753、6.595 倍。

體外模擬腸消化4 h過(guò)程中稻米多酚釋放量的變化情況如圖1（d、e和f）所示。與模擬腸消化0 h（也即模擬胃消化2 h）相比，糙米、米糠和精米的多酚釋放量在0.5 h內(nèi)顯著升高 （P＜0.05），0.5 h后趨于穩(wěn)定（P＞0.05），三者的腸空白對(duì)照組多酚釋放量在模擬腸消化前后均無(wú)顯著變化（P＞0.05）。體外模擬胃腸消化過(guò)程中糙米、米糠和精米多酚的最大釋放量（15.01±0.13、25.03±0.20、14.49±0.25 μmol/g）分別為腸消化0 h的1.521、1.081、1.697倍和胃消化0 h 的 4.704、1.828、9.113 倍。由圖1（A2、B2和 C2）可看出模擬腸消化過(guò)程中抗氧化物質(zhì)釋放增加的主要貢獻(xiàn)來(lái)自胰酶對(duì)稻米胚乳（精米）的水解。

谷物中具有抗氧化活性的物質(zhì)除多酚（包括黃酮）等植物化學(xué)物質(zhì)外，活性多糖和蛋白質(zhì)酶解后的多肽都可能有抗氧化活性，作者采用Folinciocalteu法測(cè)定模擬消化后上清液的多酚含量，由于Folin-ciocalteu法對(duì)多酚類(lèi)物質(zhì)的測(cè)定并不具有特異性 （測(cè)定的是所有具有還原性的化合物），因此，模擬消化過(guò)程中多酚的釋放量變化規(guī)律本質(zhì)上是所有抗氧化物質(zhì)釋放量的變化規(guī)律。Nagah等人[9]研究也表明，糙米、全麥和玉米在體外模擬胃腸消化過(guò)程中抗氧化活性物質(zhì)有顯著釋放，但迄今未見(jiàn)有關(guān)釋放機(jī)制或原因的研究報(bào)道。作者認(rèn)為，抗氧化物質(zhì)在模擬胃腸消化過(guò)程中大量釋放的主要原因包括：（1）胃腸蛋白酶水解谷物蛋白質(zhì)，產(chǎn)生了大量具有抗氧化活性的多肽；（2）胃腸蛋白酶水解了與多酚氫鍵或疏水結(jié)合的蛋白質(zhì)，釋放出了結(jié)合多酚；（3）胰酶（胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰脂肪酶等）水解了多酚與細(xì)胞壁纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等結(jié)合的酯鍵，釋放出結(jié)合多酚。

圖1 體外模擬胃和腸消化對(duì)稻米（米糠、糙米和精米）多酚釋放量的影響Fig.1 Effect of in vitro simulated gastric and intestinal digestion on phenolics released from digested rice （rice bran，brown rice and polished rice）

2.3 體外模擬胃腸消化過(guò)程中稻米黃酮的變化規(guī)律與Folin-ciocalteu法測(cè)定多酚的不特異不同，

氯化鋁-亞硝酸鈉比色法則能較準(zhǔn)確的反映谷物中黃酮類(lèi)物質(zhì)的含量。體外模擬胃消化過(guò)程中稻米黃酮釋放量的變化情況如圖2（a、b和c）所示。與模擬胃消化0 h相比，糙米、米糠和精米的黃酮釋放量在0.5 h 內(nèi)顯著升高（P＜0.05），分別在 1 h，1 h 和 0.5 h后趨于穩(wěn)定（P＞0.05），三者的胃空白對(duì)照組及精米胃酸對(duì)照組的黃酮釋放量在模擬胃消化前后無(wú)顯著變化（P＞0.05）。糙米和米糠胃酸對(duì)照組的黃酮釋放量在0.5 h內(nèi)顯著升高（P＜0.05），1 h后黃酮釋放量趨于穩(wěn)定（P＞0.05），這表明胃酸對(duì)米糠黃酮的釋放起主導(dǎo)作用，糙米黃酮的釋放則是胃蛋白酶和胃酸協(xié)同作用的結(jié)果。而精米的胃酸對(duì)照組黃酮釋放量在模擬胃消化前后變化不顯著，這表明胃蛋白酶對(duì)精米黃酮的釋放占主導(dǎo)作用，而胃酸對(duì)黃酮的釋放無(wú)影響。模擬胃消化3 h過(guò)程中糙米、米糠和精米黃酮的最大釋放量 （0.725 1±0.010 1、5.202±0.030 5、0.182 0±0.010 9 μmol/g）分別為胃消化 0 h（0.476 5±0.025 3、0.872 6±0.016 0、0.110 1±0.005 0 μmol/g）的 1.522、5.961、1.653 倍。

圖2 體外模擬胃腸消化對(duì)稻米（米糠、糙米和精米）黃酮釋放量的影響Fig.2 Effect of in vitro simulated gastric and intestinal digestion on flavonoids released from digested rice （rice bran，brown rice and polished rice）

