羅峰 金曉玲 李瑞雪 張哲 張方靜 胡希軍

(中南林業(yè)科技大學(xué)，長沙，410004) (湖南省環(huán)境資源植物開發(fā)與利用工程技術(shù)研究中心)

植物繁育系統(tǒng)一般指直接影響后代遺傳組成的所有有性特征，包括花部綜合特征、花各性器官壽命、開放式樣、自交親和程度和交配系統(tǒng)等，這些特征結(jié)合傳粉者和傳粉行為是影響生殖后代遺傳組成和適合度的主要因素[1]，對(duì)調(diào)節(jié)種群結(jié)構(gòu)有重大影響[2]。植物對(duì)傳粉者的傳粉適應(yīng)是被子植物花部特征進(jìn)化的根本動(dòng)力[3]，如花瓣顏色[4]、花大小[5]、花形態(tài)[6]、花結(jié)構(gòu)對(duì)稱性[7-8]等花部特征的塑造都受其傳粉昆蟲的影響。此外，植物花部特征的形成也會(huì)受一些非傳粉者因子的影響[9]。因此，研究植物繁育系統(tǒng)及傳粉適應(yīng)，是探討物種多樣性發(fā)生歷史、維持機(jī)理和保護(hù)策略的重要基礎(chǔ)[1]。

桂南木蓮(Manglietiachingi)是木蘭科(Magnoliaceae)木蓮屬(Manglietia)常綠喬木，花朵白色清香，具樹形優(yōu)美和材質(zhì)優(yōu)良等特點(diǎn)，是重要的觀賞樹種和林業(yè)用材[10]。但桂南木蓮主要分布在海拔700～1 000 m的山林中，自然種群分布零散，自然條件下結(jié)實(shí)率低[11]，嚴(yán)重制約了種群的自然繁衍和開發(fā)利用。目前，對(duì)桂南木蓮的研究主要有引種栽培[10]和種子繁育[12]，對(duì)其繁育系統(tǒng)的研究尚未開展。為探討桂南木蓮結(jié)實(shí)率低下的原因，文中對(duì)其繁育系統(tǒng)進(jìn)行研究，包括開花生物學(xué)觀察、花粉活力與柱頭可授性的測定、花粉/胚珠比值的估算以及傳粉昆蟲傳粉行為的觀察。闡明桂南木蓮開花特征的傳粉適應(yīng)機(jī)制，為桂南木蓮的資源保護(hù)和開發(fā)利用提供科學(xué)的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料是中南林業(yè)科技大學(xué)植物園中的桂南木蓮人工種群，植物園位于111°54′～114°15′E,27°51′～28°40′N，海拔100～120 m,屬于亞熱帶濕潤氣候，地帶性植物為常綠闊葉林，年均降水量1 361.6 mm。園內(nèi)植物種類豐富，有桂南木蓮常見的野外伴生樹種，如殼斗科、樟科、安息香科、金縷梅科等植物。

1.2 方法

開花生物學(xué)觀察：在2016—2017年每年4—6月份，參照Dafni[13]201-211方法選擇10株10～15年生植株進(jìn)行觀察。盛花期(全株50%以上花朵開放)時(shí)隨機(jī)標(biāo)記20朵花朵，觀察花瓣、雌蕊、雄蕊的變化過程，單花開花動(dòng)態(tài)，計(jì)算單花花期。

柱頭可授性測定：采用聯(lián)苯胺-過氧化氫法測定不同開花階段柱頭的可授性。

花粉活力測定：用TTC染色法檢測不同開花階段花粉活力；參考付玉嬪等[14]試驗(yàn)結(jié)果，采用培養(yǎng)基萌發(fā)法測定閉合階段花粉活力。分別以不同質(zhì)量濃度的蔗糖和硼酸混合溶液為培養(yǎng)基，并設(shè)清水為對(duì)照，共10組處理(表1)，在培養(yǎng)箱中25 ℃暗培養(yǎng)花粉10 h，用光學(xué)顯微鏡拍照后統(tǒng)計(jì)花粉萌發(fā)率。

表1 花粉萌發(fā)不同培養(yǎng)基組合

訪花昆蟲的觀察：選擇晴天對(duì)盛花期花朵的訪花昆蟲進(jìn)行全天候觀察。

雜交指數(shù)(OC，I)的測定：盛花期時(shí)隨機(jī)選擇閉合期的30朵花，按照Dafni[13]201-211標(biāo)準(zhǔn)測量花部特征。

花粉/胚珠比的估算：隨機(jī)選取10朵未散粉花朵，將雄蕊取下分別裝于潔凈的小瓶中，待花粉全部散出后加入10 mL蒸餾水，磁力攪拌器下振蕩30 min，取1 μL滴載玻片上，在光學(xué)顯微鏡下統(tǒng)計(jì)全部花粉數(shù)。同時(shí)將子房壁用解剖刀切開，統(tǒng)計(jì)單花胚珠數(shù)值。最后計(jì)算出P/O的值，參照Cruden[15]標(biāo)準(zhǔn)判定其繁育系統(tǒng)。

