金 晶，謝順萍，姬厚偉，鄒西梅，張 麗，劉 劍*

微生物揮發(fā)性有機(jī)化合物（microbial volatile organic compounds，MVOCs）是細(xì)菌和真菌在生長繁殖過程中產(chǎn)生的初級或次級代謝揮發(fā)性化合物。已有大約1 000 種MVOCs被鑒定，其中包括醇、醛、烴、酸、醚、酯、酮、萜類化合物，以及硫、氮化合物等[1]。有不少研究者將MVOCs用于生物技術(shù)中，如生物勘探、生物能源、昆蟲信息素、抑菌素等[2-5]；或利用MVOCs進(jìn)行醫(yī)療診斷[6-7]、空氣質(zhì)量監(jiān)測[8-9]；MVOCs還可用于篩選微生物菌株，利用發(fā)酵產(chǎn)香開發(fā)新型添加劑及植物內(nèi)生菌香料[10-17]。

農(nóng)產(chǎn)品在加工、運(yùn)輸、貯藏中的任何一個環(huán)節(jié)都伴隨著微生物的活動，近年來，MVOCs在農(nóng)產(chǎn)品中的應(yīng)用研究已成為熱點(diǎn)，有大量的文獻(xiàn)報道。本文針對農(nóng)產(chǎn)品中MVOCs的捕集、儀器檢測、數(shù)據(jù)分析方法進(jìn)行簡介，并著重對MVOCs在農(nóng)產(chǎn)品微生物污染檢測、發(fā)酵食品品質(zhì)監(jiān)控、微生物資源開發(fā)利用等方面的應(yīng)用情況作一綜述。

1 MVOCs的分析方法

1.1 MVOCs的捕集

對MVOCs的檢測，前處理尤為重要，即MVOCs的捕集。由于待測組分含量較小，甚至低至ng/g級別[18]，通常需要富集濃縮。文獻(xiàn)中報道的方法有溶劑萃取[13]、同時蒸餾萃?。╯imultaneous distillation extraction，SDE）[10-12]以及包括靜態(tài)頂空[19]、動態(tài)頂空（即吹掃捕集）[20-22]和固相微萃?。╯olid phase microextraction，SPME）在內(nèi)的頂空技術(shù)[23-25]等。溶劑萃取和SDE的不足之處在于溶劑用量大、耗時長，且樣品在萃取、過濾和濃縮過程中會損失部分低沸點(diǎn)化合物。而頂空技術(shù)是將液體或固體分析物放入密閉樣品容器，達(dá)到平衡后從頂部空間抽取氣態(tài)或蒸氣樣品，并與氣相色譜（gas chromatography，GC）結(jié)合的分析技術(shù)，其優(yōu)點(diǎn)是無需有機(jī)溶劑，采用氣體直接進(jìn)樣方式，減少非揮發(fā)性成分和復(fù)雜基質(zhì)對待測成分的影響和干擾。頂空技術(shù)中的SPME可根據(jù)樣品中待測組分的極性選擇不同涂層的萃取纖維頭，達(dá)到不同富集效果，集采樣、萃取、濃縮于一體，簡單快速，是近年來MVOCs分析最常用的樣品處理技術(shù)之一。Krajnik[26]、操慶國[27]等在研究中對比了不同纖維頭對相同樣品的不同萃取效果，結(jié)果顯示：雙極性纖維頭如二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/dimethylsiloxan，DVB/CAR/PDMS）和CAR/PDMS纖維頭萃取得到的揮發(fā)性物質(zhì)最多；對于醇類、揮發(fā)性強(qiáng)的硫化物CAR/PDMS的捕集效果最好；對于游離氨基酸推薦使用CAR/PDMS或聚丙烯酸酯極性纖維頭。

1.2 MVOCs的儀器檢測

MVOCs的儀器檢測方法包括GC-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-mass spectrometry，GC-MS）[22-25]、GC-火焰離子檢測法（GC-flame ionization detector，GC-FID）[28-29]、質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)質(zhì)譜法（proton transfer reaction-mass spectrometry，PTR-MS）[30-31]、離子遷移譜（ion mobility spectrometry，IMS）[32-36]和電子鼻技術(shù)[37-39]。其中GC-MS根據(jù)質(zhì)量分析器不同，可分為GC-四極桿質(zhì)譜、GC-飛行時間質(zhì)譜以及GC-離子肼質(zhì)譜等。GC-MS因其具有對已知物進(jìn)行準(zhǔn)確定量、對未知物進(jìn)行初步定性的能力，是MVOCs檢測中最常用的分析儀器[2,7]。然而GC-MS法和其他基于GC的檢測法一樣，樣品需要進(jìn)行前處理，要實現(xiàn)在線監(jiān)測存在一定難度。PTR-MS和IMS是直接質(zhì)譜技術(shù)，可實現(xiàn)痕量（ng/g到pg/g級別）MVOCs的在線檢測[2,6-7]。電子鼻是一組化學(xué)傳感器陣列，也可實現(xiàn)在線檢測，并具有便攜且成本低的優(yōu)勢。

