李 娟， 盧士玲*， 仝 旭， 熊 堃， 劉戰(zhàn)霞， 侯扶琴

（1．新疆石河子大學(xué) 食品學(xué)院，新疆 石河子 832000；2．新疆喀爾萬食品科技有限公司，新疆 石河子 832000）

肉制品是一種良好的培養(yǎng)基，可以為很多微生物提供生長必須的營養(yǎng)物質(zhì)[1]。一般情況下肉體的內(nèi)表面是無菌的，然而在屠宰過程中相關(guān)操作會引起胴體污染。微生物污染從屠宰開始，微生物首先接觸胴體，然后再深入肌肉等深層組織[2]。這種污染主要來源于動物的皮膚、毛發(fā)、蹄、糞便和內(nèi)臟，其他來源為屠宰相關(guān)設(shè)備、工具、工人以及環(huán)境等[3-5]。

動物屠宰過程中容易污染致病性細菌，包括沙門氏菌，大腸桿菌O157：H7和單增李斯特菌等[6]。2010年歐盟食源性疾病爆發(fā)這進一步引起了人們對食品安全問題的重視。肉類，特別是新鮮的肉類和新鮮的肉類產(chǎn)品，是引發(fā)食品安全問題重的要來源[7]。

聚合酶鏈式反應(yīng)-變性梯度凝膠電泳 （PCRDGGE）技術(shù)可從樣品中直接提取DNA，能檢測到難培養(yǎng)或不能培養(yǎng)的微生物且檢測速度快，目前該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于食品微生物種群群落研究。近年來將PCR-DGGE技術(shù)應(yīng)用于研究畜禽屠宰過程中的菌相變化亦有報道[8-9]。

作者利用PCR-DGGE技術(shù)對肉牛屠宰過程菌相分析，確定污染主要工序及主要來源，為有效控制原料牛肉微生物污染提供關(guān)鍵控制點依據(jù)，也為牛肉的減菌工作打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 取樣

取樣地點為新疆石河子市喀爾萬清真屠宰場。肉牛屠宰加工車間生產(chǎn)線現(xiàn)場取樣，分別在放血、去頭蹄、剝皮、去紅白腔、劈半、修整、排酸取胴體的頸部和前胸肉其中放血取頸部肉，每個步驟隨機抽取3頭牛為一個樣本。按照棉試紙檢測規(guī)程以及空氣、食品接觸面微生物檢測方法用3～5根蘸有無菌生理鹽水的無菌棉簽對肉牛毛皮、放血、去頭蹄、剝皮、去紅白腔、劈半、修整、分割等工序中的工人的手、手套、刀、鑷子、手鉤、傳送帶、案板等表面取樣隨后置于10 mL無菌生理鹽水管中，將含有樣品的試管放入有冰袋的取樣箱中；利用空氣沉降法用含有培養(yǎng)基的平板對屠宰間、排酸間、分割間的空氣進行3個階段采樣；將屠宰場的沖淋水取10 mL。所有樣品3 h內(nèi)送回實驗室處理。

1.2 試劑與儀器

PCA培養(yǎng)基、瓊脂糖Biowest、細菌基因組DNA提取試劑盒 TIANGEN、聚丙烯酰胺回收試劑盒：康為世紀生物科技有限公司產(chǎn)品；Neofuge臺式高速冷凍離心機：力康發(fā)展有限公司產(chǎn)品；D-37520高速冷凍離心機：德國LED熱電子公司產(chǎn)品；22331小型高速冷凍離心機：Eppendorf AG產(chǎn)品；PCR儀：美國Barloworld Scientific有限公司產(chǎn)品；Bio-RadDcode apparatus DGGE電泳儀 、GelDoc2000 system凝膠成像儀：美國Bio－Rad公司產(chǎn)品；DYY-8C水平電泳儀：北京市六一儀器廠產(chǎn)品；ZXRD-7-80搖床：上海智誠有限公司產(chǎn)品；所用引物均由上海生工合成。