人工控制性授粉試驗(yàn)：設(shè)置5個(gè)處理，即對(duì)照，為不套袋，不去雄，自由傳粉，檢測自然條件下結(jié)實(shí)情況；去雄，為套袋，檢測是否存在無融合生殖；不去雄，為套袋，檢測是否能自花授粉；人工同株異花授粉，為檢測自交是否親和；異株異花授粉，為檢測異交是否親和。果實(shí)成熟后統(tǒng)計(jì)座果率和結(jié)籽率。座果率=(結(jié)實(shí)總數(shù)/處理個(gè)數(shù))×100%；結(jié)籽率=(果實(shí)中種子數(shù)/胚珠總數(shù))×100%。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Spss軟件進(jìn)行方差分析和Duncan多重比較，用Excel作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 開花物候及開花動(dòng)態(tài)

2.1.1 開花物候

桂南木蓮于4月上旬芽鱗開裂(圖1A)新葉生長，10～12 d后形成花蕾，隨后外苞片開裂脫落(圖1B)，18～22 d花朵開放。其群體花期從4月底持續(xù)到6月初，單株花期(31±5)d，若遇連續(xù)睛天植株迅速進(jìn)行入盛花期。

2.1.2 開花動(dòng)態(tài)

桂南木蓮單朵花期3～4 d，可分為5個(gè)階段，即松蕊階段，時(shí)間08：00—19：00，外輪花被片開裂，露出白色中輪花瓣(圖1C)；初次開放階段，時(shí)間19：00—21：00，柱頭分泌較多黏液(圖1D)；閉合階段，21：00—翌日19：00，外輪花被片舒展但內(nèi)3輪合攏，花藥開裂但雄蕊緊貼雌蕊基部，雄蕊并未對(duì)外散粉(圖1E)；再次開放階段，時(shí)間翌日19：00—21：00，內(nèi)3輪花被片再次打開，花藥開始對(duì)外散粉(圖1F)；衰敗階段，前期內(nèi)3輪花被片合攏但相互之間留有空隙，大量花粉散落在花被片底部(圖1G)，后期花藥和花被片脫落，柱頭變褐色失去活性(圖1H)。

2.2 柱頭可授性測定及雄蕊散粉情況

桂南木蓮柱頭可授性及雄蕊群散粉情況表明(表2)，5個(gè)開花時(shí)階段柱頭都有可授性。其中閉合階段柱頭可授性最強(qiáng)(圖2C)，持續(xù)時(shí)間較長，約16 h，但花朵閉合不利于昆蟲授粉；初次開放階段柱頭可授性強(qiáng)(圖2B)，但持續(xù)時(shí)間短暫，約3 h，且在傳粉昆蟲活動(dòng)少的夜晚；再次開放階段柱頭可授性較強(qiáng)(圖2D)，雄蕊對(duì)外散粉，柱頭位于雄蕊群下方，能授上自花花粉。

表2 桂南木蓮柱頭可授性及雄蕊群散粉情況

注：“++++”表示柱頭可授性最強(qiáng)；“+++”表示柱頭可授性強(qiáng)；“++”表示柱頭可授性較強(qiáng)；“+”表示柱頭可授；“-”表示柱頭不可授。

A.芽鱗開裂；B.花蕾外苞片脫落；C.松蕊階段；D.初次開放階段；E.閉合階段；F.再次開放階段；G.衰敗前期；H衰敗后期。

A.松蕊期；B.初次開放階段；C.閉合階段；D.再次開放階段；E.衰敗前期；F.衰敗后期。

2.3 花粉活力測定

由TTC染色法測定桂南木蓮花粉活力可知(表3)，桂南木蓮花粉活力隨著開花進(jìn)程逐漸增強(qiáng)，在閉合階段花藥開裂時(shí)花粉活力最高為31.34%，隨后花粉活力下降；在再次開放階段雄蕊群對(duì)外散粉時(shí)花粉活力較低，為8.85%；衰敗前期花粉活力僅為1.93%,花粉活力散失快。此外，用花粉萌發(fā)法測定閉合期花粉最高萌發(fā)率也僅為26.23%，與其他木蘭屬和含笑屬植物相比桂南木蓮花粉活力低。

