黃桂東， 徐珊珊， 劉 惠， 毛 健*， 傅祖康， 孫國昌， 周志磊

（1.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.會稽山紹興酒股份有限公司，浙江 紹興 312030）

黃酒是我國特有的釀造酒，但黃酒飲用者普遍認為，黃酒易導(dǎo)致“深醉”、“上頭”、醒酒慢[1-2]。 研究表明，高級醇是導(dǎo)致“宿醉”的關(guān)鍵因素[3]。高級醇是酒類主要風味物質(zhì)之一[4]。以單次飲用相同乙醇量的白酒與黃酒計，從黃酒中攝入的高級醇更多[5]。因此，在釀酒行業(yè)中，控制黃酒中高級醇含量更為迫切。

高級醇合成有兩條途徑：與氨基酸分解代謝相關(guān)的Ehrilich途徑和與糖代謝相關(guān)的生物合成途徑（Harris途徑）[6-7]。在釀酒酵母細胞中，高級醇合成受發(fā)酵體系中氮素營養(yǎng)狀況調(diào)控[8]。氮素營養(yǎng)充足時，高級醇通過Ehrilich途徑合成，生成的高級醇量約占總高級醇體積分數(shù)的25%；氮素營養(yǎng)缺乏時，高級醇生成通過Harris途徑合成，生成的高級醇量約占總高級醇體積分數(shù)的75%[9]。所以，通過氮素補償，控制Harris途徑，成為降低高級醇體積分數(shù)的主要方向[9]。復(fù)雜的黃酒發(fā)酵過程是一個碳源相對充足，氮源相對缺乏的體系。因此氮素補償可成為降低黃酒高級醇體積分數(shù)的可行措施。

并非所有的含氮物質(zhì)都能被酵母用于細胞代謝途徑。能被酵母利用的含氮物質(zhì)稱為酵母菌可同化氮（Yeast Assimilable Nitrogen，YAN），主要包括：α-氨基酸（脯氨酸除外）、小分子的多肽和銨態(tài)氮[10]。其中無機氮源來源易得、價格低廉，且可被酵母高效轉(zhuǎn)運及快速同化，成為工業(yè)化釀酒體系中潛在的氮源補償劑。目前，葡萄酒發(fā)酵過程中，通過補充適量的含氮物質(zhì)來解決一系列與氮源有關(guān)的發(fā)酵難題，其方法甚至在法國釀酒法典和德國葡萄酒法規(guī)中已被記載[11]。但無機氮源種類眾多，何種無機氮源能夠降低黃酒高級醇含量，仍未見報道。因此篩選合適的無機氮源成為降低黃酒高級醇含量的關(guān)鍵。作者以黃酒釀酒酵母為研究對象，探討了無機氮源種類對高級醇生成的影響，以期為高品質(zhì)黃酒的生產(chǎn)提供可靠數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑 黃酒釀酒酵母（紹興81號）為實驗室保藏菌種；生麥曲：會稽山紹興酒股份有限公司提供；特純糯米：購自無為縣永盛米業(yè)有限公司。 異戊醇、β-苯乙醇、異丁醇、2-辛醇（內(nèi)標）等，色譜純：購于Sigma公司；其它試劑如磷酸氫二銨、磷酸二氫銨、碳酸銨、氯化銨、硫酸銨、尿素、甲酸銨、乙酸銨、硫酸鋅等：分析純，購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 儀器設(shè)備 RJ-LDL-50G低速大容量多管離心機：無錫瑞江分析儀器有限公司產(chǎn)品；Thermo Fisher Trace氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國Thermo公司產(chǎn)品；50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭：美國Supelco公司產(chǎn)品；HH-S2系列恒溫水浴鍋:江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；FE20k pH計：梅特勒-托利多儀器有限公司產(chǎn)品；EL3002電子天平：梅特勒-托利多儀器 （上海）有限公司產(chǎn)品；YXQ-LS—50SII立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博迅實業(yè)有限公司產(chǎn)品；GRP-9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱：上海森信實驗儀器有限公司產(chǎn)品；SHP-250型生化培養(yǎng)箱：上海森信實驗儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基及菌種活化 麥芽汁培養(yǎng)基：配制14 g/dL的麥芽汁培養(yǎng)基，分裝在500 mL錐形瓶中，每個錐形瓶添加培養(yǎng)基300 mL。一級培養(yǎng)：取菌種，接種于盛有5 mL麥芽汁培養(yǎng)基的試管內(nèi)，28℃靜置培養(yǎng)1 d；二級培養(yǎng)：將試管中的酵母液轉(zhuǎn)接入盛有300 mL麥芽汁培養(yǎng)基的500 mL三角瓶內(nèi)，28℃靜置培養(yǎng)12 h?；罨蟮慕湍妇糜诤罄m(xù)培養(yǎng)，后續(xù)培養(yǎng)中酵母菌種添加量為培養(yǎng)基總體積的5%。

