蔣然然，鐘海霞，但 靜，陳治光， 李 冉，蔣光陽， 楊 娟，李美良， 李樹紅

（四川農(nóng)業(yè)大學 食品學院，四川 雅安 625014）

半胱氨酸蛋白酶抑制劑 （cysteine proteinase inhibitors，CPIs）， 最初被發(fā)現(xiàn)于 20世紀 60年代[1]，而后其又被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)廣泛分布于生物體各組織中[2]。根據(jù)其氨基酸長度、相對分子質(zhì)量大小、二硫鍵的數(shù)目以及有無糖基化位點等分子結(jié)構(gòu)特性，可將半胱氨酸蛋白酶抑制劑劃分為3個家族，其中的家族III是CPIs超家族中蛋白相對分子質(zhì)量最高的抑制劑，即Kininogens（相對分子質(zhì)量約6×104～1.2×105）[3]。目前，僅對哺乳動物和鳥類CPIs的研究相對透徹，其中對哺乳動物kininogen的研究發(fā)現(xiàn)其不僅是一種半胱氨酸蛋白酶抑制因子，還是一種多功能蛋白[4]。kininogen作為緩激肽的前體在凝血和抗凝血方面發(fā)揮作用[5-6]，同時還參與腫瘤抑制[7]，免疫調(diào)節(jié)[8]，細胞凋亡[9-10]，抑菌[11-12]等多種生理和病理過程。目前關(guān)于魚類kininogen的研究僅有從大西洋鮭魚Atlantic salmon（Salmo salar L.）皮[13]，大西洋鱈魚Atlantic cod（Gadus morhua L.）皮和花狼鳚 Spotted wolffish（Anarhichas minor）皮[14]中得到了純化。

研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動物kininogen主要在肝臟合成，再進而分泌到血液等各組織，而魚類kininogen的表達模式與此相似，其在七星鰻lampreys（Lampetra japonica）[15]肝臟中的mRNA表達水平最高，并且從魚類肝臟中也檢測到了CPIs活性[16-17]，但目前尚未見從魚類肝臟中具體純化kininogen方法的相關(guān)報道。鰱魚（Hypophthalmichthys molitrix）作為中國四大家魚之一，其資源豐富[18]，且在加工過程中產(chǎn)生大量廢棄物，如魚皮、內(nèi)臟等，鑒于對魚類多功能蛋白kininogen的研究十分有限，作者選擇kininogen含量豐富的鰱魚肝臟為材料來源，通過對其中高分子CPIs初步提取條件的系統(tǒng)篩選，建立了最佳的粗提方法，并通過分子篩層析和反相酶譜進一步驗證，以便為后續(xù)鰱魚肝臟中kininogen的精細分離純化和深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

取鰱魚的新鮮肝臟組織，用4℃蒸餾水清洗除去表面血污，-80℃凍存，用前4℃解凍。

藍色葡聚糖-2000（2×105）、r-球蛋白（1.5×105）、牛血清白蛋白（6.6×105）、胃蛋白酶原（4.3×104）、胰蛋白酶（2.33×104）、細胞色素 C（1.3×104）、乳鏈菌肽（3.35×103）、TYR-GLY-GLY-PHE-MET （1.046×103）、ASP-ARG-VAL-TYR-ILE-HIS-PRO-PHE（573）、寬相對分子質(zhì)量蛋白標品 （6.5×103～200×103）：日本Takara公司產(chǎn)品；蛋白質(zhì)濃度測試試劑盒：南京建成生物工程研究所產(chǎn)品；木瓜蛋白酶（Papain）、熒光合成肽（Z-Phe-Arg-MCA）、苯甲基磺酰氟（PMSF） 、明膠、過硫酸銨（Aps）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、甲叉雙丙烯酰胺（Bis）、丙烯酰胺（Acr）牛血清白蛋白（BSA）：美國Sigma公司產(chǎn)品；分子篩Sephacryl S-200：美國GE公司產(chǎn)品。

