王加友, 趙彭年, 楊德玉, 龍驚驚, 周 悅, 王 遠(yuǎn)

沈陽化工研究院有限公司生物與醫(yī)藥研究所, 沈陽 110021

中國是農(nóng)業(yè)大國，也是秸稈資源最豐富的國家之一，據(jù)估計我國2015年農(nóng)作物秸稈總產(chǎn)量約為9.3億t，其中玉米秸稈年產(chǎn)量達(dá)到2.2億t以上[1]。農(nóng)作物秸稈是重要的生物質(zhì)資源，秸稈中的纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等多種物質(zhì)均可以為工農(nóng)業(yè)提供原料[2]。因此，農(nóng)作物秸稈的資源化利用受到了廣泛關(guān)注，主要包括秸稈還田、飼料化、肥料化、能源化等，而秸稈還田是其中最直接、最經(jīng)濟(jì)的選擇[3]。

秸稈還田的方式包括秸稈粉碎直接還田、覆蓋還田、過腹還田、留茬還田等。其中，秸稈粉碎直接還田即秸稈原位還田，具有快速方便、減輕勞動強(qiáng)度的優(yōu)勢，不僅可提高秸稈的綜合利用率，而且是提高土壤肥力、改善土壤理化性質(zhì)的有效技術(shù)手段[4]，是目前秸稈還田的主要方式，已被農(nóng)民廣泛應(yīng)用。然而，在玉米收獲的季節(jié)，我國北方玉米主產(chǎn)區(qū)溫度偏低，原位還田的玉米秸稈在自然環(huán)境條件下不能被微生物快速分解，無法為當(dāng)季作物提供肥源，秸稈原位還田腐解速度慢給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來了諸多不利影響，已成為秸稈還田推廣區(qū)域生產(chǎn)實踐中的主要障礙[5～7]。而配施適當(dāng)?shù)慕斩捊到饩鷦?，利用微生物技術(shù)處理秸稈，為秸稈還田提供了一條有效途徑[8]。秸稈分解過程中需要多種酶的參與，其中纖維素酶對促進(jìn)秸稈降解具有重要作用，但是，自然環(huán)境中秸稈纖維素分解菌較少，且其在土壤中所產(chǎn)纖維素酶的活性較低。因此，通過添加外源秸稈降解菌，以加快秸稈的原位腐解，是促進(jìn)秸稈原位降解的高效方法[9]。本研究旨在從秸稈還田土樣中篩選出高產(chǎn)纖維素酶且對秸稈分解能力強(qiáng)的菌株，以期為加快本地區(qū)秸稈還田與資源化利用提供有效菌劑。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1土樣采集 于遼寧、吉林、哈爾濱等地的玉米秸稈還田區(qū)域采集秸稈腐爛處土壤，裝入滅菌后的自封袋中，置于4℃保存。

1.1.2培養(yǎng)基配方 富集培養(yǎng)基[10]：NaNO30.5 g，KCl 0.5 g，KH2PO41.0 g，F(xiàn)e2(SO4)3·7H2O(先配成1%的母液，然后取1 mL)，MgSO4·7H2O 0.5 g，玉米秸稈粉(將玉米秸稈粉碎后過60目篩)10 g，加蒸餾水至1 000 mL；分離培養(yǎng)基配方參照李日強(qiáng)等[11]的研究；鑒別培養(yǎng)基配方參照穆春雷等[12]的研究；液體發(fā)酵培養(yǎng)基[11]：KH2PO42.0 g，(NH4)2SO41.4 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，CaCl20.3 g，尿素 0.3 g，蛋白胨 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.005 g，MnSO40.001 6 g，ZnCl20.001 7 g，CoCl20.002 g，玉米秸稈粉(將玉米秸稈粉碎后過60目篩)20 g，加蒸餾水至1 000 mL，pH 5.5～6.0；保藏培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基(配方對照沈萍等[13]的研究)。上述培養(yǎng)基配置好后均于121℃滅菌20 min。

1.1.3藥品及儀器 實驗所用分子生物學(xué)試劑均來自日本TaKaRa公司；化學(xué)試劑均為分析純。超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)，GZX-9030MBE型電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海博迅實業(yè)有限公司)，LDZX-50KBS型高壓滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠)，HH-2型水浴鍋(北京科偉永興儀器有限公司)，SW-CJ-2FD型恒溫?fù)u床(上海博迅實業(yè)有限公司)，SHP-150型生化培養(yǎng)箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)，PCR儀(美國Bio-Rad公司)，傅里葉變換紅外光譜儀(日本島津制作所)。