1.2.2 模擬雙邊發(fā)酵工藝釀造黃酒試驗方案 模擬黃酒雙邊發(fā)酵工藝，釀造黃酒。其試驗過程如下：稱取一定量的市售糯米于燒杯中，用水清洗干凈后

浸泡22 h；將浸泡的糯米于電磁爐上進行蒸飯，至糯米熟而不爛；將蒸飯后的糯米轉(zhuǎn)移至500 mL錐形瓶中，按米水比1 g∶3 mL加入去離子水；按照原料質(zhì)量的10%、5%和100 mg/L分別添加麥曲粉、活化后黃酒酵母和可同化氮源（（NH4）2HPO4）；用 8 層滅菌紗布將其封口，置于28℃培養(yǎng)箱中靜置發(fā)酵3 d，16 ℃后酵 10 d。根據(jù)是否添加（NH4）2HPO4將實驗分為實驗組（添加組）和對照組（未添加組）。

1.2.3 無機氮源種類的選擇 在不影響酵母生長的情況下，選取了可作為添加劑的幾種無機氮源（表1），檢測其對酵母生長的影響及降低高級醇的能力。以黃酒釀酒酵母為研究對象，在麥芽汁培養(yǎng)基中添加相同量（200 mg/L）的不同無機氮源，培養(yǎng)酵母，以A560nm和高級醇含量為檢測指標，確定降低高級醇含量的無機氮源種類。

表1 無機氮源種類及選擇依據(jù)Table 1 Thevarieties and selecting terms of nitrogen sources

1.2.4 高級醇的測定 采用頂空固相微萃取與氣質(zhì)聯(lián)用 （Headspace-solid phase microextraction gas chromatography mass spectrometry，HS-SPME/GCMS）分析技術(shù)，檢測高級醇體積分數(shù)。HS-SPME條件：取0.5 mL黃酒發(fā)酵液，加入到20 mL頂空瓶中，加5.44 mL體積分數(shù)15%的乙醇和60 μL內(nèi)標（2-辛醇），使用 50/30 μm DVB/CAR on PDMS 萃取頭，50℃萃取吸附40 min，250℃解吸7 min，用于GC-MS分析。GC 條件：色譜柱，TG-WAXMS（30 m×0.25 μm×0.25 mm）；載氣為高純氦氣（＞99.999%），不分流，流量為1.0 mL/min；進樣口溫度，250℃；程序升溫，起始溫度40℃，保持3 min，以6℃/min的速率升溫至100℃，然后以10℃/min升溫至230℃，保持7 min。MS條件：離子化方式，EI；發(fā)射電流，50 μA；電子能量，70 eV；離子源溫度，230 ℃；傳輸線溫度，250 ℃；掃描質(zhì)量范圍，33～400。

高級醇體積分數(shù)計算公式：

其中：C—高級醇體積分數(shù)；Cis—內(nèi)標物體積分數(shù)；

Ac—高級醇峰面積；Ais—內(nèi)標物峰面積。

高級醇標準曲線如表2所示。

表2 高級醇的標準曲線Table 2 Standard curves of higher alcohols

1.3 數(shù)據(jù)處理及分析方法

本研究中三角瓶氮源篩選實驗重復(fù)次數(shù)在6次以上（n≥6），黃酒模擬雙邊發(fā)酵工藝的重復(fù)次數(shù)為3次以上 （n≥3），所得結(jié)果利用Excel 2013、Sigmaplot 12.0和SPSS Statistics 20.0等統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理和分析，最終結(jié)果以均值±標準差形式表示，方差顯著性在P＜0.05水平上進行ANOVA檢驗。