1.2 儀器和設(shè)備

大容量高速冷凍離心機、全波長熒光/比色掃描讀數(shù)儀：美國Thermo Electron公司產(chǎn)品；Scientz-IID超聲波細胞粉碎機：蘇州江東精密儀器有限公司產(chǎn)品；TSK G2000 SWXL凝膠過濾高效液相柱：日本TOSOH公司產(chǎn)品；LC-2010C HT高效液相色譜儀：日本SHIMADZU產(chǎn)品；PowerPac 3000電泳電源、Mini Protein電泳槽、Biologic DouFlow全自動中高壓層析系統(tǒng)：美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；Ultra-8050超濾杯：美國Millipore公司產(chǎn)品。

1.3 實驗方法

1.3.1 鰱魚肝臟中高分子CPIs的粗提取條件篩選

1）CPIs粗提取緩沖液中絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF濃度篩選 4等份鰱魚肝臟4℃解凍后于冰上用剪刀充分剪碎，分別加入4倍體積的含0 mmol/L （對照組）、1、3、5 mmol/L PMSF 的提取緩沖液 （100 mmol/L的 Tris，3 mmol/L的 EDTA的提取液，pH 7.5）超聲破碎（功率 30%，4℃，按工作 1 s停1 s的時間程序超聲至肝臟破碎均勻），4℃離心（10 000 g，20 min），取上清液，經(jīng) 30×103超濾膜濃縮10倍，用于TSK凝膠過濾高效液相分析并回收高分子部分（保留時間RT≤17 min）用于CPIs抑制活性測定。

2）CPIs粗提取過程中熱處理溫度的篩選 3等份鰱魚肝臟，按篩選的適宜PMSF濃度的提取緩沖液進行提取，所得上清液用4層紗布過濾，分為3組， 濾液分別經(jīng) 70 ℃（15 min）、80 ℃（10 min）、90℃（5 min）水浴加熱處理后4℃離心 （10 000 g，20 min）取上清液，經(jīng)3.0×104超濾膜濃縮10倍，用于TSK凝膠過濾高效液相分析，并回收高分子部分（保留時間RT≤17 min）用于CPIs抑制活性測定。

3）CPIs粗提取過程中酸堿處理條件的篩選鰱魚肝臟，先按篩選的含適宜PMSF濃度的緩沖液

提取的鰱魚肝臟CPIs粗提液，再經(jīng)1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH至8.7，然后經(jīng)確定的適宜條件進行熱處理，最后用1 mol/L的 HCl回調(diào)pH至7.0，經(jīng)4℃離心（10 000 g，20 min）后取上清液，經(jīng) 3.0×104超濾膜濃縮10倍，用于TSK凝膠過濾高效液相分析，并回收高分子部分 （保留時間RT≤17 min）用于CPIs抑制活性的測定。

1.3.2 蛋白質(zhì)濃度的測定 由Bradford[19]方法，按照南京建成生物工程研究所的蛋白質(zhì)濃度試劑盒相關(guān)說明方法來測定提取液的蛋白質(zhì)濃度。

1.3.3 CPIs抑制活性的測定 以 Anastasi[20]和Barrett[21]的方法作為參考，利用熒光合成肽底物法監(jiān)測各條件下高分子CPIs收集液對木瓜蛋白酶的抑制活性，激發(fā)和發(fā)射波長分別為360 nm和440 nm。把40℃、pH 6.8的反應(yīng)條件下，底物在1 min內(nèi)被水解并釋放1 nmol的AMC產(chǎn)物的酶活性量（1 nmol AMC/min）定義為1個酶活單位，相應(yīng)的能夠抑制1個酶活單位的活性被定義為一個抑制活性單位。