體外模擬胃消化2 h和模擬腸消化4 h過(guò)程中稻米黃酮釋放量的變化情況如圖2（d、e和f）所示。與模擬腸消化0 h相比，糙米和精米的黃酮釋放量在0.5 h內(nèi)顯著升高 （P＜0.05），0.5 h后黃酮釋放量趨于穩(wěn)定（P＜0.05），米糠的黃酮釋放量在模擬腸消化前后差異不顯著（P＞0.05），三者的腸空白對(duì)照組黃酮釋放量在模擬腸消化前后均無(wú)顯著差異 （P＞0.05）。表明在模擬腸消化過(guò)程中，黃酮類(lèi)植物化學(xué)物釋放增加的主要貢獻(xiàn)來(lái)自胰酶對(duì)稻米胚乳 （精米）的水解。體外模擬胃腸消化過(guò)程中糙米、米糠和精米黃酮的最大釋放量（1.524±0.071、5.107±0.200、0.326 1±0.013 1 μmol/g） 分別為腸消化 0 h 的2.265、1.075、1.901 倍和胃消化 0 h 的 3.359、5.958、3.242倍。

Andreasen等[6]認(rèn)為，谷物結(jié)合多酚不能被胃和小腸消化吸收，但能被結(jié)腸中的微生物酶（酯酶、糖苷酶）降解釋放出游離多酚，因而結(jié)腸是谷物結(jié)合多酚消化、吸收的專(zhuān)一場(chǎng)所。但這一觀點(diǎn)并未得到有力證實(shí)。作者研究則表明，谷物結(jié)合多酚（如黃酮）在胃腸消化過(guò)程中，由于胃酸（鹽酸）水解和胃腸蛋白酶酶解等消化作用使多酚由結(jié)合態(tài)轉(zhuǎn)變成游離態(tài)，因而，谷物結(jié)合多酚可以在胃和小腸消化吸收。

2.4 體外模擬消化過(guò)程中稻米抗氧化活性的變化規(guī)律

體外模擬胃消化過(guò)程中稻米抗氧化活性的變化情況如圖3（a、b和c）所示。與模擬胃消化0 h相比，糙米、米糠和精米的ORAC值在0.5 h內(nèi)顯著升高 （P＜0.05），糙米和米糠分別在 2 h和0.5 h后ORAC值趨于穩(wěn)定（P＞0.05），精米的ORAC值在3 h時(shí)仍有顯著性升高（P＜0.05）。三者的胃空白對(duì)照組和胃酸對(duì)照組ORAC值在模擬胃消化前后均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。在模擬胃消化3 h過(guò)程中糙米、米糠和精米的最大 ORAC 值（27.10±1.37、56.10±1.67、24.46±0.70 μmol/g）分別為胃消化 0 h（7.835±0.650、11.57±0.92、1.892±0.191 μmol/g） 的 3.459、4.849、12.93倍。

圖3 體外模擬胃腸消化對(duì)稻米（米糠、糙米和精米）ORAC值的影響Fig.3 Effect of in vitro simulated gastric and intestinal digestion on ORAC values of digested rice （ rice bran，brown rice and polished rice）

體外模擬胃消化2 h和模擬腸消化4 h過(guò)程中稻米抗氧化活性（ORAC值）的變化情況如圖3（d、e和f）所示。與模擬腸消化0 h相比，糙米和精米的ORAC 值在 0.5 h 內(nèi)顯著升高 （P＜0.05），0.5 h 后ORAC 值趨于穩(wěn)定（P＜0.05），米糠的 ORAC 值在模擬腸消化前后差異不顯著（P＞0.05），三者的腸空白對(duì)照組ORAC值在模擬腸消化前后均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。體外模擬胃腸消化過(guò)程中糙米、米糠和精米的最大 ORAC 值（45.71±2.48、58.02±0.79、39.74±0.34 μmol/g） 分別為腸消化 0 h 的 1.782、1.046、1.690倍和胃消化0 h的5.659、5.112、19.65倍。

3 結(jié)語(yǔ)

1）稻米在模擬消化過(guò)程中抗氧化能力（ORAC值）的變化規(guī)律與多酚（抗氧化活性物質(zhì)）的釋放規(guī)律基本一致。

2）模擬消化前精米與糙米的多酚和總抗氧化活性差異均非常顯著（P＜0.01），精米分別是糙米的49.59%和24.15%；經(jīng)過(guò)模擬胃腸消化后，精米的多酚含量是糙米的96.54%，兩者的多酚釋放量無(wú)顯著差異 （P＞0.05），精米的總抗氧化活性是糙米的86.94%，精米的總抗氧化活性提高幅度比糙米更大。

3）按照模擬胃腸道消化法評(píng)價(jià)谷物食品的抗氧化活性與傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑提取結(jié)合堿消化法得出的結(jié)論可能大相徑庭。由于體外模擬胃腸道消化方法是模擬食物在人體內(nèi)胃腸道的消化過(guò)程，評(píng)價(jià)的結(jié)果應(yīng)該更準(zhǔn)確。

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