1.3 數(shù)據(jù)處理方法

MVOCs種類多，濃度變化大，其影響因素包括微生物種屬、生長基質(zhì)、環(huán)境條件等，隨著微生物生長的不同時間階段，MVOCs也在不斷變化[40-41]；因此檢測數(shù)據(jù)通常需要結(jié)合化學(xué)計量學(xué)手段，將復(fù)雜的檢測結(jié)果轉(zhuǎn)化為有用信息。MVOCs研究中常用的化學(xué)計量學(xué)方法是模式識別技術(shù)，包括無監(jiān)督學(xué)習(xí)方法和有監(jiān)督學(xué)習(xí)方法。無監(jiān)督學(xué)習(xí)法主要是利用原始數(shù)據(jù)信息或經(jīng)預(yù)處理后的信息對樣品進(jìn)行分類。主成分分析（principal components analysis，PCA）是MVOCs研究中最常用的無監(jiān)督學(xué)習(xí)方法，它為分散的數(shù)據(jù)信息找到更能描述這組數(shù)據(jù)的正交坐標(biāo)軸，將數(shù)據(jù)降維簡化。PCA得分圖可直觀表示樣本的分類信息，載荷圖顯示對分類有貢獻(xiàn)的變量及其貢獻(xiàn)大小。無監(jiān)督學(xué)習(xí)法還有層次聚類分析等。有監(jiān)督學(xué)習(xí)法是建立已知樣本模型，利用該模型對未知樣本進(jìn)行預(yù)測。常用的有監(jiān)督學(xué)習(xí)法包括判別分析、線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）、偏最小二乘回歸等。

2 MVOCs在農(nóng)產(chǎn)品中的應(yīng)用

2.1 作為農(nóng)產(chǎn)品微生物污染及貨架期預(yù)測的標(biāo)志物

農(nóng)產(chǎn)品如肉、蛋、奶和水產(chǎn)品，富含微生物生長所需要的營養(yǎng)物，在生產(chǎn)配送過程中非常容易受到細(xì)菌的侵染，導(dǎo)致產(chǎn)品在短時間內(nèi)發(fā)生氣味、顏色、質(zhì)地的變化，最終腐敗變質(zhì)[42]。即使水分含量較小的農(nóng)產(chǎn)品如谷物、煙草等也容易被霉菌所侵染，對人畜健康安全帶來威脅。為了對各種農(nóng)產(chǎn)品的新鮮度進(jìn)行評估，預(yù)測產(chǎn)品保質(zhì)期，國內(nèi)外學(xué)者力求找到便捷準(zhǔn)確的途徑，已有不少研究嘗試用MVOCs作為標(biāo)志物，判斷農(nóng)產(chǎn)品受微生物感染的程度[43-44]。以下對肉、蛋、奶、土豆、糧食等不同農(nóng)產(chǎn)品加以論述。