1.3.4 CPIs粗提液的凝膠高效液相鑒定分析 先用緩沖液A（含質(zhì)量分數(shù)0.05%NaN3和0.1 mol/L Na2SO4的0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液，pH 6.7）平衡TSK 凝膠過濾高效液相柱 （7.8 mm×30 cm，5 μm）。將各條件下鰱魚肝臟CPIs的粗提液用截留相對分子質(zhì)量為3×103的透析袋在超純水中透析除鹽、經(jīng)0.22 μm的微濾膜微濾后上樣100 μL，之后以0.5 mL/min的流速進行洗脫并回收保留時間RT≤17 min的部分。先用藍葡聚糖-2000測定得到空體積V0，再分別測得標準蛋白γ-球蛋白、牛血清白蛋白、胃蛋白酶原、胰蛋白酶、細胞色素C、乳鏈菌肽、TYR-GLY-GLY-PHE-MET和ASP-ARG-VALTYR-ILE-HIS-PRO-PHE在相同條件下的洗脫體積Ve。根據(jù)標準蛋白分子質(zhì)量對數(shù)和Ve與V0的比值求得標準曲線，最后由該標準曲線分析鰱魚肝臟中CPIs相對分子質(zhì)量的分布情況。

1.3.5 Sephacryl S-200分子篩層析 根據(jù)1.3.1最終篩選確定的適宜方法，大量制備的鰱魚肝臟CPIs粗提取液，經(jīng)過濃縮（截留相對分子質(zhì)量3.0×104）、微濾（0.22 μm）后，由制備型 Sephacryl S-200 分子篩（2.5 cm×90 cm）經(jīng)行分離。以0.44 mL/min的流速，用含磷酸鹽緩沖液 （含0.2 mol/L的 NaCl，pH 6.0）洗脫，收集液6.0 mL每管。根據(jù)測定的每管收集液中CPIs的抑制活性，得到其活性部分，經(jīng)濃縮（截留相對分子質(zhì)量3.0×104的超濾膜）后用于后續(xù)鑒定分析。

1.3.6 高分子CPIs的SDS-PAGE及明膠底物-SDS-反相酶譜鑒定 根據(jù)電泳試劑盒中電泳分離膠和濃縮膠的配制方法制備12 g/dL的分離膠，之后根據(jù)樣品濃度上適宜量的樣品，使之不超過每個孔道的最大上樣量20 μL，電泳結(jié)束后經(jīng)考馬斯亮藍R-250染色過夜，之后用脫色液脫色至背景顏色消失，條帶清晰。之后根據(jù)適當改進的Li等[22]的方法做明膠底物-SDS-反相酶譜鑒定，并以比樣品濃度稍高的BSA做其明膠底物-SDS-反相酶譜鑒定的對照，也是在相同條件下先經(jīng)行普通SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后將凝膠復興，復性后的凝膠用50 mmol/L的磷酸鹽緩沖液（含0.4 mg/mL的木瓜蛋白酶，pH 7.0）在4℃的條件下反應(yīng)1 h，隨后用50 mmol/L的磷酸鹽緩沖液 （含質(zhì)量分數(shù)1%明膠，pH 7.0）在37℃的條件下反應(yīng)12 h，之后進行染色、脫色。