1.3 方法

1.3.1 肉牛屠宰工藝流程 宰前檢驗→起吊→屠宰→放血→沖淋→預(yù)剝皮→去頭、蹄→剝皮→出紅腔、出白腔→尿液檢驗→胴體劈半→宰后檢驗→胴體修整→稱重→排酸→分割→終產(chǎn)品。

1.3.2 細菌總數(shù)的測定 肉樣：無菌條件下取25 g肉樣（兩個平行），無菌剪刀剪碎，加入225 mL滅菌生理鹽水，112 r/min搖床振搖30 min。取1 mL上清液進行10倍梯度稀釋，選擇合適的稀釋梯度，每個稀釋度2個重復(fù)，采用PCA培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)48 h[10]。 培養(yǎng)結(jié)束后計數(shù)，結(jié)果以 lg（CFU/g）表示。

棉簽采取的樣：渦旋混勻后直接吸取1 mL進行PCA菌落計數(shù)方法同上，結(jié)果以lg（CFU/cm2）表示。

沉降法采取的空氣樣品：將平板中的培養(yǎng)基加入225 mL的滅菌生理鹽水中進行PCA菌落計數(shù)方法同上，結(jié)果以lg CFU表示。

1.3.3 細菌總DNA提取 根據(jù)Vitor[11]等方法略有修改。肉樣（無菌操作取10 g樣品，無菌剪刀剪碎，放入90 mL滅菌生理鹽水中），空氣樣品（將平板中的培養(yǎng)基加入225 mL的滅菌生理鹽水中）112 r/min搖床振搖30 min，靜置5 min，取上清液4℃，2 000 g離心5 min，取上清液于4℃，10 000 g離心15 min，取沉淀于1.5 mL離心管中參照DNA提取試劑盒說明提取細菌總DNA。所提取的DNA溶于TE緩沖液中，于-20℃貯藏備用。

對棉簽采取的樣品直接吸取1 mL于1.5 mL離心管中后續(xù)方法同上。

1.3.4 PCR擴增 上游引物為帶GC夾子的U968，下游引物為L1401。對細菌的16S rRNA的V6-V8區(qū)段進行PCR擴增，條帶片段約為450 bp；上游引物 GC－ U968 為：5'－CGC CCG GGG CGC GCCCCG GGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGAA CGCGAA GAA CCTTAC－3'；下游引物 L1401為：5'－CGG TGT GTACAA GACCC－3'；PCR 反應(yīng)體系為25 μL：DNA 模板 1 μL，GC-U968 和 L1401 各 1 μL，PCR Mix 12.5 μL ，ddH2O 9.5 mL；PCR 反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性 2 min，35個循環(huán) （94 ℃，30 s，60℃，30 s，72℃，30 min） ， 最終 72 ℃ 延伸 5 min；PCR產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分數(shù)1.0%瓊脂糖電泳檢測后于-20℃貯藏備用。

1.3.5 變性梯度凝膠電泳（DGGE） 參照Wang[12]等方法稍作改動，對細菌16S rRNA基因V6-V8的擴增產(chǎn)物分別進行DGGE分析。采用Biorad Dcode apparatus電泳儀，聚丙烯酰胺膠質(zhì)量濃度為8 g/dL（丙烯酰胺與甲叉雙丙烯酰胺質(zhì)量比為37.5∶1），變性梯度為38%～58%（100%變性劑含有7 mol/L尿素和質(zhì)量分數(shù)40%甲酰胺），在0.5xTAE緩沖液中，60℃恒溫條件下，200 V電壓下電泳10 min，85 V電壓下電泳16 h。

電泳結(jié)束后，將DGGE膠片用含0.5 mg/L溴化乙啶（Ethidium bromide，EB）染色 20 min?；厥杖疽海髮GGE膠片用ddH2O漂洗3次，每次5min。1.3.6 DNA回收與純化 將EB染色的DGGE膠片放置于紫外燈下用無菌手術(shù)刀切下不同位置的條帶，分別放入1.5 mL的滅菌離心管中，用聚丙烯酰胺回收試劑盒回收膠條，備用。