2 結(jié)果與討論

2.1 黃酒高級醇檢測

采用HS-SPME/GC-MS的方法檢測了4個品牌（會稽山紹興酒股份有限公司、浙江古越龍山紹興酒股份有限公司、上海金楓酒業(yè)有限公司、浙江塔牌紹興酒有限公司）的11個黃酒樣品，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，異丁醇、異戊醇和β-苯乙醇是黃酒中的主要高級醇（圖1，代表性的黃酒樣品圖）。Chen等人的研究結(jié)果也認為異戊醇和β-苯乙醇是黃酒的主要高級醇[12]，與我們的結(jié)果相似。

2.2 不同無機氮源對酵母生長及高級醇生成的影響

2.2.1 不同無機氮源對酵母生長的影響 氮源是構(gòu)成細胞中所含蛋白質(zhì)、核酸和酶等成分，以及代謝產(chǎn)物中氮素來源的營養(yǎng)物質(zhì)[13-14]。由于黃酒是食品，所以無機氮源種類的選擇需保障無機氮源是食品級添加劑，可用于食品生產(chǎn)，且不影響實際黃酒發(fā)酵。由圖2和表3可以看出，添加一定量的無機氮源可促進酵母生長。其中（NH4）2HPO4促進酵母生長的效果較好。在蘋果酒和葡萄酒發(fā)酵中，也已經(jīng)證實無機氮源有促進酵母生長的作用[15]。法國釀酒法典和德國葡萄酒法規(guī)允許使用 （NH4）2HPO4作為酵母營養(yǎng)物，促進葡萄酒發(fā)酵。

圖1 代表性黃酒樣品（會稽山黃酒）中高級醇及其他黃酒揮發(fā)性成分的GC-MS圖譜（內(nèi)標：2-辛醇）Fig.1 Higher alcohols and othervolatile components in Chinese rice wine from Kuaijishanshaoxing wine co.，Ltd

圖2 不同氮源培養(yǎng)基中酵母的生長曲線Fig.2 Effect of nitrogen sources on the growth curves of yeast

2.2.2 不同無機氮源對高級醇生成的影響 根據(jù)高級醇合成途徑推測，氮源的添加，促進了酵母氮源代謝，同時減少了糖源向氨基酸的轉(zhuǎn)化，進而導(dǎo)致高級醇體積分數(shù)的降低。由圖3～5可知，不同無機氮源的添加對高級醇（異丁醇、異戊醇和β-苯乙醇）的生成有一定的影響，其中（NH4）2HPO4降低高級醇體積分數(shù)的效果較好。證實了氮源補償對高級醇體積分數(shù)生成的影響。Torrea等[16]人的研究也認為無機氮源補償對葡萄酒高級醇體積分數(shù)生成有影響。該結(jié)果為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。

2.2.3 實驗結(jié)果驗證-模擬雙邊發(fā)酵工藝釀造黃酒由上述實驗得到了 （NH4）2HPO4降低高級醇的效果較好。模擬黃酒雙邊發(fā)酵工藝，同時將（NH4）2HPO4作為氮源補充劑添加進入發(fā)酵體系，釀造黃酒。結(jié)果表明，在此工藝條件下釀造的黃酒，其高級醇體積分數(shù)有所降低，其中異丁醇降低了17.5%，異戊醇降低了20.1%，β-苯乙醇體積分數(shù)降低了15.2%（圖6）。

表3 不同氮源培養(yǎng)基中酵母的平均相對生長速率Table 3 Mean relative growth rate of yeast in the medium with different nitrogen sources

圖3 不同氮源對異戊醇體積分數(shù)的影響Fig.3 Effect of the addition of nitrogen sources on the content of isoamyl alcohol

圖4 不同氮源對異丁醇體積分數(shù)的影響Fig.4 Effect of the addition of nitrogen sources on the content of isobutyl alcohol

圖5 不同氮源對β-苯乙醇體積分數(shù)的影響Fig.5 Effect of the addition of nitrogen sources on the content ofβ-phenethyl alcohol

圖6 銨鹽補償對黃酒高級醇體積分數(shù)的影響Fig.6 Effects of ammonium compensation on the content of higher alcohols in Chinese rice wine

