位庚，梁俊清，姚兵，郭志方

心肌微血管不僅可以控制心肌微循環(huán)血流，為心肌細(xì)胞供血、供氧，而且構(gòu)成心肌微血管的單層微血管內(nèi)皮細(xì)胞還是重要的代謝和內(nèi)分泌器官，通過旁分泌和自分泌功能在心肌細(xì)胞生長發(fā)育、組織代謝、收縮功能以及節(jié)律控制方面起著重要作用[1]。已有研究表明，心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能破壞成為急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）無再流和再灌注損傷、AMI后心律失常及心力衰竭病理過程的重要機(jī)制，而且AMI后大部分患者出現(xiàn)心肌電重構(gòu)、組織重構(gòu)、神經(jīng)重構(gòu)，而導(dǎo)致心律失常的發(fā)生，同時AMI患者由于心肌細(xì)胞凋亡、炎性損傷、神經(jīng)內(nèi)分泌激活進(jìn)而發(fā)生心室重構(gòu)最終出現(xiàn)心力衰竭[2-4]。亦有研究表明，心肌細(xì)胞凋亡是發(fā)生多種重癥心血管疾病的關(guān)鍵因素[5]。因此本研究以心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷為切入點(diǎn)，觀察心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞受損對心肌細(xì)胞凋亡的影響，對闡釋心肌細(xì)胞凋亡的心肌微血管發(fā)病機(jī)制，尋找有效干預(yù)措施和藥物將具有重要意義。

1　材料與方法

實驗動物：2周齡SPF級SD雄性大鼠10只，體重（30±5）g，由北京富豪實驗動物養(yǎng)殖中心提供，許可證號：SCXK（京）2011-0012。實驗細(xì)胞：大鼠胚胎H9c2心肌細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

藥物及試劑：通心絡(luò)藥粉由石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司提供，批號S-130901。同型半胱氨酸（美國Sigma公司）；內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)套裝（美國Sciencell公司）；活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）測試盒（南京建成生物工程研究所）；JC-1線粒體膜電位分析試劑盒（美國Cayman公司）；細(xì)胞色素-C（cytochrome-C，Cyt-C）抗體、半胱氨酸天冬氨酸蛋 白 酶 -3（cysteinyl aspartate specific proteinase-3，Caspase-3）抗體、B細(xì)胞白血病/淋巴瘤2（B-cell 1 eukemia/1 ymphoma 2，Bcl-2）抗體及B細(xì)胞白血病淋巴瘤-2相關(guān)蛋白（Bcl-2-associated X protein gene，Bax）抗體（美國Cell Signaling Technology公司）。

主要儀器：多功能酶標(biāo)儀（美國BioTek公司）；FACSAriaⅢ流式細(xì)胞儀（美國BD公司）；UVP凝膠掃描系統(tǒng)（美國UVP公司）；電轉(zhuǎn)膜儀、半干轉(zhuǎn)膜儀、垂直電泳儀（美國Bio-Rad公司）；DeltaVision Elite高分辨率細(xì)胞成像系統(tǒng)（美國GE公司）。

原代大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞分離、培養(yǎng)和鑒定：參照文獻(xiàn)[6]并加以改進(jìn)提取大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞（rat cardiac microvascular endothelial cells，RCMECs），并用文獻(xiàn)[7]的方法進(jìn)行鑒定。提取的原代RCMECs經(jīng)血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子（platelet-endothelial cell adhesion molecule-1，CD31）免疫熒光鑒定顯示純度大于95%。

同型半胱氨酸誘導(dǎo)大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型的建立：取對數(shù)生長期RCMECs，胰酶消化后，調(diào)整細(xì)胞密度為1.0×105個/ml，種于6 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞生長至融合80%時，棄去舊培養(yǎng)基，更換含10 mmol/L同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）的內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

通心絡(luò)藥液配制：參照文獻(xiàn)[8]，稱取通心絡(luò)藥粉溶于內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基，超聲促溶20 min，6500 g離心10 min，收集上清液，用0.22 μm微孔濾器過濾除菌，將所得沉淀于60 ℃加熱烘干，計算實際溶于內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基藥物重量，制備成10 mg/ml通心絡(luò)貯存液，分裝后-20 ℃貯存?zhèn)溆?，實驗時稀釋至400 μg/ml。