肉類腐敗過程中，因微生物的初級和次級代謝作用產(chǎn)生揮發(fā)性化合物，發(fā)出不良?xì)馕禰26]。顧賽麒等[41]研究不同新鮮度冷卻豬肉，發(fā)現(xiàn)豬肉在冷藏過程中微生物生長合成蛋白酶、脂肪酶，將肉中的蛋白質(zhì)、脂肪和碳水化合物分解成胺、吲哚、硫醇、硫化氫、糞臭素、脂肪酸、有機(jī)酸以及醛、酮等揮發(fā)性化合物。其研究采用PCA對SPME-GC-MS檢測結(jié)果進(jìn)行分析，獲得16 種表征冷藏肉腐敗的特征揮發(fā)物，為開發(fā)快速檢測豬肉新鮮度的方法提供了理論依據(jù)。胡惠平等[45]利用電子鼻和SPME-GC-MS技術(shù)，對3 株從豬肉中分離得到的假單胞菌在胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基上培養(yǎng)產(chǎn)生的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物進(jìn)行檢測分析，運(yùn)用PCA和判別因子法對檢測結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果表明，3 種假單胞菌能夠被完全區(qū)分。Krajnik等[26]采用頂空-SPME-GC/MS技術(shù)研究了21 ℃有氧條件下雞胸肉所產(chǎn)生的MVOCs隨時間的變化，該方法通過對比不同極性的SPME針頭對檢測結(jié)果的影響，選擇通用且穩(wěn)定性高的100 μm聚二甲基硅氧烷涂層針頭。PCA分析結(jié)果表明：乙醇和3-甲基-1-丁醇可以作為常溫有氧環(huán)境雞肉腐敗SPME快速檢測的化學(xué)標(biāo)志物；乙酸為腐敗初級階段標(biāo)志物；甲硫醇、二甲基二硫、二甲基三硫為腐敗第二階段標(biāo)志物。為了預(yù)測三文魚的貨架期，Krajnik等[46]對不同溫度和貯存時間的三文魚樣品進(jìn)行了微生物平板記數(shù)和顏色、氣味、質(zhì)地感官分析，用SPME-GC-MS分析MOVCs。初步定性識別出28 種揮發(fā)性化合物，包括醇類、醛類、脂類、胺類、游離脂肪酸和烴類等。通過層次聚類分析和皮爾遜相關(guān)系數(shù)的演算，并結(jié)合微生物實驗和感官評價結(jié)果，選取三甲胺、乙醇、3-甲基-1-丁醇、乙偶姻、乙酸、2,3-丁二醇進(jìn)行進(jìn)一步定量研究。運(yùn)用偏最小二乘回歸分析法揭示了假單胞菌、乳酸菌、嗜冷菌、大腸桿菌、熱死環(huán)絲菌、酵母、霉菌與MVOCs的關(guān)系，最終確定三甲胺、乙醇、3-甲基-1-丁醇，乙偶姻、乙酸與決定三文魚貨架期的腐敗菌生長緊密相關(guān)，可以作為食品腐敗的化學(xué)指標(biāo)。在以上報道中，研究者們初步確定了肉類腐敗過程的特征揮發(fā)性化合物，將來的研究可以對單一菌種的MVOCs進(jìn)行檢測，深入揭示肉制品中MVOCs的產(chǎn)生機(jī)理，并且建立更多細(xì)菌的氣味指紋特征圖譜庫，為微生物氣味指紋技術(shù)檢測提供依據(jù)。

雞蛋上沾染的細(xì)菌、霉菌通過雞蛋殼的微孔侵入雞蛋，對消費(fèi)者的健康帶來潛在威脅，同時微生物代謝產(chǎn)生的揮發(fā)性有機(jī)化合物則經(jīng)過蛋殼微孔散發(fā)出來。Cumeras等[47]采用頂空-SPME-GC/MS技術(shù)，對在潮濕環(huán)境冷藏40 d的雞蛋進(jìn)行MVOCs分析，同時分離培養(yǎng)從樣品蛋殼的內(nèi)壁上取得的菌株，分析其MVOCs。檢測結(jié)果顯示，被真菌感染的雞蛋特有的MVOCs色譜峰有17 個，通過標(biāo)準(zhǔn)圖庫定性鑒定出5 種化合物：三氯甲烷（氯仿）、甲硫醇、二甲基亞砜、乙酸己酯和瓦倫烯，其中三氯甲烷也出現(xiàn)在分離培養(yǎng)的真菌MVOCs檢測結(jié)果中；因此，可以排除三氯甲烷作為一種普遍使用的溶劑所帶來的干擾，三氯甲烷可以作為一種真菌感染較為簡便有效的生物標(biāo)志物。

乳制品生產(chǎn)企業(yè)通常將巴氏滅菌牛奶細(xì)菌菌落數(shù)達(dá)到107CFU/mL作為巴氏滅菌奶的貨架期期限，而消費(fèi)者對牛奶的接受與否則往往取決于牛奶是否有異味。Silcock等[20]研究巴氏滅菌奶冷藏過程中MVOCs的變化，取不同脂含量的牛奶作為樣品，將加入抑菌劑的牛奶和無抑菌劑的牛奶進(jìn)行對比，采用PRT-MS在線連續(xù)檢測，GC-MS輔助定性，監(jiān)測到隨貯藏時間的推移，牛奶MVOCs與細(xì)菌總數(shù)呈動態(tài)變化關(guān)系。通過U-Mann-Whitney檢驗和Kruskal-Wallis檢驗，結(jié)果表明不僅總的MVOCs濃度與細(xì)菌數(shù)不是簡單的線性關(guān)系，不同的揮發(fā)性化合物變化趨勢也呈現(xiàn)一定的差異。比如當(dāng)細(xì)菌數(shù)在106～107CFU/mL時，質(zhì)荷比為41的代表醇類碎片的信號峰強(qiáng)度開始增加，而質(zhì)荷比為59的丙酮信號峰強(qiáng)度開始下降。只有當(dāng)細(xì)菌總數(shù)達(dá)到一定的閾值時，MVOCs總濃度才有明顯變化。這說明當(dāng)牛奶中細(xì)菌數(shù)達(dá)到106～107CFU/mL時，消費(fèi)者僅憑嗅覺并不能鑒別牛奶的異味，然而在此基礎(chǔ)上的很短時間內(nèi)，牛奶就有可能產(chǎn)生異味被消費(fèi)者感知。運(yùn)用PTR-MS對巴氏滅菌奶MVOCs在線分析，初步揭示了微生物生長與通過MVOCs濃度判斷貨架期之間的關(guān)聯(lián)。