取3 μL回收的DNA為模板進行16S rRNAV6-V8區(qū)域擴增，引物為U968（5'－AAC GCG AAG AAC CTTAC－3'） ，L1401 （ 5'－CGG TGT GTA CAA GAC CC－3'），PCR擴增程序同1.3.4。產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖檢驗后送往北京華大基因測序部測序。登錄NCBI，將所得序列與數(shù)據(jù)庫中的已知序列進行相似性比對[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落總數(shù)

2.1.1 肉牛屠宰各工序點工具、工人手或手套表面微生物污染狀況 由圖1和圖2可看出，放血、剝皮、劈半、修整工序中操作前刀的菌落總數(shù)在3.03～4.00 lg（CFU/cm2）之間，操作后刀的菌落數(shù)處于3.84～5.80 lg（CFU/cm2）之間；剝皮、去紅白腔工序中工人手或手套在操作前菌落數(shù)處于2.40～3.22 lg（CFU/cm2），操作后處于 4.17～5.46 lg（CFU/cm2）；放血工序點工人手表面和去頭蹄工序點刀、工人手表面菌落數(shù)較高達到8.00 lg（CFU/cm2）左右；修整工序工人手套、手鉤菌落數(shù)處于6.75～8.08 lg（CFU/cm2）左右；分割工序中傳送帶、案板、鑷子、工人手套、刀隨著分割進行菌落總數(shù)呈上升趨勢，菌落總數(shù)在 5.9～7.9 lg（CFU/cm2）范圍內(nèi)。

圖1 放血、去頭蹄、剝皮、去紅白腔工序中工具及工人手菌落計數(shù)Fig.1 Counts total bacteria of workers hand and tools in the process of bloodletting，go head and hoof，peeling，remove offal

圖2 修整、分割工序中工具、工人手套菌落計數(shù)Fig.2 Counts total bacteria of workers gloves and tools in the process of trim and segmentation

2.1.2 沖淋水、牛毛皮和屠宰車間空氣污染狀況由圖3可見，肉牛毛皮的菌落數(shù)為4.88 lg（CFU/cm2）；沖淋水中的菌落數(shù)僅為 0.39 lg（CFU/mL）；屠宰間空氣菌落數(shù)顯著高于排酸間和分割間，屠宰間前、中、后空氣菌落總數(shù)變化不顯著；分割間空氣初始菌落數(shù)較低僅為0.90 lg（CFU/cm2），隨著分割進行空氣中菌落數(shù)增加。說明在分割前用紫外對分割間進行殺菌是有效的，沖淋水中帶有少量細菌造成污染相對較小，屠宰過程來自牛毛皮污染不容忽視。

圖3 沖淋水、牛毛皮和屠宰車間空氣菌落計數(shù)Fig.3 Counts of tobal bacteria in Chonglin water，cattle fur and the air in processing plants

2.1.3 屠宰過程中牛肉微生物污染狀況 由圖4可知，牛肉在放血工序點的細菌總數(shù)僅為3.05 lg（CFU/g），在去頭蹄工序肉中菌落數(shù)較高達到4.18 lg（CFU/g）。在隨后工序中菌落數(shù)逐漸降低，在排酸工藝點達到最低，但在分割工序中牛肉污染較嚴重菌落總數(shù)達到4.8 lg（CFU/g）。說明在去頭蹄、分割工序肉中微生物數(shù)量相對較高，排酸間因嚴格控制溫度和濕度而且對進出人員有較高要求，嚴格的條件下使大多數(shù)微生物的生長繁殖受到抑制。

圖4 屠宰過程中各工序牛肉菌落計數(shù)Fig.4 Counts tobal bacteria of beef in the process of slaughter

2.2PCR-DGGE圖譜結(jié)果及分析

從不同工序點取樣進行PCR-DGGE結(jié)果如圖5所示，對DGGE圖譜上的條帶割膠、擴增、測序，登錄NCBI進行相似性比對，結(jié)果如表1所示。共回收得到35個條帶有26種菌，由表1可知未知序列與已知序列相似性較高，結(jié)果可用。