1.2 實驗方法

1.2.1秸稈纖維素制備 參考李日強(qiáng)等[11]的制備方法。

1.2.2產(chǎn)酶菌株初篩 稱取土樣10 g于盛有90 mL無菌水(含已滅菌玻璃珠)的500 mL三角瓶中，制成土壤懸濁液，并在搖床上以150 r/min振蕩1 h后靜置5 min，隨后取2 mL上清液于富集培養(yǎng)基中，20℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)3 d。將富集后的培養(yǎng)液梯度稀釋，取10-4、10-5、10-6稀釋菌液涂布于分離培養(yǎng)基平板，待菌落長出后，挑取菌落于平板劃線，20℃倒置培養(yǎng)，直至獲得單菌落。將純化后的菌株點接于鑒別培養(yǎng)基平板，置于20℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d后，對鑒別培養(yǎng)基平板用0.1%剛果紅染液染色10 min，再用1 mol/L NaCl溶液脫色15 min[14]，最后，根據(jù)菌落周圍形成的透明圈的大小，選取產(chǎn)酶能力較強(qiáng)的菌株。

1.2.3產(chǎn)酶菌株復(fù)篩 將初篩得到的高產(chǎn)酶菌株分別接種至液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，20℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)5 d后，取上清液測定羧甲基纖維素酶(carboxymethyl cellulase，CMCase)酶活、濾紙酶活(filter paper activity，F(xiàn)PA)。酶活測定方法參考QB 2583-2003[15]。酶活定義：在pH 4.8、50℃的條件下，1 mL酶液在1 h內(nèi)使底物產(chǎn)生1 mg葡萄糖所需的酶量定義為1個酶活單位(U/mL)。

1.2.4菌株種屬鑒定 ①形態(tài)鑒定：將菌株點接到PDA固體培養(yǎng)基上，于20℃培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)，并在顯微鏡下觀察菌絲體及孢子的形態(tài)。②分子生物學(xué)鑒定：提取菌株基因組DNA，以提取的DNA為模板，以ITS1(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAACG-3′)、ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGAT-ATGC-3′)為引物，PCR擴(kuò)增菌株的ITS序列。PCR反應(yīng)體系(50 μL)：DNA模板1 μL，dNTP(2.5 mmol/L)4 μL，引物(1 mmol/L)各1 μL，10×Loading Buffer 5 μL，Taq酶(5 U/μL)0.5 μL，ddH2O 37.5 μL。擴(kuò)增程序：94℃ 5 min；94℃ 30 s，52℃ 60 s，72℃ 2 min，共30個循環(huán)；72℃ 10 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物交至蘇州金唯智生物科技有限公司測序，將測序結(jié)果在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫BLAST中進(jìn)行序列對比。使用DNAMAN 6.0軟件對相近的真菌ITS區(qū)序列進(jìn)行比對分析，并用MEGA 6.0軟件制作進(jìn)化樹[16]。

1.2.5菌株所產(chǎn)酶酶學(xué)性質(zhì)研究 酶的最適反應(yīng)pH：將酶液稀釋一定倍數(shù)后，在50℃條件下，分別加入pH為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5的Na2HPO4-檸檬酸緩沖溶液體系中反應(yīng)60 min，測定不同pH體系中的FPA，以考察pH對酶活力的影響。酶的最適反應(yīng)溫度：將反應(yīng)溫度分別調(diào)節(jié)為5℃、10℃、15℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃，在最適反應(yīng)pH體系中反應(yīng)60 min，測定不同溫度下的FPA，以考察溫度對酶活力的影響。金屬離子對酶活力的影響：在最適反應(yīng)pH和溫度的條件下，向酶反應(yīng)體系中分別加入0.5 mL 0.01 mol/L的K+、Mg2+、Al3+、Fe2+、Cu2+、Zn2+、Mn2+、Co2+金屬離子，然后測定不同金屬離子加入后的FPA，以考察金屬離子對酶活力的影響。