馬鈴薯在貯藏中如果受到果膠桿菌的侵蝕會發(fā)生軟腐病變，開發(fā)一種可靠的無損檢測方法對發(fā)生軟腐病的馬鈴薯進(jìn)行鑒別尤為重要。Rutolo等[35]通過人工接種果膠桿菌取得病變馬鈴薯樣品，使用場不對稱IMS（field asymmetric IMS，F(xiàn)AIMS）探測病變馬鈴薯。檢測的數(shù)據(jù)結(jié)果運(yùn)用PCA進(jìn)行降維特征提取，K均值聚類進(jìn)行分析處理，并基于LDA建立了分類模型。在實驗室條件下采用上述分析和數(shù)據(jù)處理方法，當(dāng)人的嗅覺和視覺還不能分辨時，即可將感染果膠桿菌的馬鈴薯和對照樣品區(qū)分開，準(zhǔn)確度達(dá)到90%以上。

煙草作為一種特殊的農(nóng)產(chǎn)品，霉變一直是影響其品質(zhì)的主要因素。關(guān)于煙草霉變的MVOCs檢測，菲莫公司2004年曾報道采用動態(tài)頂空-GC-MS法對煙草中分離出的4 種霉菌（華麗曲霉、匍枝根霉、黑曲霉和黃青霉）揮發(fā)性代謝物進(jìn)行分析研究[22]。分別將4 種霉菌在卷煙和PDA培養(yǎng)基上接種培養(yǎng)，結(jié)果檢測到12 種MVOCs，其中1-辛酮和2-戊酮僅在卷煙樣品中檢測到，1-辛烯-3-醇、2-甲基-1-丁醇在卷煙樣品和PDA培養(yǎng)基樣品上都能夠檢測到，并且1-辛烯-3-醇在4 種霉菌樣品中均有檢出，故認(rèn)為1-辛烯-3-醇有可能作為煙草霉變檢測的標(biāo)志物。經(jīng)實驗得出，GC-飛行時間質(zhì)譜對1-辛烯-3-醇的檢出限是20 ng/mL，GC-MS在選擇離子掃描和全掃描模式下對1-辛烯-3-醇檢出限分別為200 ng/mL和2 μg/mL，都遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于1-辛烯-3-醇的嗅覺閾值（200 μg/mL）。隨著IMS技術(shù)在食品工業(yè)中的推廣應(yīng)用，周沅楨等[36]研究開發(fā)了芯片級FAIMS快速識別霉變煙草的方法：采用熱脫附GC-MS法篩選出1-戊醇和吡啶作為煙草霉變標(biāo)志物，創(chuàng)建不同霉變程度煙草的FAIMS譜圖；并結(jié)合FAIMS不同電場強(qiáng)度下物質(zhì)的特征峰響應(yīng)信號的差異，創(chuàng)建了識別不同物質(zhì)的方法和識別軟件。對203 個煙草樣品霉變情況進(jìn)行識別，識別結(jié)果與煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)測試進(jìn)行對比驗證，正確率在90%以上，且該方法相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于等于5%，重復(fù)性良好。毛雪峰等[38]2010年報道了電子鼻技術(shù)對煙葉霉變提前預(yù)警的設(shè)計，其在倉貯煙包中放入傳感器陣列，監(jiān)測煙包內(nèi)的溫濕度及各種氣體信息，以便隨時了解煙葉的貯存狀態(tài)。

谷物易受鐮刀菌的感染，產(chǎn)生具有免疫毒性和溶血反應(yīng)的嘔吐毒素。Lippolis等[37]運(yùn)用人工嗅覺系統(tǒng)，即12 組氧化金屬半導(dǎo)體陣列，對105 個鐮刀菌自然污染的硬質(zhì)小麥樣品進(jìn)行檢測，結(jié)合液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)對嘔吐毒素的分析結(jié)果，將樣品按嘔吐毒素含量低、中、高分成A、B、C 3 組，用判別分析法處理人工嗅覺系統(tǒng)數(shù)據(jù)，提供了按照歐盟法規(guī)對樣品進(jìn)行快速篩查的方法（歐盟標(biāo)準(zhǔn)EC 1126/2007規(guī)定未加工的谷物的嘔吐毒素限量為1 750 μg/mg）。該研究同時采用SPME-GC-MS檢測到70 種揮發(fā)性化合物，其中長葉烯、3-甲基丁醛、正十三烷、γ-己內(nèi)酯、6,10,14-三甲基-2-十五烷酮峰面積與嘔吐毒素含量成正相關(guān)，而十六烷、2,3,7-三甲基-癸烷和4,6-二甲基-十二烷峰面積與嘔吐毒素含量成負(fù)相關(guān)。