圖5（c）（泳道 b～h）表明，對比不同車間空氣取樣點的PCR-DGGE條帶，葡萄球菌、約氏不動桿菌、氣單胞菌存在于屠宰間和分割間空氣，且屠宰間空氣中還存在巨型解酪球菌，排酸間空氣只出現(xiàn)氣單胞菌且條帶較弱。說明屠宰間、排酸間、分割間的空氣菌相存在差異，且排酸間空氣質(zhì)量相對較好。

由圖5（c）（泳道 i～j）可知，動物毛皮主要存在巨型解酪球菌、約氏不動桿菌、葡萄球菌、鹽水球菌四種菌，沖淋水中出現(xiàn)約氏不動桿菌但條帶較弱。

由圖5（c）（泳道 k～r）可見，不同屠宰工序中牛肉主要含有約氏不動桿菌、葡萄球菌，在去頭蹄、剝皮、去紅白腔、修整、分割工序的牛肉中出現(xiàn)巨型解酪球菌，劈半工序和排酸肉只存在葡萄球菌條帶非常弱，分割肉中未發(fā)現(xiàn)約氏不動桿菌。

圖5（c）中字母標記的條帶未回收成功，但可以看出排酸肉經(jīng)過分割工序后條帶較多，未知條帶對應(yīng)的微生物可能來自分割間空氣、分割工序中工人所戴手套、刀、案板、傳送帶、鑷子，也可能來自前期工序污染。

由圖5（b）結(jié)果可知，放血后刀出現(xiàn)大腸桿菌、成團泛菌、腸模明串珠菌、腸桿菌菌屬這與放血點工人手操作前后菌種組成具有較高相似性，克呂沃爾菌屬、克雷伯氏菌屬主要存在于工人手，工人手攜帶的Lelliottia amnigena菌在放血后消失卻出現(xiàn)腸模明串珠菌，說明在此工序中工人手和所用刀存在交叉污染。去頭蹄刀在去頭蹄后減少了成團泛菌、克呂沃爾菌、克雷伯氏菌3種菌，可能轉(zhuǎn)移到了牛肉和工人手上。氣單胞存在于放血與去頭蹄的刀及工人手上。剝皮所用的刀在剝皮后菌相差異極顯著，肉體的內(nèi)表面是無菌的，由于剝皮使牛內(nèi)表面暴露，而此過程刀與內(nèi)表面接觸面積比較大，故刀上的菌轉(zhuǎn)移到了牛肉上；沙門氏菌、成團泛菌存在于剝皮工序工人手，剝皮后工人手上的檸檬酸桿菌、克呂沃爾菌、克雷伯氏菌、氣單胞菌消失但卻出現(xiàn)了莫拉氏菌，此工序工人手會與牛內(nèi)表、牛皮接觸，工人手即是污染源也是牛皮與牛內(nèi)表相互污染的傳播介質(zhì)。

圖5（d）表明，出紅白腔工藝點刀在出紅白腔后出現(xiàn)肉桿菌，劈半刀在劈半后出現(xiàn)水棲菌屬、Jeotgalicoccus sp.、惡臭假單胞、西宮皮膚球菌等，嗜冷菌存在于劈半與修整工序工具。出紅白腔工序中刀和工人手微生物種類相對較少，由于該工序只有一人操作，因此人與人之間的交叉污染相對較少。劈半工序中工作人員不直接接觸刀和牛肉，污染可能來源于牛肉和空氣，整個過程會有流動水對刀清洗，也間接清洗了牛胴體。從修整工序可知修整工序所用手鉤在操作后種類增加明顯，該工序要求工人用刀以手鉤進行輔助對肉進行修整，雖然手鉤與肉接觸面積較小但其污染不容忽視。