1.2.6菌株降解玉米秸稈試驗 參考秸稈腐熟菌劑腐解評價技術(shù)規(guī)程(NY/T 2722-2015)[17]，將玉米秸稈剪成3 cm左右的秸稈段，分成20 g/份裝入孔徑為1.0 mm的尼龍袋中，實驗組加入稀釋10倍的菌液(培養(yǎng)過程參考1.2.3)浸泡秸稈，對照(CK)組不加菌劑，另外，每組加入1 g尿素以調(diào)節(jié)碳氮比。再將每3袋秸稈埋入1個口徑25 cm、高30 cm的盛土花盆中，置于15±1℃光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行秸稈腐解試驗，光照培養(yǎng)箱濕度維持在50%～70%。分別于10 d、20 d、30 d、40 d時取樣測定秸稈失重率，同時，每組分別取秸稈粉(將秸稈粉碎后過40目篩)1 g，按照王玉萬和徐文玉[18]的方法測定秸稈降解過程中纖維素成分的變化情況，以判定菌株對秸稈的降解趨勢及降解效果。

1.2.7傅里葉變換紅外光譜分析 采用傅里葉變換紅外光譜技術(shù)分析玉米秸稈經(jīng)菌株SY-403處理10 d、20 d、30 d和40 d的樣品。將秸稈樣品用無菌水清洗數(shù)次以除去秸稈表面大量菌體，再放入85℃恒溫干燥箱中烘干至質(zhì)量恒定。根據(jù)徐勇等[19]的方法，利用球磨儀將樣品研磨成粉末狀并過100目篩后，將樣品與溴化鉀(KBr)按體積比為1∶99的比例混合，再在瑪瑙研缽中研磨后壓片，并利用傅里葉變換紅外光譜儀進(jìn)行觀察，波數(shù)范圍為370～7 800 cm-1。每個樣品重復(fù)檢測3遍。

1.2.8數(shù)據(jù)分析 利用Microsoft Excel 2013軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和做圖，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)進(jìn)行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選

利用固體分離培養(yǎng)基從土樣中共分離出17株具有分解纖維素能力的菌株，再將篩選到菌株點接于鑒別培養(yǎng)基培養(yǎng)，經(jīng)0.1%剛果紅染色、1 mol/L NaCl溶液脫色后，有4個菌株形成的透明降解圈較大(圖1，彩圖見圖版三)。隨后，對這4個菌株進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)并測定其發(fā)酵上清液酶活(結(jié)果見表1)。其中，菌株SY-403發(fā)酵上清液的羧甲基纖維素酶酶活為38.67±0.11 U/mL，F(xiàn)PA為6.87±0.10 U/mL，其2種酶活力較其他3個菌株高，故以此菌株為研究對象開展后續(xù)試驗。

2.2 菌株SY-403分類鑒定

菌株SY-403在PDA培養(yǎng)基上生長迅速，初生菌絲為灰白色，培養(yǎng)3 d后菌落開始產(chǎn)綠色顆粒狀子囊果，菌落顏色逐漸變?yōu)樯罹G色(圖2A,彩圖見圖版三)。顯微鏡下觀察(圖2B)，菌絲為無隔菌絲，分生孢子梗呈掃帚狀，孢子近橢圓形。

圖1 4個菌株在鑒別培養(yǎng)基上形成的水解圈Fig.1 Hydrolysis cycle of 4 strains on indicator medium plate. (彩圖見圖版三)

菌株編號CMCase酶活(U/mL)FPA(U/mL)SY-40137．79±0．235．93±0．08SY-40235．36±0．185．62±0．12SY-40338．67±0．116．87±0．10SY-40436．51±0．165．96±0．06

圖2 菌株SY-403菌落形態(tài)特征Fig.2 Colony morphological characteristics of strain SY-403. A：肉眼觀察；B：顯微鏡下觀察。 (彩圖見圖版三)

僅通過對菌落的形態(tài)觀察尚不能確定菌株的具體種屬，還需通過分子生物學(xué)方法進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。提取菌株SY-403的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測序，測得其ITS序列長度為531 bp，于NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對后發(fā)現(xiàn)，ITS序列與SY-403相似性最高的菌株屬于藍(lán)狀菌屬(Talaromyces)，其中，菌株SY-403與TalaromycesstolliiCBS 408.93(登錄號NR111781.1)標(biāo)準(zhǔn)菌株相似性達(dá)到100%。再對相似性菌株采用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖3所示，菌株SY-403與TalaromycesstolliiCBS 408.93的遺傳距離最近。因此，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征與分子生物學(xué)鑒定結(jié)果可知，菌株SY-403為Talaromycesstollii，命名為TalaromycesstolliiSY-403。

2.3 菌株SY-403所產(chǎn)纖維素酶酶學(xué)性質(zhì)研究

2.3.1酶的最適反應(yīng)pH 在50℃條件下，分別在pH為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5的Na2HPO4-檸檬酸緩沖溶液體系中，測定該纖維素酶活力。由圖4可知，該纖維素酶的最適反應(yīng)pH為6.0。在pH 4.0～6.0之間，纖維素酶活力逐漸升高；在pH 6.0～8.5之間，纖維素酶活力有小幅降低。

圖3 基于ITS序列同源性構(gòu)建的菌株SY-403系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain SY-403 based on ITS rDNA sequences homology.