2 結(jié)果與分析

2.1 鰱魚肝臟中CPIs的粗提取條件篩選結(jié)果

2.1.1 提取液中 PMSF濃度篩選結(jié)果 CPIs作為半胱氨酸蛋白酶的可逆抑制因子，不具有抑制絲氨酸蛋白酶的活性，同時考慮到鰱魚肝臟腺中含有豐富的絲氨酸蛋白酶活性[23-24]，因此，有必要在提取緩沖液中加入絲氨酸蛋白酶的不可逆抑制劑PMSF。當以含不同濃度PMSF提取緩沖液獲得的鰱魚肝臟CPIs粗提物進行TSK液相分析時，發(fā)現(xiàn)提取液中不添加PMSF的對照組（如圖1所示）中的蛋白發(fā)生了明顯的降解，隨著提取液中PMSF濃度提高，水解現(xiàn)象被逐步抑制（如圖2、圖3所示），特別是可能含有kininogen的高相對分子質(zhì)量部分（TSK上保留時間RT≤17 min，對應(yīng)相對分子質(zhì)量≥5.0×104，如橫桿所示）的蛋白峰響應(yīng)值，含不同濃度PMSF的實驗組均明顯高于對照組，且尤以加5 mmol/L PMSF組最高（加1 mmol/L PMSF組的TSK液相分析圖省略）。同時由各PMSF濃度下CPIs粗提取液的TSK高分子（RT≤17 min）回收部分的抑制活性測定結(jié)果（表1）可知，5 mmol/L PMSF組抑制活性的總活和比活均最高。結(jié)合TSK液相分析和CPIs抑制活性分析結(jié)果，說明提取液中添加5 mmol/L PMSF能抑制部分鰱魚肝臟中絲氨酸蛋白酶對CPIs的降解，這對于盡可能最大限度地回收鰱魚肝臟中高分子CPIs而言非常重要，因此選取提取過程中加入5 mmol/L的PMSF作為優(yōu)化條件。

圖1 未加PMSF的鰱魚肝臟CPIs的凝膠高效液相色譜分離Fig.1 Separation of Silver carpliver CPIs by HPLC of TSK-GEL G2000SW without PMSF

圖2 加入3 mmol/L PMSF的鰱魚肝臟CPIs的凝膠高效液相色譜分離Fig.2 Separation of Silver carpliver CPIs by HPLC of TSK-GEL G2000SW with 3 mmol/L PMSF

圖3 加入5 mmol/L PMSF的鰱魚肝臟CPIs的凝膠高效液相色譜分離Fig.3 Separation of Silver carpliver CPIs by HPLC of TSK-GEL G2000SW with 5 mmol/L PMSF

2.1.2 CPIs粗提取過程中熱處理溫度的篩選 由于CPIs具有良好的熱穩(wěn)定性[3]，同時一些熱穩(wěn)定的絲氨酸蛋白酶（胰蛋白酶）在50℃加熱的情況下仍然保持活性[24]，因此在提取過程中設(shè)計對樣品進行熱處理。以含5 mmol/L PMSF的緩沖液提取得到的鰱魚肝臟中CPIs粗提液上清，分別經(jīng)過70℃加熱15 min、80℃加熱10 min和90℃加熱5 min后，再進行TSK凝膠高效液相分析（圖4、圖5、圖6），由圖可知，加熱除去了鰱魚肝臟粗提液中大量的熱不穩(wěn)定蛋白成分，特別是低相對分子質(zhì)量部分（TSK上保留時間RT＞17 min，對應(yīng)相對分子質(zhì)量＜5.0×104）的雜蛋白，其中90℃處理5 min組降低的最為明顯，這十分有利于目的蛋白的純化。同時70℃加熱15 min和80℃加熱10 min所得CPIs粗提液的高分子部分（TSK上保留時間RT≤17 min，對應(yīng)相對分子質(zhì)量≥5.0×104，如橫桿所示）的蛋白峰響應(yīng)值略高于90℃處理5 min組，但從該部分的抑制活性測定結(jié)果（表2）可知，90℃處理 5 min組抑制活性的蛋白濃度最低，抑制比活性最高，對于目的蛋白純化而言，是非常有利的。結(jié)合TSK液相分析和CPIs抑制活性分析結(jié)果，最終選取90℃，5 min為提取過程中適宜的熱處理條件。

表1 不同PMSF濃度條件下鰱魚肝臟高分子CPIs粗提液的抑制活性分析Table 1 Inhibitory activities of CPIs of the crude extracts from Silver carpliver with Z-Phe-Arg-MCA Under the condition of different PMSF concentration

