馮 潔, 林金杏, 高 誠

(上海實驗動物研究中心, 上海 201203)

卡氏肺孢子菌(Pneumocystis carinii，Pc)是一種人獸共患機會性致病病原體，既往將其列為原生動物門，單孢子蟲綱，弓形蟲目，稱為卡氏肺孢子蟲。1980年代后，隨著分子水平研究的進展，人們認為它是一種不典型的真菌，將其歸為子囊菌綱(Ascomycetes)，并更名為肺孢子菌[1]。該菌可感染多種哺乳動物，常寄居于宿主肺組織，在健康宿主體內(nèi)并不引發(fā)癥狀，對于免疫低下或缺陷宿主常引起肺孢子菌肺炎。

1 病原特性與分類學進展

20世紀初Chagas和Carinii[2]首次從豚鼠肺組織中發(fā)現(xiàn)病原，1912年Delanog’s夫婦從大鼠肺中檢出，進一步證實它是一種新的病原體，為紀念Carinii 而將其命名為卡氏肺孢子蟲 (Pneumocystis carinii, Pc)。

肺孢子菌在分類學上兼有原蟲和真菌二者的特點，長期以來其分類地位一直存在爭議。由于其形態(tài)和生活史與原蟲相似，菌膜結構與瘧原蟲相似，微管的超微結構與孢子蟲類似; 胞膜上富含膽固醇，缺乏真菌胞膜上普遍存在的麥角固醇，廣譜抗真菌藥物對其無效; 在真菌培養(yǎng)基上不能連續(xù)生長，對原蟲的藥物如戊烷脒、磺胺類藥物敏感[3]，因此過去大部分學者傾向于將其歸為原蟲，歸屬孢子蟲綱(Sporozoa)。

隨著現(xiàn)代分子生物學技術的不斷發(fā)展和應用,人們對肺孢子菌的認識不斷深化。Edman等[4]對肺孢子菌16S rRNA基因序列分析表明其與啤酒酵母菌具有很高的相似性, 包囊壁主要成分與釀酒酵母菌同源性高于任何一種已知原蟲, 線粒體煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)脫氫酶亞基及細胞色素氧化酶DNA序列與真菌的同源性(60%)超過與原蟲的同源性(20%)。將肺孢子菌與釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)、白色念珠菌(Canidia albicans)、新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)、藍氏賈第蟲(Giardia lamblia)及弓形蟲(Toxoplasma Gondii)在18S rRNA水平的相似性進行比較，表明其序列與真菌更為相似。肌動蛋白、β-微管蛋白和鈣調(diào)素是生物進化中最保守的一類蛋白質(zhì)，將肺孢子菌肌動蛋白基因與其他30多種生物的序列進行比對，表明其與多數(shù)真菌相近。肺孢子菌和真菌具有合成蛋白質(zhì)所必需的延長因子III，而原蟲則缺乏這種因子。近年來研究[5-7]表明，其胞膜富含β-1,3-葡聚糖、幾丁質(zhì)等真菌中存在的特異物質(zhì)，某些超微結構與真菌也相似。上述一系列研究結果從囊壁超微結構、基因序列、蛋白質(zhì)功能等層面均證實肺孢子菌應歸為真菌范疇。1976年Frenkel等[8]報道感染人與鼠的肺孢子菌在形態(tài)和免疫原性等方面均有所不同，提議將導致人類肺炎的肺孢子菌命名為耶氏肺孢子菌(Pneumocystis jeroveci)，此后專業(yè)文獻[9-12]逐漸沿用這個名稱，其真菌分類歸屬為子囊菌門(Ascomycota)外囊菌亞門(Taphrinomycotina)肺孢子菌綱(Pneumocystidomycetes)肺孢子菌目(Pneumocystidales)肺孢子菌科(Pneumocystidaceae）肺孢子菌屬(Pneumocystis)。在2001年召開的機會性原生生物國際研討會上，科學家們一致通過重新修改命名，以肺孢子菌代替卡氏肺孢子蟲成為屬，而原先被認為寄生于人體的卡氏肺孢子蟲僅寄生于大鼠[13]。