圖5（a）表明分割工序中約氏不動桿菌、水棲菌屬、乳酸菌、惡臭假單胞、西宮皮膚球菌、成團泛菌、芽孢桿菌、巨型解酪球菌存在整個流程所涉及的工具及手套中，其中砷球菌、放線菌、肉桿菌在干凈的案板上未發(fā)現(xiàn)，隨著分割進行出現(xiàn)于案板上及工人手套上，大腸桿菌、溶血不動桿菌僅存在于傳送帶使用前期，鹽水球菌僅存在于傳送帶使用后期。

圖5 取樣點A ～Z，a～z，z1～z4的PCR-DGGE圖譜Fig.5 PCR-DGGE analysis of collected samples from sites A ～Z，a～z，z1～z4

表1 DGGE條帶分離的主要細菌16S rRNA基因序列相似性比較Table 1 Comparison of 16S rRNA gene sequences of major microbe in DGGE bands

續(xù)表1

3 討論

作者直接提取樣本中的DNA，利用PCRDGGE技術(shù)來研究肉牛屠宰過程中的微生物污染。該技術(shù)在分析微生物菌群結(jié)構(gòu)方面具有快速、準確等優(yōu)勢[14-15]。通過該技術(shù)的應(yīng)用，分析屠宰工序點的菌群變化，指示出不同工序點的菌種引入及消減，對后期減菌技術(shù)的研究具有重要意義。

實驗對肉屠宰過程中的微生物污染來源及污染工序進行了全面研究，肉牛屠宰工序中的污染主要發(fā)生在去頭蹄和分割工序，主要污染源為與操作相關(guān)的刀、工人手、傳送帶、案板、鑷子、工人所戴手套等，這與張佳[16]等研究表明初始剝皮操作和去臟操作是肉牛屠宰工序中造成胴體微生物污染的2個關(guān)鍵工序結(jié)果不同，這可能是由于采樣地點不同，不同屠宰場操作不同等原因。屠宰工序的污染是影響原料肉品質(zhì)的關(guān)鍵因素，原料肉微生物污染控制作為HACCP體系的重要部分，是公共衛(wèi)生安全和肉品質(zhì)量的重要保證用傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法來研究肉牛屠宰工序微生物污染已有報道[16-17]。

葡萄球菌存在于所有取樣點，大腸桿菌為屠宰工序工具及工人手上最常見的菌。牛毛皮中含有大量污染物會影響食品的健康生產(chǎn)，研究證明牛皮中攜帶的約氏不動桿菌、葡萄球菌存在于整個屠宰過程。

劈半工序的和排酸工序?qū)η昂蠊ば蛭⑸飻?shù)量和種類有很大影響，因劈半工序整個過程會有流動水對刀進行清洗同時也對牛肉進行了一定程度的凈化，排酸工序因嚴格控制了溫度及濕度抑制了大多數(shù)微生物生長。

本試驗中某些菌種在不同工序點有階段性出現(xiàn)或增多，其中分割工序中的約氏不動桿菌、乳酸菌、砷球菌、放線菌、鹽水球菌、西宮皮膚球菌、芽孢桿菌、溶血不動桿菌在其他車間和工序中未檢出，莫拉氏菌、沙門氏菌、成團泛菌、檸檬酸桿菌、Lelliottia amnigena、克呂沃爾菌、克雷伯氏菌、腸膜明串珠菌、Enterobacter sp.主要存在于去頭蹄工序和放血所用工具上在其他車間及工序中未檢出。

4 結(jié) 語

1）屠宰間前、中、后空氣菌落數(shù)在 1.43～1.59 lg（CFU/cm2）之間，主要存在葡萄球菌、約氏不動桿菌、氣單胞。排酸間空氣菌落為1.19 lg（CFU/cm2），主要存在氣單胞且DGGE條帶較弱。約氏不動桿菌存在于分割間空氣且分割間空氣菌落數(shù)處于0.9～1.13 lg（CFU/cm2）左右。 說明空氣中存在的懸浮微生物會對原料牛肉造成一定污染。