3 結(jié)語

降黃酒高級醇含量無機氮源篩選研究，結(jié)果表明，適量的無機氮源對酵母生長具有促進作用，同時能夠降低高級醇的體積分數(shù)，其中（NH4）2HPO4降低高級醇含量的效果較好。將其運用于黃酒發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)黃酒中異丁醇體積分數(shù)降低了17.5%，異戊醇體積分數(shù)降低了20.1%，β-苯乙醇體積分數(shù)降低了15.2%。所得結(jié)果對高舒適度黃酒的生產(chǎn)具有借鑒價值。

參考文獻：

[1]YANG Guojun.Report on the research of Chinese rice wine industry[J].China Brewing，2005，4：1-5.（in Chinese）

[2]MAO Qingzhong，SHI Caiqin.Study on the intoxication matter in yellow rice wine and its controlling technology[J].Jiangsu Condiment and Subsidiary Food，2010，27（3）：17-21.（in Chinese）

[3]HORI H，F(xiàn)UJII W，HATANAKA Y，et al.Effects of?fusel oil?on animal hangover models[J].Alcoholism：Clinical and Experimental Research，2003，27（8）：37-41.

[4]ZHANG Xingya，LIN Ling，JIANG Yujian.Research progress of controlling higher alcohols in rice wine[J].China Brewing，2011，10：13-16.（in Chinese）

[5]XIA Xiaole，ZHU Xiaoming，ZHANG Bin，et al.Quantitative analysis of fusel alcohol in Chinese rice wine and its explanation of formation mechanism[J].Food and Fermentation Industries，2011，12：125-129.（in Chinese）

[6]GETHINS Loughlin，GUNESEROnur，DEMIRKOIAsli，et al.Influence of carbon and nitrogen source on production of volatile fragrance and flavour metabolites by the yeast Kluyveromyces marxianus[J].Yeast，2015，32（1）：67-76.

[7]ATSUMI S，HANAI T，LIAO J C.Non-fermentative pathways for synthesis of branched-chain higher alcohols as biofuels[J].Nature，2008，451（7174）：86-89.

[8]ROLLEROStéphanie，BLOEM A，CAMARASA C，et al.Combined effects of nutrients and temperature on the production of fermentative aromas by Saccharomyces cerevisiae during wine fermentation[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2015，99（5）：2291-2304.

[9]ZHOU Shishui.Study on controlling content of higher alcohols in beer[J].Liquor Making，2005，3：51-53.（in Chinese）

[10]ZHANG Dan，SUO Ran，F(xiàn)AN Lixin，et al.Effects of assimilable nitrogen on the formation of higher alcohols in Jujube wine by solid fermentation[J].Liquor Making Science and Technology，2013，11：15-17.（in Chinese）

[11]MARTINEZz-MORENO R，QUIROS M，MORALES P，et al.New insights into the advantages of ammonium as a winemaking nutrient[J].International Journal of Food Microbiology，2014，177：128-135.

[12]CHEN S，XU Y，QIAN M C.Aroma characterization of chinese rice wine by gas chromatography-olfactometry，chemical quantitative analysis，and aroma reconstitution[J].Journal of Agriculture and Food Chemistry，2013，61（47）：11295-11302.

[13]ZHAO X R，ZOU H J，F(xiàn)U J W，et al.Metabolic engineering of the regulators in nitrogen catabolite repression to reduce the production of ethyl carbamate in a model rice wine system[J].Applied and Environmental Microbiology，2014，80 （1）：392-398.

[14]WANG Yue，ZHANG Rongxian，ZHANG Dandan，et al.Effects of carbon and nitrogen sources on keratinase production from Bacillus pumilus K9[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2014，33（10）：1077-1083.（in Chinese）

[15]CHEN D，CHIA J Y，LIU S Q.Impact of addition of aromatic amino acids on non-volatile and volatile compounds in lychee winefermented with Saccharomyces cerevisiae MERIT.ferm[J].International Journal of Food Microbiology，2014，170：12-20.

[16]TORREA D，VARELA C，UGLIANO M，et al.Comparison of inorganic and organic nitrogen supplementation of grape juice-Effect on volatile composition and aroma profile of a Chardonnay wine fermented with Saccharomyces cerevisiae yeast[J].Food Chemistry，2011，127（3）：1072-1083.