大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)液的制備：取對數(shù)生長期RCMECs，0.25%胰蛋白酶消化后，調(diào)整細(xì)胞密度為1.0×105個/ml，接種于6 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞生長至融合80%時用于實驗。制備3種RCMECs條件培養(yǎng)液：（1）正常RCMECs條件培養(yǎng)液（normal-conditioned medium，N-CM）：棄去原培養(yǎng)基，換為內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基（endothelial cell medium，ECM）；（2）Hcy誘導(dǎo)損傷的 RCMECs條 件 培 養(yǎng) 液（homocysteine-conditioned medium，H-CM）：棄去原培養(yǎng)基，換為含10 mmol/L Hcy的內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基；（3）通心絡(luò)干預(yù)的RCMECs條件培養(yǎng)液（Tongxinluo-conditioned medium，T-CM）：棄去原培養(yǎng)基，換為含400 μg/ml通心絡(luò)的內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基預(yù)孵育4 h后，最后換為含10 mmol/L Hcy和400 μg/ml通心絡(luò)的內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基。各組細(xì)胞置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，棄去上清液，用無血清細(xì)胞培養(yǎng)基（DMEM）清洗兩次，再加入DMEM，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6 h，收集各組細(xì)胞上清液，離心取上清，獲得各組微血管內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)液。

H9c2心肌細(xì)胞分組及處理：取對數(shù)生長期H9c2心肌細(xì)胞，胰酶消化后，調(diào)整細(xì)胞密度為1.0×105個/ml，接種于6 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿/96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞生長至融合80%時用于實驗。將H9c2心肌細(xì)胞分為4組（每組設(shè)平行復(fù)孔3～4個）：（1）正常對照組：棄去原培養(yǎng)基，換為DMEM；（2）N-CM組：棄去原培養(yǎng)基，換為正常RCMECs條件培養(yǎng)液；（3）H-CM組：棄去原培養(yǎng)基，換為Hcy誘導(dǎo)損傷的RCMECs條件培養(yǎng)液；（4）T-CM組：棄去原培養(yǎng)基，換為通心絡(luò)干預(yù)的RCMECs條件培養(yǎng)液。

采用JC-1試劑測定心肌細(xì)胞中線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）[9]：接種于96孔板的H9c2心肌細(xì)胞按上述H9c2細(xì)胞分組所示處理結(jié)束后，4組細(xì)胞置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，實驗操作步驟嚴(yán)格按JC-1試劑說明書進(jìn)行檢測。

流式細(xì)胞儀檢測心肌細(xì)胞活性氧簇水平[7]：接種于6 cm細(xì)胞皿培養(yǎng)的H9c2心肌細(xì)胞按上述H9c2細(xì)胞分組所示處理結(jié)束后，4組細(xì)胞置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后棄取上清，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）（7.9 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na2HPO4和 1.8 g K2HPO4溶于 800 ml 蒸餾水中，用HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4，最后加蒸餾水定容至1 L）清洗細(xì)胞兩次，加入含2',7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽（2,7-Dichlorodi -hydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）（1:10000）的ECM，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育30 min，0.25%的胰酶消化2 min，加入ECM使細(xì)胞終止消化，輕輕吹打制成細(xì)胞懸液，移入1.5 ml無菌EP管中800 g離心5 min后棄上清收集細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞2次后，移至流式管中，流式細(xì)胞儀檢測。