3組總活性相對于第一步驟含5 mmol/L PMSF粗提液的總活（表1）都有所下降，說明加熱過程在除去鰱魚肝臟粗提液中雜蛋白的同時，一定程度上也會損失高分子的CPIs，但是三者相較而言，90℃加熱條件下鰱魚肝臟的高分子部分總活性損失量相對較小，比活最高，這可能主要與高分子kininogen比其他雜蛋白耐熱性更強有關(guān)，該步驟迅速提高了高分子CPIs的抑制比活，可作為提取鰱魚肝臟高分子CPIs的關(guān)鍵步驟。作者所在實驗室早期對純化的鰱魚卵中kininogen的熱穩(wěn)定性研究發(fā)現(xiàn)，其在70～80℃范圍內(nèi)均十分穩(wěn)定[25]。

另一方面，低分子雜蛋白部分，90℃加熱組下降最快，可能與鰱魚肝臟中低分子雜蛋白對熱的敏感性較強有關(guān)。

圖4 經(jīng)70℃加熱的鰱魚肝臟CPIs的凝膠高效液相色譜分離Fig.4 Separation of Silver carpliver CPIs by HPLC of TSK-GEL G2000SW after heating treatment at 70℃

圖5 經(jīng)80℃加熱的鰱魚肝臟CPIs的高效液相色譜分離Fig.5 Separation of Silver carpliver CPIs by HPLC of TSK-GEL G2000SW after heating treatment at 80℃

圖6 經(jīng)90℃加熱的鰱魚肝臟CPIs的高效液相色譜分離Fig.6 Separation of Silver carpliver CPIs by HPLC of TSK-GELG2000SWafterheatingtreatmentat90℃

表2 不同溫度條件下鰱魚肝臟CPIs粗提液的抑制活性分析Table 2 Inhibitory activities of CPIs of the crude extracts from Silver carpliver with Z-Phe-Arg-MCA Under the condition of different temperatures

2.1.3 CPIs粗提取過程中堿酸處理條件的篩選由于CPIs具有良好的pH穩(wěn)定性[3]，且根據(jù)Matilde[27]對CPI的提取方法，在其基礎(chǔ)上做適當改進，因此在提取過程中設(shè)計對樣品進行適當?shù)膲A酸處理。即經(jīng)pH 8.7堿處理后，90℃加熱5 min后，再酸回調(diào)到pH 7.0，所得粗提液進行TSK凝膠高效液相分析（圖7），由圖可知，CPIs粗提液中高相對分子質(zhì)量部分（TSK上保留時間RT≤17 min，對應(yīng)相對分子質(zhì)量≥5.0×104，如橫桿所示）的蛋白峰響應(yīng)值，低于90℃加熱組（圖6），而RT＞17 min的小分子雜蛋白部分則與90℃加熱組（圖6）相似，同時發(fā)現(xiàn)RT≤17 min部分的抑制活性比活明顯上升（表3），這可能是由于90℃高溫和堿酸調(diào)節(jié)的協(xié)同作用下，去除了高分子部分的雜蛋白，而耐酸堿、且熱穩(wěn)定的高分子CPIs幾乎沒有受到影響。由此可以初步判斷在90℃加熱過程結(jié)合堿酸調(diào)節(jié)是可取的處理方式。

圖7 經(jīng)酸堿處理后的鰱魚肝臟CPIs的凝膠高效液相色譜分離Fig.7 Separation of Silver carpliver CPIs by HPLC of TSK-GEL G2000SW after alkali-acid treatment

表3 加熱結(jié)合堿酸處理后鰱魚肝臟CPIs粗提液的抑制活性分析Table 3 Inhibitory activities of CPIs of the crude extracts from Silver carpliver with Z-Phe-Arg-MCA after alkali-acid treatment

2.2 鰱魚肝臟粗提CPIs的Sephacryl S-200分子篩層析

采用確定的最佳提取方案大量制備鰱魚肝臟中的CPIs粗提液，經(jīng)3.0×103超濾膜濃縮并透析后，上制備型Sephacryl S-200分子篩層析（圖8）。如圖所示，在制備型的分子篩層析上，抑制活性峰主要體現(xiàn)在高相對分子質(zhì)量部分（橫桿所示），并且能夠與低相對分子質(zhì)量雜蛋白部分得到較好的區(qū)分。低相對分子質(zhì)量部分的抑制活性峰很低，與作者采用的熱處理方式和超濾截留有一定關(guān)系。