表3 TTC染色法測定桂南木蓮花粉活力

注:表中花粉染色率數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.4 訪花昆蟲的觀察

通過對(duì)桂南木蓮訪花昆蟲的觀察，發(fā)現(xiàn)白天蜜蜂是主要訪花昆蟲，且主要訪問閉合階段和衰敗前階段期的花朵。蜜蜂訪花時(shí)從花瓣間隙進(jìn)入花朵(圖3A)，或從花瓣底部鉆入(圖3B)，身上沾滿花粉后再訪問其他桂南木蓮花朵時(shí)進(jìn)行授粉。極少數(shù)甲蟲類昆蟲是桂南木蓮夜間訪問者，主要訪問初次開放和再次開放的花朵，尤其再次開放花朵散出的花粉正好通過這些甲蟲的訪花活動(dòng)授到其他花朵的柱頭上，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)甲蟲啃食花瓣的現(xiàn)象(圖3C)。此外，在桂南木蓮花內(nèi)還發(fā)現(xiàn)螞蟻、薊馬等小型昆蟲，據(jù)觀察，這類昆蟲不是桂南木蓮的有效傳粉昆蟲。

A.蜜蜂從花瓣間隙飛入；B.蜜蜂從花瓣底部鉆入；C.被甲蟲啃食的花朵。

2.5 雜交指數(shù)的測定

參照Dafni[13]201-211的標(biāo)準(zhǔn)，桂南木蓮花朵直徑(6.2±1.5)cm>6 mm，記為3；花為兩性花，雌蕊先熟，記為0；雌雄蕊空間分離，且花藥高于柱頭，記為1。因此，桂南木蓮的雜交指數(shù)OC，I為4，繁育系統(tǒng)為部分自交親和,異交,需要傳粉者。

2.6 花粉/胚珠比的估算

桂南木蓮的單花平均花粉數(shù)為3 999 500±1 530，胚珠平均數(shù)為321.75±15，平均P/O=12 430±120(在2 108.0～195 525.0之間)，判定其繁育系統(tǒng)為專性異交。

2.7 套袋試驗(yàn)

桂南木蓮套袋處理結(jié)實(shí)表明(表4)，桂南木蓮自然傳粉條件下座果率和結(jié)籽率均較低，分別為15.00%和2.29%±0.13%，小核果敗育嚴(yán)重(圖4A)；去雄、套袋不結(jié)實(shí)，說明不存在無融合生殖現(xiàn)象；不去雄、套袋和同株異花授粉的結(jié)實(shí)率為0，說明自交不親和(圖4B)；桂南木蓮異株異花授粉座果率較高，為65.00%，果實(shí)發(fā)育良好(圖4C)，但結(jié)籽率僅為11.32%±1.06/%，通過解剖果實(shí)發(fā)現(xiàn)心皮內(nèi)胚珠敗育嚴(yán)重，單個(gè)心皮內(nèi)種子2～3粒。由此判斷桂南木蓮的繁育系統(tǒng)為異交型，需要傳粉媒介。

表4 桂南木蓮套袋處理結(jié)實(shí)情況

注：表中結(jié)籽率數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

A.自然傳粉，不套袋發(fā)育的果實(shí)；B.同株異花授粉不親和，雄蕊敗育；C異株異花授粉發(fā)育的果實(shí)；D.單心皮內(nèi)兩粒種子，胚珠敗育嚴(yán)重。

3 結(jié)論與討論

異交傳粉機(jī)制的多樣性是花結(jié)構(gòu)和傳粉媒介相互適應(yīng)的結(jié)果。為適應(yīng)昆蟲的傳粉，植物形成與授粉昆蟲活動(dòng)規(guī)律相協(xié)調(diào)的開花動(dòng)態(tài)。例如，高山龍膽科植物為節(jié)約能量以適應(yīng)低頻率的昆蟲訪花，形成了有規(guī)律的晝夜開放和閉合的特征及時(shí)間長的花壽命[16]?？唆斊澩跎徎ㄆ鞴俪尸F(xiàn)出有規(guī)律的開放和閉合，也是適應(yīng)其傳粉昆蟲的需要[17]。Gerhard et al.[18]觀察到巴西木蘭科植物Magnoliaovata夜晚開放、二次開合的開花特征，發(fā)現(xiàn)這與其特定授粉甲蟲在晚上活動(dòng)有關(guān)，且夜晚雌蕊特征和雄蕊特征表達(dá)時(shí)花朵所散發(fā)的香味只能吸引這種甲蟲訪花。本研究中，桂南木蓮兩次開放都是在上半夜進(jìn)行，初次開放階段柱頭可授性較強(qiáng)，雄蕊未散粉，可為異交提供無污染的柱頭，再次開放階段雄蕊群才開展散粉則為異交提供較高活力的花粉，試驗(yàn)中觀察到的甲蟲正好是花粉傳播的媒介。此外，桂南木蓮在連續(xù)天晴時(shí)迅速進(jìn)入盛花期，更是為這種傳粉機(jī)制實(shí)現(xiàn)生殖成功提供柱頭和花粉的保障。而桂南木蓮花朵下半夜閉合，從而推測其目的是，節(jié)約能量、保護(hù)雌蕊和為授在柱頭上的花粉萌發(fā)形成合適的微環(huán)境。