黃曲霉毒素對人、動物和植物都有害，已被世界衛(wèi)生組織界定為1類致癌物。為了對產(chǎn)生黃曲霉毒素的黃曲霉菌株進(jìn)行識別（不是每一種黃曲霉菌株都產(chǎn)生毒素），Sun Dongdi等[48]采用SPME-GC-MS法對2 株黃曲霉菌株在玉米基質(zhì)上生長代謝產(chǎn)生的揮發(fā)性氣體進(jìn)行30多天連續(xù)監(jiān)測，定性鑒別出52 種揮發(fā)性有機(jī)物。實驗結(jié)果表明，MVOCs的生成不僅取決于不同菌株，還受菌株生長周期、生長條件的影響，單靠某一種MVOC并不能作為菌種識別的標(biāo)志物，但運(yùn)用判別分析法處理MVOCs檢測結(jié)果，去掉與分類相關(guān)度小的變量，建立2 個判別函數(shù)，可以將產(chǎn)毒素菌株和不產(chǎn)毒素菌株以及玉米空白對照樣品區(qū)分開。實驗表明：采用SPME-GC-MS對MVOCs檢測結(jié)果進(jìn)行判別分析的方法可以作為識別不同菌株的有效手段；若擴(kuò)大菌株樣本量，運(yùn)用該方法還可以建立一個真菌篩選數(shù)據(jù)庫。

根據(jù)上述文獻(xiàn)報道，MVOCs的分析檢測是農(nóng)產(chǎn)品微生物污染情況、貨架期評價的新方法。MVOCs的儀器檢測比人工感官評價更加穩(wěn)定、客觀，比微生物菌落數(shù)檢測法省時便捷。報道中，部分研究已找出評價農(nóng)產(chǎn)品新鮮度的標(biāo)志揮發(fā)性化合物，有的甚至建立了判斷農(nóng)產(chǎn)品腐敗、霉變的方法，準(zhǔn)確率在90%以上。但也有部分研究是將微生物從農(nóng)產(chǎn)品中分離出來，在培養(yǎng)基上生長，檢測其MVOCs，這樣的方法雖然將微生物放在穩(wěn)定可控的環(huán)境中培養(yǎng)，卻與農(nóng)產(chǎn)品實際貯藏運(yùn)輸?shù)沫h(huán)境相去甚遠(yuǎn)，其研究結(jié)果要用于實際生產(chǎn)還有待進(jìn)一步驗證完善。

2.2 評價、監(jiān)控發(fā)酵食品風(fēng)味品質(zhì)

發(fā)酵食品的加工是人們利用有益微生物在農(nóng)產(chǎn)品基質(zhì)中生長從而得到比原料風(fēng)味更加豐富、保質(zhì)期更長的產(chǎn)品。其風(fēng)味成分不僅依托原料本身，更取決于微生物在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的MVOCs，通過對發(fā)酵食品MVOCs的監(jiān)控分析，可以對產(chǎn)品風(fēng)味品質(zhì)進(jìn)行評價、控制。

發(fā)酵海產(chǎn)品如魚露、蝦醬等是以新鮮魚、蝦、蟹、貝為原料，經(jīng)過鹽漬等過程發(fā)酵而成[49]，是我國沿海和東南亞地區(qū)傳統(tǒng)的發(fā)酵調(diào)味料。楊遠(yuǎn)帆等[29]優(yōu)化了魚露風(fēng)味物質(zhì)的GC-MS分析條件，以期利用風(fēng)味物質(zhì)的檢測結(jié)果制定產(chǎn)品質(zhì)量評價標(biāo)準(zhǔn)。Jiang Jinjin等[50]采用SDE裝置以乙醚為溶劑提取魚露，運(yùn)用GC-MS對提取物進(jìn)行分析比較，鑒別出70 種揮發(fā)性有機(jī)物，包含20 種酸、4 種羰基化合物、14 種含氮化合物、14 種烴類化合物、8 種酯和3 種含硫化合物，其中二甲基二硫、二甲基三硫、丙酸、丁酸、3-甲硫基丙醇、2-甲基丁烯醛和一些含氮化合物對魚露風(fēng)味起決定性作用。日本的味噌是用大豆、大米或是魚料發(fā)酵醇化得到的調(diào)味品，Giri等[28]使用頂空-SPME-GC-FID檢測魚味噌和大豆、大米味噌，鑒別出107 種揮發(fā)性化合物，其中所有味噌共有的有94 種。通過對檢測結(jié)果進(jìn)行PCA、層次聚類分析處理，確定了14 種低嗅覺閾值、高氣味活性的化合物（2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、甲硫基丙醛、乙酸異戊酯、二甲基二硫、二甲基三硫、2,3-丁二酮、3-甲基乙基丁酸、3-甲基-1-丁醇、己酸乙酯、1-辛烯-3-醇、庚醇、庚醛和2-十一烷酮）對味噌的風(fēng)味貢獻(xiàn)最大。