圖4 pH對纖維素酶活力的影響Fig.4 Effects of pH on the cellulase activity.

2.3.2酶的最適反應(yīng)溫度 在pH 6.0體系中，分別在5℃、10℃、15℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃溫度下，測定該纖維素酶活力。由圖5可知，該酶的最適反應(yīng)溫度為20℃；其對溫度的適應(yīng)性較強(qiáng)，在10～50℃之間，酶活力都維持在較高的水平；在5～10℃之間，仍然具有77.39%以上的酶活力；當(dāng)溫度高于50℃時，纖維素酶活力迅速下降。

圖5 溫度對纖維素酶活力的影響Fig.5 Effects of temperature on the cellulase activity.

2.3.3金屬離子對酶活力的影響 在pH 6.0、20℃的條件下，向測定纖維素酶活力的體系中分別加入0.5 mL 0.01 mol/L的K+、Mg2+、Al3+、Fe2+、Cu2+、Zn2+、Mn2+、Co2+金屬離子溶液。由圖6可知，K+、Mg2+、Fe2+對酶活力具有促進(jìn)作用，其中K+的促進(jìn)作用最為明顯；Cu2+、Mn2+對酶活力具有抑制作用；其他金屬離子對酶活力的影響不大。

2.4 菌株SY-403降解玉米秸稈試驗

秸稈降解過程中，于10 d、20 d、30 d、40 d取各組秸稈并用自來水清洗干凈后，置于85℃烘箱中烘干至恒重，用減重法測定秸稈失重率(圖7)。

圖6 金屬離子對纖維素酶活的影響Fig.6 Effects of metal irons on the cellulase activity.

圖7 玉米秸稈失重率的變化Fig.7 Weight loss rate of corn stalk.注：**表示同組數(shù)據(jù)與CK組相比差異極顯著(P<0.01)。

對同一取樣時間段的數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，P值均小于0.01，這表明菌株SY-403處理組與CK組秸稈失重率的差異為極顯著。如圖7所示，兩組的秸稈失重率均隨時間的延長而逐漸增加，且兩組秸稈失重率間的差距逐漸增大，這說明，實驗后期SY-403處理組的玉米秸稈降解速度快于CK組；40 d時，菌株SY-403處理組秸稈失重率為42.67%，CK組秸稈失重率為30.59%，增幅為39.49%。

每組取秸稈粉1 g，用于測定秸稈中的纖維素含量，并計算纖維素分解率(圖8)。對同一取樣時間段的數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，P值均小于0.01，這表明菌株SY-403處理組與CK組纖維素分解率的差異為極顯著。如圖8所示，兩組的纖維素分解率隨時間的延長而逐漸增加，與秸稈失重率的變化趨勢一致；40 d時，菌株SY-403處理組纖維素分解率達(dá)到55.26%，高于CK組的31.42%。綜合玉米秸稈失重率和纖維素分解率的測定結(jié)果，表明菌株SY-403對玉米秸稈具有良好的降解功能。

圖8 玉米秸稈纖維素分解率Fig.8 Decomposition rate of corn stalk cellulose.注：**表示同組數(shù)據(jù)與CK組相比差異極顯著(P<0.01)。

2.5 傅里葉變換紅外光譜分析

在秸稈降解過程中取樣，對秸稈降解過程中官能團(tuán)的變化進(jìn)行FTIR表征，結(jié)果如圖9所示。經(jīng)傅里葉變換紅外光譜分析，與初始秸稈相比，經(jīng)菌株SY-403處理10 d、20 d、30 d、40 d的秸稈樣品，吸收峰數(shù)量增加，說明秸稈結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。1 052～1 054 cm-1處吸收峰強(qiáng)度減弱，表明纖維素及糖類物質(zhì)被分解利用；1 328～1 330 cm-1處吸收峰強(qiáng)度增強(qiáng)，表明碳水化合物中羥基增多。而碳水化合物中羥基的變形振動增強(qiáng)，說明纖維素、半纖維素等聚合糖分解為短鏈結(jié)構(gòu)。1 514～1 515cm-1處吸收峰強(qiáng)度增強(qiáng)，表明木質(zhì)素被分解為含有苯環(huán)的化合物(如酚類等)。綜上所述，菌株SY-403可以分解利用玉米秸稈中纖維素、木質(zhì)素等物質(zhì)，即其對玉米秸稈具有降解作用。