活細(xì)胞成像系統(tǒng)動態(tài)觀察心肌細(xì)胞凋亡過程[10]：取對數(shù)生長期的H9c2心肌細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，以Countess自動細(xì)胞計數(shù)儀計數(shù)后，調(diào)整細(xì)胞密度至1×105個/ml，用高糖型DMEM培養(yǎng)，接種于96孔玻璃底黑色細(xì)胞培養(yǎng)板中（100 μl/孔），待細(xì)胞貼壁并達(dá)到融合80%時，棄去舊培養(yǎng)基。每孔加入 Hoechst 33342染液 300 μl，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中避光孵育20 min，棄去染液，用高糖型DMEM清洗細(xì)胞2～3次，細(xì)胞按上述H9c2心肌細(xì)胞分組所示處理并加入高糖型DMEM或RCMECs條件培養(yǎng)液，將96孔玻璃底黑板置于活細(xì)胞成像系統(tǒng)的37℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)罩內(nèi)，調(diào)整鏡頭到目標(biāo)拍攝孔處，40倍物鏡進(jìn)行拍攝。以5%光強(qiáng)度，曝光時間0.025 s的4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)（381～399 nm），通道調(diào)整焦距，依據(jù)細(xì)胞厚度調(diào)整Z軸步徑，以10 min為時間間隔，EM CCD相機(jī)連續(xù)拍攝15 h。采集各時間點(diǎn)照片利用Softworx軟件進(jìn)行圖像處理。

采 用 Western Blot法 檢 測 Cyt-C、Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)：接種于6 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿的H9c2心肌細(xì)胞按上述H9c2細(xì)胞分組所示處理結(jié)束后，4組細(xì)胞置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后吸凈上清，加入40 μl細(xì)胞裂解液于冰上充分裂解20 min，超聲破碎后4℃，6500 g離心20 min，收集上清取2 μl進(jìn)行蛋白定量后，取等量蛋白樣品進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干轉(zhuǎn)膜后封閉，與一抗結(jié)合，4℃過夜后洗膜，與二抗結(jié)合，洗膜后用化學(xué)發(fā)光法檢測，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內(nèi)參，以各目的蛋白吸光度值與GAPDH吸光度值的比值進(jìn)行統(tǒng)計分析。

統(tǒng)計學(xué)處理：采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)以±s表示。組間比較用單因素方差分析，方差齊時采用最小顯著差法（LSD），若方差不齊采用Dunnett's T3法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1　各組H9c2心肌細(xì)胞線粒體膜電位比較（表1）

與正常對照組比較，N-CM組細(xì)胞MMP無明顯變化（P＞0.05）；與N-CM組比較，H-CM組細(xì)胞MMP明顯降低（P＜0.01）；與H-CM組比較，T-CM組細(xì)胞MMP升高（P＜0.01）。

表1　各組H9c2心肌細(xì)胞線粒體膜電位及活性氧簇水平比較（±s）

表1　各組H9c2心肌細(xì)胞線粒體膜電位及活性氧簇水平比較（±s）

注: N-CM：正常微血管內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)液；H-CM：同型半胱氨酸誘導(dǎo)損傷的微血管內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)液；T-CM：通心絡(luò)干預(yù)的微血管內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)液。活性氧簇表示P2門內(nèi)樣本比例，間接代表熒光強(qiáng)度。與N-CM組比較 *P＜0.01，與 H-CM 組比較 △P＜0.05 △△P＜0.01

正常對照組　3　4.36±0.34　42.17±5.21 H-CM組　3　2.5±0.28*　80.00±4.66*

2.2　各組H9c2心肌細(xì)胞活性氧簇水平比較（表1、圖1）

與正常對照組比較，N-CM組細(xì)胞ROS水平無明顯差異（P＞0.05）；與N-CM組比較，H-CM組細(xì)胞ROS水平增加（P＜0.01）；與H-CM組比較，T-CM組細(xì)胞ROS水平降低（P＜0.05）。