2 流行病學

肺孢子菌呈世界性分布，在多種哺乳類動物，包括人、鼠、兔、犬、貓、豬、羊、靈長類等體內(nèi)發(fā)現(xiàn)過該菌，鼠類的帶菌狀態(tài)非常普遍。不同宿主來源的肺孢子菌異質(zhì)性較高，染色體核型、基因多態(tài)性、免疫原性等差異較大[14,15]。每一種宿主可感染一種或多種不同型的肺孢子菌，不同來源的肺孢子菌形態(tài)和生活史較一致，主要有滋養(yǎng)體、包囊前期、包囊三種形態(tài)。滋養(yǎng)體形態(tài)多變，具有類似原蟲偽足結構及其活動方式，發(fā)育為包囊前期，經(jīng)細胞核分裂形成具有8個囊內(nèi)小體的成熟包囊。包囊呈圓形或卵圓形，表面光滑，直徑5～8 μm，囊壁厚100～160 nm[16]。

感染患者和健康帶菌者均可為傳染源，嚙齒類和兔是重要的傳播媒介。通常認為肺孢子菌包囊經(jīng)空氣傳播進入宿主肺內(nèi)，附著在肺上皮細胞表面，很少侵入細胞內(nèi)，呈隱性感染，當宿主免疫力低下時可大量繁殖。但不能通過食物及飲水傳播，可經(jīng)胎盤垂直傳播感染胎兒，是否存在血液傳播途徑目前尚不清楚[17,18]。

動物實驗表明[19]，免疫力正常宿主的肺內(nèi)可帶有菌體成為傳染源，與病鼠同籠飼養(yǎng)的健康小鼠發(fā)生一過性感染，早期 PCR 檢查陽性，4 周后可查到包囊，5～6 周后隨著獲得性免疫反應產(chǎn)生，菌體自動消失，不出現(xiàn)任何臨床癥狀。成熟包囊為感染階段。陳艷等[20]用Giemsa染色法檢查實驗小鼠肺孢子菌感染率為2%。Serikawa等[21]取無肺孢子菌感染的409只裸小鼠，放入不同級別的飼養(yǎng)設備飼養(yǎng), 結果6個月后17.2%的動物呈陽性。兔肺孢子菌自然感染率很高[22]。李華軍等[23]于2005年采用染色法和PCR法對6個品系共177只實驗動物肺孢子菌隱性感染狀況作調(diào)查，結果Giemsa法陽性率為6.8%，改良的六亞甲基四胺銀(GMS)法陽性率為13.6%，PCR法陽性率高達49.1%。

3 致病性

該菌大多呈隱性感染，機體抵抗力下降時處于潛伏狀態(tài)的菌體進行大量繁殖，才可能發(fā)生顯性感染。一般認為[1,24]，機體吸入空氣中的肺孢子菌包囊而感染，條件適宜時包囊轉(zhuǎn)為滋養(yǎng)體，后者寄生于肺泡上皮細胞和肺泡間隔內(nèi)，隨肺泡中肺孢子菌的大量繁殖并在肺組織內(nèi)擴散，纖維連接素在菌體和宿主細胞受體之間起橋梁作用，促使其附著在肺泡表面。隨著菌體增殖，肺泡毛細血管通透性增加、肺間質(zhì)增寬、肺泡上皮細胞脫落，肺泡內(nèi)出現(xiàn)以滋養(yǎng)體、包囊和炎性細胞為主的滲出物，表面活性物質(zhì)減少，肺彌散功能降低，導致肺泡-毛細血管血氣交換功能障礙，進而引起缺氧出現(xiàn)呼吸衰竭而死亡。近年來關于肺孢子菌感染與宿主免疫應答、免疫調(diào)節(jié)及影響因素等方面的問題成為該領域的研究熱點。滋養(yǎng)體和包囊胞壁上含有多種抗原類物質(zhì)，如主要表面糖蛋白、P55蛋白、A12蛋白、主要表面糖蛋白相關抗原等，這些蛋白與機體感染肺孢子菌肺炎的過程密切相關。侵襲肺泡時可破壞機體免疫系統(tǒng)，引發(fā)宿主產(chǎn)生特異性細胞免疫、體液免疫及非特異性免疫反應[25-28]。