圖9 玉米秸稈降解過程中樣品的傅里葉變換紅外光譜分析Fig.9 The Fourier transform infrared spectroscopy analysis results of samples during the corn straw biodegradation process. A：初始秸稈；B：降解10 d的秸稈；C：降解20 d的秸稈；D：降解30 d的秸稈；E：降解40 d的秸稈。

3 討論

農(nóng)作物秸稈是自然界中最豐富的可再生資源，如何有效利用秸稈纖維素是普遍關(guān)注的研究熱點，因而，纖維素分解菌的研究受到了廣泛關(guān)注[20]。本研究從秸稈還田區(qū)域中取土樣，富集培養(yǎng)后，經(jīng)篩選獲得1株高產(chǎn)纖維素酶的菌株SY-403。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征與分子生物學(xué)鑒定結(jié)果可知，菌株SY-403為藍(lán)狀菌Talaromycesstollii，命名為TalaromycesstolliiSY-403。并對其所產(chǎn)纖維素酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步研究，該酶最適反應(yīng)pH為6.0，最適反應(yīng)溫度為20℃，K+、Mg2+、Fe2+對其酶活力具有促進(jìn)作用，Cu2+、Mn2+對其酶活力具有抑制作用。在模擬室外低溫環(huán)境(15℃)中以菌株SY-403降解玉米秸稈，菌株SY-403處理組的秸稈失重率與纖維素分解率與CK組相比，增幅分別為39.49%、75.88%，結(jié)合傅里葉變換紅外光譜分析結(jié)果，表明菌株SY-403對玉米秸稈具有較強(qiáng)的分解利用能力。

國內(nèi)有藍(lán)狀菌屬黃藍(lán)狀菌(Talaromycesflavus)產(chǎn)幾丁質(zhì)酶[21]、植酸酶[22]，以及圓形藍(lán)狀菌(Talaromycesrotundus)產(chǎn)幾丁質(zhì)酶[23]的研究報道，而對藍(lán)狀菌Talaromycesstollii產(chǎn)纖維素酶的報道較少；國外已報道的研究中，Orencio-Trejo等[24]使用TalaromycesstolliiLV186發(fā)酵玉米和高粱的秸稈產(chǎn)生了纖維素酶和木聚糖酶，測定該菌株所產(chǎn)羧甲基纖維素酶酶活為12.47 U/mL，低于本研究中篩選到的菌株SY-403所產(chǎn)纖維素酶酶活，說明菌株TalaromycesstolliiSY-403具有作為產(chǎn)纖維素酶功能菌株的開發(fā)潛力。后續(xù)還需對菌株培養(yǎng)基進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，考慮碳氮源、pH、轉(zhuǎn)速等因素對酶活力的影響，以提高其產(chǎn)酶能力。秸稈降解試驗?zāi)M室外秸稈腐熟劑的應(yīng)用環(huán)境，TalaromycesstolliiSY-403對玉米秸稈降解20 d，秸稈失重率為21.68%，高于青格爾等[25]研究中使用的復(fù)合菌系GF-20(處理20 d時，玉米秸稈失重率為20%)；降解30 d，秸稈失重率為36.43%，高于王垚等[26]研究中使用的2株戴氏霉液體發(fā)酵秸稈的失重率(戴氏霉H104.1和戴氏霉HC48.1液體發(fā)酵秸稈30 d，失重率分別為28.3%和27.4%)。上述對比結(jié)果說明本研究中篩選到的菌株TalaromycesstolliiSY-403對玉米秸稈降解的應(yīng)用前景值得進(jìn)一步探究。

本研究中篩選到的菌株SY-403可以作為有效降解玉米秸稈還田中纖維素的菌種資源，其在低溫條件下(15℃)對秸稈的降解效果，為以后菌劑的實用性與適應(yīng)性提供了參考數(shù)據(jù)。由于秸稈組成成分復(fù)雜，木質(zhì)素、半纖維素等物質(zhì)的分解需要其他菌群的參與，后續(xù)研究中應(yīng)以菌株SY-403為基礎(chǔ)，開展木質(zhì)素、半纖維素分解菌群的篩選，以及功能菌之間相互作用的研究，開發(fā)具有作物針對性與地域適應(yīng)性的秸稈腐熟菌劑。

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