鲊海椒是我國西南地區(qū)的傳統(tǒng)發(fā)酵食品，是將新鮮紅辣椒碎摻入粳米面和鹽，密閉發(fā)酵而成。王巧碧等[51]用GC-MS法分析鲊海椒中的香氣組成，分別在發(fā)酵0、45、90 d時取樣。采用SDE和SPME兩種萃取方式進(jìn)行研究。SPME法檢出更多低沸點(diǎn)小分子化合物，而SDE得到沸點(diǎn)較高的化合物，總體SPME得到的物質(zhì)更多。在發(fā)酵45 d和90 d分別識別出MVOCs 154 種和162 種，其中包括醇類、醛類、酸類、酯類等。研究結(jié)合感官評價表明，采用SPME結(jié)合SDE法評價鲊海椒揮發(fā)性香氣組成更加全面客觀，鲊海椒合適的發(fā)酵時間為45～90 d。

發(fā)酵乳制品如酸奶，發(fā)酵溫度、pH值、不同發(fā)酵劑會對終產(chǎn)品的感官風(fēng)味造成很大的影響[52]。梁華正等[40]對發(fā)酵乳生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)采用動態(tài)頂空進(jìn)樣進(jìn)行大氣壓化學(xué)電離質(zhì)譜分析。以乙酸乙酯、苯甲醛、乳酸、2,3-丁二酮、正己醛、2-丙烯醛等為主要目標(biāo)物，對整個發(fā)酵過程進(jìn)行連續(xù)在線監(jiān)測，該方法可以反映風(fēng)味物質(zhì)的動態(tài)變化情況，對于研究微生物發(fā)酵機(jī)制和發(fā)酵產(chǎn)品的生產(chǎn)質(zhì)量控制有一定的理論和實際應(yīng)用價值。Benozzi等[31]研究了4 種不同來源的嗜熱鏈球菌和保加利亞乳酸桿菌發(fā)酵劑在相同條件下生產(chǎn)酸奶的過程：采用直接進(jìn)樣PTR-MS，并運(yùn)用PCA、方差分析對結(jié)果進(jìn)行處理。共檢測出300多個質(zhì)譜峰，其中13 個峰在4 種發(fā)酵劑之間存在顯著差異，并發(fā)現(xiàn)這些物質(zhì)中乙醛、丁酸、2-丁酮、二乙酰、甲硫醇、苯甲醛、3-羥基丁酮、庚酸和2-羥基-3-戊酮對酸奶風(fēng)味的形成起著關(guān)鍵性作用。研究結(jié)果表明，PTR-MS可以應(yīng)用于產(chǎn)品快速無損監(jiān)測、發(fā)酵食品的工藝設(shè)計以及對開發(fā)利用微生物資源產(chǎn)香進(jìn)行定性分析。

奶酪在發(fā)酵成熟的過程中，若摻雜少量的梭狀芽孢桿菌，會使奶酪發(fā)生“晚期脹包缺陷”（late blowing defect，LBD），表現(xiàn)為包裝袋脹包、奶酪出現(xiàn)不規(guī)則孔隙、裂縫或斷裂，伴隨著令人反感的哈喇味。Torres等[53]將羊奶樣品分別接種丁酸梭菌、丁酸芽孢梭菌、拜氏梭菌和生孢梭菌，把不接種的樣品作為對照。羊奶制成奶酪后經(jīng)60 d發(fā)酵成熟，進(jìn)行感官評價和理化檢測，用SPME-GC-MS對MVOCs進(jìn)行分析，定性鑒定出38 種MVOCs，其中21 種和是否感染梭狀桿菌呈明顯相關(guān)關(guān)系。但由于MVOCs的生成受奶酪種類、成熟度等諸多因素的影響，確定某一種MVOC作為發(fā)生LBD的特征指標(biāo)較為困難，因此，Torres等[53]采用PCA處理檢測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)丁酸梭菌是引起LBD最主要的細(xì)菌，并通過對MVOCs的PCA分析將受丁酸梭菌感染的奶酪成功與其他奶酪分開。拜氏梭菌和生孢梭菌使奶酪發(fā)生輕微的LBD現(xiàn)象，PCA分析可以區(qū)分其感染的奶酪與對照樣品以及丁酸芽孢桿菌感染的奶酪。對照樣品和丁酸芽孢桿菌感染的奶酪?guī)缀鯖]有出現(xiàn)LBD現(xiàn)象。