圖8 鰱魚肝臟CPIs的Sephacryl S-200分子篩層析Fig.8 Sephacryl S-200 chromatography of CPIs from Silver carpliver

2.3 鰱魚肝臟中高分子CPIs的反相酶譜分析

將經(jīng)過Sephacryl S-200分子篩層析后收集到的高分子活性峰的峰尖濃縮后，用反相酶譜法鑒定其抑制條帶，圖9為其鑒定結(jié)果，可見經(jīng)木瓜蛋白酶水解作用，對照蛋白BSA（泳道2）和活性峰中的雜蛋白 （泳道3）被完全水解 （泳道4和泳道5所示），而對木瓜蛋白酶具有抑制作用的蛋白質(zhì)，在電泳上體現(xiàn)為抑制劑條帶（泳道5，箭頭所示），經(jīng)計算該蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量約為1.94×105，因此推測鰱魚肝臟中存在一種1.94×105的高相對分子質(zhì)量形式的活性CPI。但是由于屬于家族III的高分子CPIs的相對分子質(zhì)量約 6.0×104～1.2×105， 又有研究表明從鯉魚卵膜中提取的半胱氨酸蛋白酶抑制劑以共軛鍵結(jié)合的方式與兩種卵膜中的蛋白質(zhì)形成了大于6.0×104且小于2.0×105的高分子的復合物。

3 結(jié)語

由于鰱魚肝臟中絲氨酸蛋白酶活性高，而其中含量豐富的高分子CPIs在提取和純化過程中可能被降解，因此作者對鰱魚肝臟中CPIs粗提條件進行了篩選，從提取緩沖液中PMSF濃度、加熱處理條件和酸堿處理3個方面來進行優(yōu)化，最終確定以含5 mmol/L PMSF的提取液進行提取，而后經(jīng)過pH 8.7堿處理，90℃加熱5 min后再回調(diào)pH 7.0，為適宜的粗提取方法。經(jīng)活性測定和反相酶譜鑒定表明，所得到的CPIs粗提液中保留了明顯的高分子CPIs抑制活性。

1： 寬相對分子質(zhì)量蛋白質(zhì)標準品 （14.3×103～200×103）；2：BSA；3：鰱魚肝臟高分子CPIs收集液；4：反相酶譜處理后的BSA；5：反相酶譜處理后的鰱魚肝臟高分子CPIs收集液

參考文獻：

[1]FOSSUM K，WHITAKER J R.Ficin and papain inhibitor from chicken egg white[J].Archives of Biochemistry&Biophysics，1968，125（1）：367-375.

[2]DUBIN G.Proteinaceous cysteine protease inhibitors[J].CMLS Cellular and Molecular Life Sciences，2005，62：653-669.

[3]OCHIENG J，CHAUDHURI G.Cystatin superfamily[J].J Health Care Poor Underserved，2010，21：51-70.

[4]LALMANACH G，NNUDIN C，LECAILLE F，et al.Kininogens：More than cysteine protease inhibitors and kinin precursors[J].Biochimie，2010，92（11）：1568-1579.

[5]ZHOU Liwei，MA Fei，LI Qingwei.Progress in the study on alternative splicing and functionsof kininogen genes[J].Hereditas，2006，28（12）：1649-1655.（in Chinese）

[6]BAGLIA F A，BADELINO K O，LI C Q，et al.Factor XI binding to the platelet glycoprotein Ib-IX-V complex promotes factor XI activation by thrombin[J].The Journal of Biological Chemistry，2007，282（39）：29067.

[7]LIU Y，PIXLEY R，F(xiàn)USARO M，et al.Cleaved high-molecular-weight kininogen and its domain 5 inhibit migration and invasion of human prostate cancer cells through the epidermal growth factor receptor pathway[J].Oncogene，2009，28（30）：2756-2765.