大鼠、小鼠感染肺孢子菌主要表現(xiàn)為精神沉郁、被毛粗亂、消瘦、發(fā)熱、咳嗽、呼吸困難等癥狀。免疫缺陷小鼠、遺傳修飾造成免疫功能不全的小鼠易感，呈亞急性或慢性病程，持續(xù)數(shù)周甚至數(shù)月，動物體質(zhì)量逐漸減輕，呼吸窘迫，衰弱，裸鼠皮膚發(fā)紺，年長鼠較年輕鼠嚴重，呈進行性消耗病特征，最終導致窒息[29]。剖檢可見病變多集中在肺臟，表面可見散在米粒大小灰白色結節(jié)性病灶，肺泡壁充血、擠壓切面有少許粉紅色泡沫樣液體溢出，肺泡腔內(nèi)泡沫狀滲出物大量肺孢子菌滋養(yǎng)體、包囊及其崩潰物，肺印片可見肺孢子菌，以包囊為主。兔急性肺部感染主要表現(xiàn)為多發(fā)、散在的實變灶，多分布于肺野外周。猴感染肺孢子菌后表現(xiàn)為肺水腫、出血、肉樣變、間質(zhì)增寬、肺不張，切面流出紅色泡沫樣液體，瀕死期口吐白色泡沫樣物質(zhì)[16]。

4 實驗室診斷

目前，實驗室診斷方法包括病原學檢測、免疫學檢測和分子生物學檢測3種方法。

4.1 病原學檢測

通常取呼吸道樣本作染色檢查或免疫熒光染色,以顯微鏡下觀察到包囊和滋養(yǎng)體為確診的金標準。

目前常用的方法包括GMS染色、甲苯胺藍(TBO)染色和Giemsa染色、瑞氏(Wrights)染色等。GMS染色法對包囊有特異性染色效果，包囊壁染成灰黑色或深褐色，部分囊壁可見括號狀結構，但不能識別滋養(yǎng)體和囊內(nèi)小體。對比度強，菌體易于辨認，簡便快捷，應用最為廣泛。TBO染色法同樣具備操作簡便的優(yōu)點，但內(nèi)部結構不清晰，染色效果易受溫度和時間的影響，現(xiàn)今很少應用此染色法。Giemsa和Wrights法染色后囊壁不著色，可使包囊內(nèi)小體和滋養(yǎng)體著色，呈淡藍色，包內(nèi)可見4～8個深紅色子孢子，便于與其他真菌鑒別。近年來建立的熒光染色法和Calcofluor White(CFW)染色法，易于辨認包囊，操作簡便可行，適用于快速診斷。

我國實驗動物國家標準GB/T 18448.4-2001《實驗動物 卡氏肺孢子蟲檢測方法》推薦實驗動物卡氏肺孢子蟲檢測方法為，對寄生于宿主肺細胞內(nèi)(或釋放于細胞外)的菌體進行固定、Giemsa染色，顯微鏡下觀察到包囊和滋養(yǎng)體判定為陽性。

由于肺孢子菌在不同發(fā)育階段和不同生存環(huán)境下的形態(tài)也不同，染色鏡檢直接觀察到病原體，特異性強，但對檢測人員的染色技術及鏡檢水平要求較高，且受標本載菌量的影響，因此容易造成漏檢[30,31]。

4.2 免疫學檢測

酶聯(lián)免疫吸附試驗、間接免疫熒光試驗和免疫印跡試驗檢測血清特異性抗體，快速、簡便，可用于流行病學調(diào)查。另外可采用單克隆抗體直接進行免疫熒光試驗或免疫組織化學試驗，用于檢測組織中的包囊或滋養(yǎng)體，具有較高的特異性和敏感性。但由于其抗原組分復雜，各抗原多肽的抗原性強弱不同，迄今未找到理想的抗原分子，限制了血清學檢測方法的開發(fā)和應用。