可可豆在采收以后發(fā)酵，成為巧克力生產(chǎn)的原料。巧克力的感官質(zhì)量除了受美拉德反應(yīng)的影響，很大程度上取決于發(fā)酵過程中微生物的代謝產(chǎn)物[21]。Batista等[25]將含有3 種酵母的發(fā)酵劑接種到可可豆中，對比自然發(fā)酵和加入發(fā)酵劑的2 種巧克力。實驗采用GC-MS法對可可豆和巧克力的MVOCs進(jìn)行分析，結(jié)合巧克力時間導(dǎo)向感官評價，揭示了可可豆2 種發(fā)酵過程中產(chǎn)生的MVOCs和巧克力風(fēng)味的內(nèi)在聯(lián)系：經(jīng)過接種的可可豆生產(chǎn)的巧克力更富有果味和可可味的特征；這是源于這種巧克力比自然發(fā)酵可可豆加工的巧克力含有更多的2-苯基-2-丁烯醛、5-甲基-2-苯基-2-己烯醛、壬醛、辛醛和2-十一烷酮。

面包是傳統(tǒng)古老的發(fā)酵食品，面團(tuán)的發(fā)酵過程決定了面包最終的質(zhì)地和風(fēng)味。家庭制作面包利用面團(tuán)自帶的良性菌株，包括酵母和乳酸菌等，而工業(yè)生產(chǎn)中，為達(dá)到產(chǎn)品批次間的穩(wěn)定性，確保質(zhì)量安全，需要采用經(jīng)過優(yōu)化篩選的發(fā)酵劑。Makhoul等[30]采用PTR-MS，比較4 種不同來源酵母制作面包的過程，對面團(tuán)發(fā)酵、烘焙過程中產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行分析，提供了一種可行的面包生產(chǎn)監(jiān)測以及發(fā)酵劑表征和選擇的方法。

以上對發(fā)酵食品MVOCs進(jìn)行分析檢測的研究大多采用GC-MS法，找到了影響發(fā)酵食品風(fēng)味的關(guān)鍵揮發(fā)性成分，為發(fā)酵食品風(fēng)味品質(zhì)評價、加工工藝設(shè)計、發(fā)酵劑選擇提供指導(dǎo)。然而GC-MS需要在真空條件下工作，通常儀器體積龐大，樣品需要進(jìn)行前處理，若要實現(xiàn)發(fā)酵食品的在線實時監(jiān)測，還有待于穩(wěn)定性高且便攜的常壓儀器設(shè)備的普及，以及諸如PRT-MS、IMS等現(xiàn)代分析技術(shù)的進(jìn)步發(fā)展。

2.3 菌種篩選以及開發(fā)微生物發(fā)酵產(chǎn)香新型添加劑

卷煙、食品使用的香精香料來源于天然產(chǎn)物提取和人工合成，也可通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)。MVOCs的檢測分析可以指導(dǎo)微生物菌種篩選，開發(fā)利用發(fā)酵產(chǎn)香添加劑。

煙葉醇化和卷煙加香時，添加產(chǎn)香微生物發(fā)酵液可以改變卷煙煙氣的香味和質(zhì)量。朱東來等[10]從煙葉、膨脹梗絲、成品煙絲中分離篩選出生長較快的產(chǎn)香真菌，在發(fā)酵液中加入淀粉酶、糖化酶和酶激活劑制成醇化液，噴灑至煙葉表面，經(jīng)過1 個月的醇化對煙葉進(jìn)行揮發(fā)性致香成分化學(xué)分析和評吸，并將發(fā)酵液經(jīng)SDE，用GC-MS進(jìn)行揮發(fā)性成分的定性分析。結(jié)果篩選出以產(chǎn)酮類和產(chǎn)醇類為主的菌株。通過添加醇化液，有效增加并豐富了煙葉的香氣。從植物內(nèi)生菌株中分離純化、篩選出產(chǎn)香菌種，制得的發(fā)酵液也可作為煙用添加劑。朱宇等[11]從新鮮西瓜取得內(nèi)生菌株，經(jīng)過分離純化得到3 株純系內(nèi)生菌株，通過對MVOCs的GC-MS分析以及卷煙加香評吸，最終篩選出1 株代謝產(chǎn)物香氣優(yōu)雅、甜潤、生長迅速的細(xì)菌，利用這株細(xì)菌進(jìn)行液體發(fā)酵得到的香料產(chǎn)品具有使煙香柔和、細(xì)膩、飽滿的作用。周麗娟等[12]對新鮮荔枝內(nèi)生菌進(jìn)行分離純化，利用GC-MS對篩選出的菌株發(fā)酵液進(jìn)行分析，找出其主要致香成分為β-苯乙醇、2,3-丁二醇、糠醛和十六酸，該發(fā)酵液制得的香料產(chǎn)品加入卷煙，使煙氣香氣柔和、細(xì)膩、飽滿。