圖1　各組H9c2ｓ心肌細(xì)胞活性氧簇水平比較（n=3, ±s）

2.3　活細(xì)胞成像系統(tǒng)動態(tài)觀察各組H9c2心肌細(xì)胞凋亡變化（圖2）

活細(xì)胞成像系統(tǒng)動態(tài)觀察15 h，發(fā)現(xiàn)正常對照組細(xì)胞存活狀態(tài)良好，細(xì)胞核圓潤無皺縮，邊緣清晰，熒光強(qiáng)度均一，部分細(xì)胞出現(xiàn)分裂增殖現(xiàn)象，極少數(shù)細(xì)胞凋亡（藍(lán)色為細(xì)胞核）；與正常對照組比較，N-CM組細(xì)胞狀態(tài)無明顯差異，部分細(xì)胞分裂增殖，極少數(shù)細(xì)胞凋亡；與N-CM組比較，H-CM組細(xì)胞5 h內(nèi)有極少數(shù)細(xì)胞分裂增殖，5 h開始出現(xiàn)細(xì)胞凋亡，5 h至15 h過程中部分細(xì)胞核皺縮、濃染，細(xì)胞核體積變小，核碎裂，細(xì)胞凋亡明顯，連續(xù)觀察至15 h細(xì)胞數(shù)量也明顯減少；與H-CM組比較，T-CM組細(xì)胞5 h未出現(xiàn)明顯的凋亡，有少數(shù)細(xì)胞分裂增殖，細(xì)胞狀態(tài)良好，5 h至15 h過程中有部分細(xì)胞核皺縮、碎裂，細(xì)胞凋亡，但凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯減少。

圖2　活細(xì)胞成像系統(tǒng)動態(tài)觀察各組H9c2心肌細(xì)胞凋亡情況（×400）

2.4　各組H9c2心肌細(xì)胞Cyt-C、Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)比較（圖3）

與正常對照組比較，N-CM組細(xì)胞Cyt-C蛋白表達(dá)無明顯變化（P＞0.05）；與N-CM組比較，H-CM組細(xì)胞Cyt-C蛋白表達(dá)上調(diào)（P＜0.01）；與H-CM組比較，T-CM組細(xì)胞Cyt-C蛋白表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.05）。與正常對照組比較，N-CM組細(xì)胞Caspase-3、Bax及Bcl-2蛋白表達(dá)無明顯變化（P＞0.05）；與N-CM組比較，H-CM組細(xì)胞Caspase-3和Bax蛋白表達(dá)上調(diào)（P＜0.01），Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)（P＜0.01）；與H-CM組比較，T-CM組細(xì)胞Caspase-3和Bax蛋白表達(dá)下調(diào)（P＜0.05，P＜0.01），Bcl-2蛋白表達(dá)上調(diào)（P＜0.01）。

注: N-CM：正常微血管內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)液；H-CM：同型半胱氨酸誘導(dǎo)損傷的微血管內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)液；T-CM：通心絡(luò)干預(yù)的微血管內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)液。Cyt-C: 細(xì)胞色素-C; Caspase-3: 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3;Bax: B細(xì)胞白血病淋巴瘤-2相關(guān)蛋白; Bcl-2: B細(xì)胞白血病/淋巴瘤2;GAPDH: 甘油醛-3-磷酸脫氫酶。與N-CM組比較*P＜0.01; 與H-CM組比較 △P＜0.05 △△P＜0.01