2）劈半工序減少了牛肉中的約氏不動桿菌、巨型解酪球菌等，排酸工序肉中的菌落總數(shù)僅為3.03 lg（CFU/g）在所有工序的肉中最低且排酸過程葡萄球菌、巨型解酪球菌生長受到抑制。劈半工序中沖洗刀的流動水間接凈化了牛胴體減少了微生物，排酸工序嚴格控制溫度濕度以及嚴格控制進出工作人員的衛(wèi)生，減少和抑制了微生物繁殖。

3）出廠前牛肉菌落總數(shù)高達4.8 lg（CFU/g）主要攜帶約氏不動桿菌、巨型解酪球菌、葡萄球菌以及未回收成功條帶所對應(yīng)的菌，這些污染菌主要來源于牛毛皮以及去頭蹄、分割工序中工人手或手套、工具、傳送帶。

參考文獻：

[1]National advisory committee on microbiological criteria for foods.Ceneric HACCP for raw beef[Z].Food microbial，1993.

[2]PIPEK P，HOU K，JELENI K J，et al.Microbial decontamination of beef carcasses by combination of steaming and lactic acid spray[J].Food Eng，2005，67（3）：309-315.

[3]AYRES J C.Microbiological implications in the handling slaughtering and dressing of meat animals[J].Advances in Food Research，1982，6：109-161.

[4]DICKSON J S，ANDERSON M E.Microbiological decontamination of food animal carcasses by washing and sanitizing systems：a review[J].Food Protection，1992，55：133-140.

[5]HANSSON I C，HAMILTON T E，F(xiàn)OSLUND K.Carcass quality in certified organic production compared with conventional livestock production[J].Vet Med，2000，47：111-120.

[6]Norwegian Scientific Committee for Food Safety （NSCFS）.A risk assessment of shiga toxin-producing Escherichia coli（STEC）in the Norwegian meat chain with emphasis on dry-cured sausages[S].Panel on Biological Hazards，2007.

[7]EFSA.Scientific opinion on the public health hazards to be covered by inspection of meat（poultry）[Z].EFSA Journal，2012b.

[8]WANG Huawei，LIU Fang，WANG Daoying，et al.Microflora changes of chilled duck at processing plants[J].Journal of Nanjing Agricultural University，2013，36（1）：131-136.（in Chinese）

[9]于小喬.屠宰和分割工序?qū)φ婵瞻b冷卻牛肉貯藏過程微生物多樣性的影響[D].濟南：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

[10]GB 4789.2—2010，食品微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定[S].

[11]VITOR R，COSTA A M，F(xiàn)REITAS C S A A，et al.Comparison of DGGE and immuno histochemistry in the detection of TP53 variants in a Brazilian sample of sporadic breast tumors[J].Mol Biol Rep，2011，38：3351-3354.

[12]Shanquan Wang，Jianzhong He.Two-step denaturing gradient gel electrophoresis （2S-DGGE），a gel-based strategy to capture full-length 16S rRNA gene sequences[J].Appl Microbiol Biotechnol，2012，95：1305-1312.

[13]ALTSCHUL S F，MADDEN T L，SCHAFFER A A，et al.Gapped blast and psiblast：a new generation of protein database search programs[J].Nucleic Acids Research，1997，25：3389-3402.

[14]MUYZER G，WAAL E C，UITTERLINDEN A G.Profiling of complex and microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA [J].Applied of Environment Microbiology，1993，59：695-700.

[15]WU Junrui，YUE Xiqing，SHI Pu，et al.Diversity of lactic acid bacteria involved in Suan-Cai using PCR-DGGE[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2014，33（2）：127-130.（in Chinese）

[16]ZHANG Jia，XU Yan，HUO Xiaowei，et al.Analysis of microbial contamination in beef cattle slaughter process and research on the technology of spraying[J].Meat Research，2011，37（10）：209-213.（in Chinese）

[17]ZWEIFEL C，F(xiàn)ISCHER R，STEPHAN R.Microbiological contami-nation of pig and cattle carcasses in different small-scaleswiss abattoirs[J].Meat Science，2008，78：225-231.