香莢蘭作為“香料皇后”，其主要香味成分包括香蘭素、香草酸、丁香酚、愈創(chuàng)木酚等，在食品加香領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。李雪梅等[13]從香莢蘭植株不同部位分離出24 株菌，通過薄層色譜點(diǎn)板實驗發(fā)現(xiàn)有10 株菌的發(fā)酵液中存在香蘭素。進(jìn)一步選取香蘭素和4-乙烯基愈創(chuàng)木酚斑點(diǎn)明顯的菌株進(jìn)行研究，確定該內(nèi)生菌為芽孢桿菌，來自于香莢蘭氣生根。該芽孢桿菌菌液經(jīng)3 d的培養(yǎng)得到淡黃色混濁液體，具有濃郁而溫和的甜香和熏香香韻。對菌液進(jìn)行GC-MS分析，對照標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜圖，初步鑒定出占總檢出峰77.07%的10 種揮發(fā)性香味成分：香蘭素、香草酸、丁香酚、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚、4-丙基愈創(chuàng)木酚、4,4′-二聯(lián)愈創(chuàng)木酚、1-丁醇、3-羥基-2-丁酮、2-乙基-1-己醇。該類化合物是卷煙加香應(yīng)用中重要的調(diào)配原料，修飾卷煙煙香，賦予煙氣甜香、堅果香或辛香，使煙氣豐滿柔和。

植物內(nèi)生菌發(fā)酵液除了應(yīng)用于煙草制品，還為香料資源的開發(fā)提供了新的途徑。楊黎華等[14]從香料植物香茅草中分離得到31 株內(nèi)生菌，經(jīng)過液體發(fā)酵，篩選出1 株產(chǎn)香菌，并采用二氯甲烷SDE得到發(fā)酵液，進(jìn)行GC-MS定性分析，共鑒定出74 種揮發(fā)性成分，其中乙縮醛二乙醇、檸檬烯、月桂烯、月桂醛等是常用的香料物質(zhì)。劉蘇萌[16]、王麗娟[15,17]等研究了花椒、生姜、百合的內(nèi)生菌，分離篩選出產(chǎn)香菌株，采用GC-MS對發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行分析，鑒定其揮發(fā)性致香成分。

香精香料的選用是食品、卷煙配方管理的關(guān)鍵。目前這項工作主要依托于感官評價，雖然不能被任何儀器方法所取代，但檢測分析MVOCs可以為產(chǎn)香微生物開發(fā)與利用提供理論指導(dǎo)，為微生物所產(chǎn)香料的品質(zhì)穩(wěn)定性鑒定和評價提供依據(jù)。

3 結(jié) 語

研究MVOCs的最終目的是服務(wù)于人們的生產(chǎn)生活，對MVOCs進(jìn)行檢測分析為農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測、品質(zhì)控制評價、微生物菌種篩選及開發(fā)利用開辟了一條便捷有效的途徑。然而，由于MVOCs種類較多、成分復(fù)雜，受微生物生長條件變化影響大，目前許多研究還停留在實驗室階段。要將實驗室成果運(yùn)用到實際生產(chǎn)中，一方面需要結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法對MVOCs做進(jìn)一步的研究：例如完善不同菌株MVOCs指紋圖譜庫；深入研究同種微生物菌株、不同來源菌株之間MVOCs的差異；探究MVOCs的釋放信息與微生物生長的相關(guān)性；研究農(nóng)產(chǎn)品MVOCs的構(gòu)成以及相應(yīng)的微生物類群和代謝途徑的內(nèi)在聯(lián)系等；另一方面，目前MVOCs最常用的儀器檢測設(shè)備是GC-MS，方法雖較為成熟，但前處理復(fù)雜、步驟繁瑣、檢測成本高，使MVOCs用于農(nóng)產(chǎn)品檢驗的普及受到了一定的限制。不過由于PTR-MS、IMS等新技術(shù)新方法的不斷發(fā)展，樣品前處理得到簡化，農(nóng)產(chǎn)品無損在線檢測將成為未來的發(fā)展趨勢。相信隨著研究的深入和先進(jìn)儀器設(shè)備的普及，MVOCs的檢測分析技術(shù)將在農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量管理、新型微生物資源開發(fā)領(lǐng)域發(fā)揮更大的作用。

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