4.3 分子生物學檢測

近年來，分子生物學技術已作為傳統(tǒng)檢測的補充手段，用于流行病學調(diào)查和治療監(jiān)測。自1990年Wakefield 等[32]首次采用PCR方法從患者肺泡灌洗液中檢出肺孢子菌DNA以來，PCR方法因具備特異、敏感和簡便等優(yōu)勢在Pc檢測中具有廣闊的應用前景。檢測的標本可為支氣管肺泡灌洗液、呼吸道分泌物、外周血單核細胞、血清、環(huán)境樣本等。引物設計大多為針對18S rRNA、16S rRNA、5S rRNA、二氫葉酸合成酶基因、線粒體大亞基rRNA基因、主要表面糖蛋白基因等進行設計，較常用的為線粒體大亞基rRNA基因，根據(jù)其序列設計的引物特異性和敏感性均很好[33-36]。在傳統(tǒng)PCR基礎上發(fā)展了一些新的PCR檢測方法，如毛細管PCR、巢式PCR和實時熒光定量PCR等，與常規(guī)PCR相比具備更高的靈敏度和特異性。

環(huán)介導恒溫擴增技術是一種新的核酸擴增方法，針對靶基因的6個區(qū)域設計4條特異性引物，在恒溫水浴(65 ℃左右)反應30～60 min即可完成擴增。楊秋林等[37]選取Pc mtrRNA序列作為LAMP擴增靶序列，設計引物進行擴增，顯示具有良好的特異性，敏感性比PCR更高。該方法對儀器設備要求不高，可直接通過肉眼觀察反應沉淀即可對結果作出判定，因而具有良好的應用前景和基層推廣價值。LAMP操作過程中極易出現(xiàn)氣溶膠污染，實際操作時要嚴加小心。另外，核酸分子雜交技術(包括Southern雜交、斑點雜交、Northern雜交和原位雜交等)因具備較高的敏感性和特異性，也被用作傳統(tǒng)染色法的補充手段。

近年來對肺孢子菌開展了大量種內(nèi)基因分型研究[38-42]，分型遺傳標志主要包括：核內(nèi)rRNA基因(常用的有16S rRNA、18S rRNA、5.8S rRNA、26S rRNA基因、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)基因等)、線粒體大亞基rRNA基因(mtLSUrRNA)、二氫葉酸還原酶(DHFR)基因、細胞色素B(CYB)、β-微管蛋白基因等。對于研究肺孢子菌的傳播途徑、種屬特異性、生物學特性，鑒別不同來源和種型的肺孢子菌及指導臨床合理用藥等方面發(fā)揮了重要作用。

綜上，目前尚缺乏理想的診斷技術。病原學染色法特異性強，是唯一能直接觀察到菌體的方法，但操作繁瑣、敏感性低。PCR方法敏感快捷，可作為傳統(tǒng)染色法的補充，但受引物設計、反應條件、人員操作等環(huán)節(jié)的影響，易造成假陽性。因此在規(guī)范試劑、環(huán)境以及人員操作流程的前提下，PCR方法可用于快速診斷和初步篩查。為提高檢測效率，我們認為實際工作中應結合病例的情況，選擇合適的檢測方法進行多角度綜合判定。

5 結語

肺孢子菌作為一種機會性致病因子，廣泛分布于自然界，不僅嚴重危害實驗動物健康，對公共衛(wèi)生也構成重大威脅。當前全球?qū)嶒瀯游餀C構已普遍將其納入動物質(zhì)量監(jiān)控列表。國家標準GB 14922.1-2001《實驗動物 寄生蟲學等級及監(jiān)測標準》將其列為清潔級實驗大鼠、小鼠必要時檢測項目，清潔級兔必須檢測的寄生蟲項目。該版國家標準是在1994年版GB 14922.1-1994《實驗動物微生物學和寄生蟲學等級及監(jiān)測標準》基礎上進行修訂的，將舊版標準中寄生蟲學和微生物學兩部分進行拆分，各自形成獨立的標準。但新修訂的國家標準中該項目仍歸屬于寄生蟲檢測項目，仍使用舊名“卡氏肺孢子蟲”。病原體的命名和分類歸屬重新劃分具有重要意義，筆者認為目前肺孢子菌已明確屬于真菌而非原蟲，建議將中文名稱改為“卡式肺孢子菌”更為妥當，將其從實驗動物寄生蟲學標準移至實驗動物微生物學標準中的相應位置更為科學，以免造成混亂。實驗動物國家標準作為整個行業(yè)最基本的綱領和通用要求，應尊重科學，做到與時俱進，動態(tài)發(fā)展，結合實情適時修訂完善，這對于推動整個行業(yè)的發(fā)展具有積極的引領和促進作用。