[8]SCHARFSTEIN J，SCHMITZ V，SVENSJO E，et al.Kininogens coordinate adaptive immunity through the proteolytic release of bradykinin，an endogenous danger signal driving dendritic cell maturation[J].Sandinavian Journal of Immunology，2007，66（2-3）：128-136.

[9]SUN D，MCCRAE K.Endothelial-cell apoptosis induced by cleaved high-molecular-weight kininogen（HKa） is matrix dependent and requires the generation of reactive oxygen species[J].Blood，2006，107：4714-4720.

[10]XU Xiuyue，YANG Wei，WU Bin，et al.Effect of synthetic peptides derived from HKa D5 on proliferation and apoptosis of MDA-MB-231 cells[J].Journal ofChina Medical University，2008，37（4）：494-499.（in Chinese）

[11]NORDAHL E A，RYDENGARD V，MORGELIN M，et al.Domain 5 of high molecular weight kininogen is antibacterial[J].The Journal of Biological Chemistry，2005，280（10）：34832-34839.

[12]SONESSON A，NORDAHL E A，MALMSTEN M，et al.Antifungal activities of peptides derived from domain 5 of highmolecular-weight kininogen[J].International Journal of Peptides，2011.

[13]YLONEN A，RINNE A，HERTTUAINEN J，et al.Atlantic salmon （Salmo salar L.） skin contains a novel kininogen and another cysteine proteinase inhibitor[J].European Journal of Biochemistry/FEBS，1999，266（3）：1066-1072.

[14]YLONEN A，HELIN J，BOQWALD J，et al.Purification and characterization of novel kininogens from spotted wolffish and Atlantic cod[J].European Journal of Biochemistry/FEBS，2002，269（11）：2639-2646.

[15]ZHOU L，LIU X，JIN P，et al.Cloning of the kininogen gene from Lampetra japonica provides insights into its phylogeny in vertebrates[J].Journal of Genetics and Genomics，2009，36（2）：109-115.

[16]MICHIAKI Y，SHIRO K.A comparison of cystatin activity in the various tissues of chum salmon Oncorhynchus keta between feeding and spawning migrations[J].Comparative Biochemistry and Physiology Part A：Physiology，1991，100（3）：749-751.

[17]LI Shuhong，REN Yangyang，LI Yanfang，et al.Comparative study on three electrophoresis methods for identifying silver carp CPIs[J].Science and Technology of Food Industry，2013，34（21）：56-64.（in Chinese）

[18]ZHANG Min，ZHANG Jun.A research review of low value freshwater fishes processingand their discards utilization[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2006（5）：115-120.（in Chinese）

[19]BRADFORD M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J].Analytical Biochemistry，1976，72（1-2）：248-254.

[20]ANASTASI A，BROWN M A，KEMBHAVI A A，et al.Cystatin，a protein inhibitor of cysteine proteinases.Improved purification from egg white，characterization，and detection in chicken serum[J].Biochemical Jourmal，1983，211（1）：129-138.

[21]BARRETT A J，KIRSCHKE H.Cathepsin B，Cathepsin H and Cathepsin L[J].Methods in Enzymology，1981，80（41）：535-561.

[22]LI D K，LIN H，KIM S M.Purification and characterization of a cysteine protease inhibitor from chum salmon（Oncorhynchus keta） plasma[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2008，56（1）：106-111.

[23]CAO Minjie，LI Yan，WENG Ling，et al.Study on myofibril-bound serine proteinase in silver carp[J].Food Science，2005（1）：91-94.（in Chinese）

[24]UAN Shan，TANG Chengzheng，et al.Advances in researches of main endogenous proteases in surimi[J].Academic Periodical of Farm Products Processing，2014（3）：52-61.（in Chinese）

[25]劉玲.鰱魚卵中高分子CPIs的純化鑒定及其對Ishikawa細胞影響的初探研究[D].雅安：四川農(nóng)業(yè)大學，2014.