3　討論

采用活細(xì)胞成像系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)胞和基因的功能研究，是生物醫(yī)學(xué)研究的最新趨勢。固定細(xì)胞觀察僅能提供固定瞬間細(xì)胞的靜態(tài)信息，活細(xì)胞成像系統(tǒng)可連續(xù)、全面、動態(tài)觀察顯微鏡下活細(xì)胞的正常生理活動過程。本研究采用活細(xì)胞成像系統(tǒng)動態(tài)觀察H9c2心肌細(xì)胞凋亡過程，結(jié)果顯示，正常對照組和N-CM組細(xì)胞僅少量細(xì)胞凋亡，而H-CM組細(xì)胞5 h即出現(xiàn)凋亡，5～15 h小時過程中細(xì)胞凋亡明顯；T-CM組細(xì)胞5 h未出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡，5～15 h雖有細(xì)胞凋亡，但較H-CM組明顯減少。說明通心絡(luò)干預(yù)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞后，可有效抑制心肌細(xì)胞的凋亡。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞為了維持自身內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)而由凋亡調(diào)控蛋白控制的細(xì)胞程序性死亡。這些調(diào)控蛋白分為兩類，即促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白，這兩類蛋白之間的平衡喪失可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Bcl-2是抗凋亡調(diào)控蛋白之一[11]，在凋亡信號刺激下起到關(guān)鍵的抗凋亡作用[12]。Bax是促凋亡調(diào)控蛋白之一，正常生理情況下以非激活的單體形式存在于細(xì)胞漿中，各類刺激信號的誘導(dǎo)下，Bax發(fā)生構(gòu)象變化而聚集到線粒體上，這是線粒體凋亡途徑中的關(guān)鍵事件。半胱天冬酶（Caspases）是哺乳動物細(xì)胞中凋亡的啟動者和執(zhí)行者，在細(xì)胞內(nèi)通常以無活性的酶原形式存在，其中Caspase-3是Caspases級聯(lián)反應(yīng)下游最關(guān)鍵的促凋亡蛋白。Bcl-2是通過抑制Cyt-C的釋放進(jìn)而阻斷其上游Caspase蛋白酶活化，可抑制細(xì)胞的凋亡[13]。Bax為線粒體膜上離子通道的組成蛋白，使Cyt-C得以穿過線粒體膜，通過激活Caspase-9，進(jìn)一步激活Caspase-3，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[14]。本研究中H-CM組較N-CM組細(xì)胞Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，說明受損的RCMECs上清液引起了H9c2心肌細(xì)胞的凋亡；T-CM組較H-CM組細(xì)胞Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，說明通心絡(luò)干預(yù)的RCMECs可有效抑制心肌細(xì)胞的凋亡。機(jī)體內(nèi)存在外源性凋亡和內(nèi)源性凋亡兩種途徑，后者則主要指線粒體凋亡途徑，又稱為“經(jīng)典途徑”[15]，是細(xì)胞凋亡的主要途徑之一，其中Bcl-2家族蛋白是關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-2家族能調(diào)節(jié)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）的開放[16]，mPTP大量開放是引起細(xì)胞凋亡的始動因素[17]。本研究MMP、Cyt-C的結(jié)果顯示，H-CM組心肌細(xì)胞MMP下降，Cyt-C釋放增加；通心絡(luò)干預(yù)的RCMECs條件培養(yǎng)液抑制了線粒體的膜電位降低和Cyt-C釋放，說明通心絡(luò)改善內(nèi)皮細(xì)胞分泌功能后可有效逆轉(zhuǎn)線粒體的損傷狀態(tài)。ROS是氧化還原反應(yīng)的產(chǎn)物，線粒體不僅是ROS產(chǎn)生的主要位點(diǎn)更是ROS損傷的主要靶點(diǎn)。H-CM組心肌細(xì)胞中ROS生成增加，而T-CM組較H-CM組細(xì)胞ROS生成減少。因此可以推測通心絡(luò)干預(yù)的心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞通過改善其分泌功能，使心肌細(xì)胞ROS生成減少，進(jìn)而保護(hù)線粒體功能。所以本研究綜合線粒體功能檢測結(jié)果，可得出H-CM組細(xì)胞線粒體損傷，氧化應(yīng)激的產(chǎn)生、Cyt-C、凋亡相關(guān)因子等的釋放，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡；T-CM組中細(xì)胞氧化應(yīng)激減輕，線粒體功能和凋亡相關(guān)蛋白均有明顯改善，說明通心絡(luò)干預(yù)的RCMECs上清液通過保護(hù)線粒體、減少氧化應(yīng)激抑制了H9c2心肌細(xì)胞的凋亡。然而本實驗也存在一定的局限性，在收取RCMECs條件培養(yǎng)液之前雖然用DMEM清洗細(xì)胞兩次，然后再加入DMEM置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6 h，收集各組細(xì)胞上清液，離心取上清，獲得四種RCMECs條件培養(yǎng)液，但仍不能排除條件培養(yǎng)液中殘存少量同型半胱氨酸或通心絡(luò)對心肌細(xì)胞凋亡或保護(hù)的直接作用，所以在后續(xù)的實驗中力爭排除此干擾因素，得到更精準(zhǔn)的實驗數(shù)據(jù)。

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