花朝向的花部特征也是植物與環(huán)境相適應(yīng)的結(jié)果，其中傳粉者在花朝向的形成中扮演著重要角色[9]。植物會(huì)通過花朵下垂來提高昆蟲訪花頻率，提高授粉成功率[19]，同時(shí)避免花粉因陽光直射而降低活力，延長雄性特征表達(dá)時(shí)間[20]。本研究中人工套袋試驗(yàn)結(jié)果顯示桂南木蓮存在自交不親和現(xiàn)象，結(jié)合較低的花粉活力測定結(jié)果和白天蜜蜂的訪花行為，判斷桂南木蓮花朵下垂、花被片合攏的花部特征并不是為其自交提供條件，而是為了將花粉散落在合攏的花被片上，延長雄性特征表達(dá)時(shí)間，這也是為昆蟲傳粉提供充足的花粉源。綜上所述，桂南木蓮花朵下垂、二次開合的花部特征均是對(duì)其昆蟲傳粉機(jī)制的適應(yīng)。

桂南木蓮花量大，連續(xù)晴天時(shí)進(jìn)入盛花期，在單株和群體水平上開花同步性強(qiáng)，屬于“大量、集中式開放”模式，這種模式能吸引更多的昆蟲訪花傳粉，保障植株的生殖成功。同時(shí)桂南木蓮群體花期在雨水多的季節(jié)，這種集中開放模式還能減輕惡劣天氣對(duì)其群體繁衍的不利影響。但桂南木蓮為避免自交導(dǎo)致的敗育，雄蕊特意延遲對(duì)外散粉時(shí)間，因此在單花水平上開花同步性差。另外，桂南木蓮單花雖然能產(chǎn)生大量花粉，但在柱頭可授性最強(qiáng)期間，柱頭被花被片包圍，難以接受蟲媒傳粉以外的其他途徑授粉，因此，受花粉傳遞的限制，在自然條件下植株的結(jié)實(shí)率低。

在測定其繁育系統(tǒng)時(shí)，花粉/胚珠比和套袋試驗(yàn)測定的結(jié)果與雜交指數(shù)測定的結(jié)果不一致。這可能與用雜交指數(shù)測定植物繁育系統(tǒng)時(shí)，只考慮到花的外部特征對(duì)植物生殖系統(tǒng)的影響，對(duì)授粉后花粉萌發(fā)和生長、雌雄配子結(jié)合及胚胎發(fā)育等未做考慮有關(guān)。桂南木蓮作為原始的被子植物，開花過程中花被片長期包裹雄蕊和雌蕊以及雄蕊位于雌蕊之上的花結(jié)構(gòu)，很容易發(fā)生自花授粉造成胚胎敗育。且自交譜系缺乏對(duì)新環(huán)境的適應(yīng)性和形成新物種的潛力，易引起自交衰退而導(dǎo)致物種滅絕，所以自交不能作為植物長期的生殖策略[16]。因此，在種群長期的繁衍中，桂南木蓮為避免自交衰退依舊保持原始專性異交的繁育系統(tǒng)。

此外，本文研究結(jié)果與測定大果木蓮(Manglietiagradis)繁育系統(tǒng)時(shí)的結(jié)果有所不同，這說明同一分類群(種、屬、族、科)中繁育系統(tǒng)會(huì)產(chǎn)生多樣性表達(dá)，從而推測是花部特征不同的植物(桂南木蓮花下垂合攏，大果木蓮花上舉開放)為適應(yīng)傳粉環(huán)境形成的不同適應(yīng)機(jī)制。

綜上所述，桂南木蓮的繁育系統(tǒng)是異交，昆蟲傳粉，有效傳粉昆蟲是甲蟲和蜜蜂。在自然條件下其結(jié)實(shí)率低的內(nèi)因是對(duì)外散出的花粉活力低，外因是缺少有效的傳粉昆蟲。

桂南木蓮結(jié)實(shí)率低與其專性異交的繁育系統(tǒng)密切相關(guān)?；ǚ刍盍Φ停枰獋鞣勖浇?，自然條件下種群多星散分布，這些都會(huì)影響傳粉的有效性[21]，制約桂南木蓮自然種群的繁衍更新。因此，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)其人工栽培技術(shù)的研究，通過人工栽種的手段擴(kuò)大種群數(shù)量，結(jié)合花期釋放傳粉昆蟲的方法，提高自然條件下桂南木蓮異株異花授粉的概率。此外，還應(yīng)加強(qiáng)對(duì)現(xiàn)有桂南木蓮自然種群的保護(hù)，減輕人為活動(dòng)對(duì)種群的影響，進(jìn)而達(dá)到種質(zhì)資源保護(hù)的目的。

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